阿里紅活性部位提取物體外抑制奶牛乳房炎致病菌研究

阿得力江·吾斯曼，努爾艾力·麥提尼亞孜，布合麗倩穆·依明，阿依姑麗·買買提明，德力拜爾，賽福丁·阿不拉

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

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阿里紅活性部位提取物體外抑制奶牛乳房炎致病菌研究

阿得力江·吾斯曼，努爾艾力·麥提尼亞孜，布合麗倩穆·依明，阿依姑麗·買買提明，德力拜爾，賽福丁·阿不拉*

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

為研究阿里紅各活性部位對(duì)奶牛乳房炎致病菌的抑菌活性。提取阿里紅多糖、多酚、黃酮、生物堿及揮發(fā)油，并對(duì)各有效部位成分進(jìn)行了含量測(cè)定。通過體外抑菌試驗(yàn)，檢測(cè)各有效部位對(duì)奶牛乳房炎常見致病菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)及鏈球菌 (Streptococcus)的抑菌作用。結(jié)果表明，阿里紅黃酮和生物堿對(duì)3種致病菌均具有一定的抑菌作用，且對(duì)金黃色葡萄球菌和鏈球菌的抑菌作用最強(qiáng)，可以作為抗金黃色葡萄球菌和鏈球菌進(jìn)一步研究的材料。

阿里紅；活性部位；奶牛乳房炎；抑菌試驗(yàn)

奶牛乳房炎給我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，我國(guó)平均每年因乳房炎造成的經(jīng)濟(jì)損失為150億～450億元[1]。目前，導(dǎo)致奶牛乳房炎的病原微生物以金黃色葡萄球菌(Staphyloco-ccusaureus)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)及鏈球菌 (Streptococcus)為主[2]。研究表明，天然藥物具有較好的抑制奶牛乳房炎致病菌的作用。張傳美等[3]檢測(cè)9味中藥體外抗奶牛乳房炎病原菌活性，黃芩、黃連、紅花、魚腥草水提物對(duì)葡萄球菌的抑菌作用明顯，其中黃芩、魚腥草、蒲公英和黃連對(duì)大腸埃希菌有明顯的抑菌作用。楊玉艾等[4]通過體外試驗(yàn)，證明黃芪多糖對(duì)奶牛乳房炎的主要致病菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、鏈球菌具有廣泛的抑菌作用。

阿里紅Fomesofficinalis(Vill.ex Fr.)Ames為多孔菌科大型真菌藥用層孔菌的干燥子實(shí)體，有“落葉松茸”之稱。維吾爾醫(yī)學(xué)中記載阿里紅有燥濕退熱，祛寒止痛，解退藥毒，活血消腫等多種功效。馮薇等對(duì)阿里紅生藥進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)含多糖、三萜酸類、倍半萜類等32種化合物[5]。叢媛媛等[6]報(bào)道，阿里紅多糖喂食荷瘤小鼠能顯著增加小鼠抗體分泌細(xì)胞的數(shù)量，并能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能及血清溶菌酶的含量，提高小鼠的非特異性免疫功能。為了考察阿里紅各活性部位體外抑制奶牛乳房炎致病菌的效果，本試驗(yàn)通過平板法和試管法，研究了阿里紅各有效提取部位對(duì)奶牛乳房炎致病菌的體外抑菌效果，旨在篩選出阿里紅抑菌效果較好的活性部位。

1　材料與方法

1.1材料

阿里紅，購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)民族醫(yī)院；菌株(奶牛乳房炎的主要致病菌：金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、鏈球菌)由新疆畜牧科學(xué)院提供；其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1多糖提取物的制備阿里紅粉碎過60目篩，950 mL/L乙醇回流脫脂，脫脂后的阿里紅水煮取上清液，收集上清液減壓濃縮，通過Savage法除蛋白，加無水乙醇至800 mL/L，收集沉淀所得多糖。用苯酚硫酸法測(cè)定阿里紅多糖含量[7]。用無菌水配置成25.0、12.5、6.25 mg/mL的水溶液備用。

1.2.2多酚提取物的制備阿里紅粉碎過60目篩，500 mL/L乙醇、料液比1∶18、時(shí)間為30 min、溫度為70 ℃條件下超聲波浸潤(rùn)提取5次，收集提取液減壓濃縮，乙酸乙酯萃取，干燥萃取物。用Folin-Ciocalteu法進(jìn)行含量測(cè)定[8]。用無菌水配置成25.0、12.5、6.25 mg/mL的水溶液備用。

1.2.3黃酮提取物的制備阿里紅粉碎過60目篩，700 mL/L乙醇，料液比1∶20，溫度為60 ℃條件下浸潤(rùn)提取5次，收集提取液減壓濃縮，正己烷萃取，干燥萃取物。亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法進(jìn)行含量測(cè)定[9]。用二甲基亞砜配置成25.0、12.5、6.25 mg/mL的溶液備用。

1.2.4生物堿提取物的制備阿里紅粉碎過60目篩，20 mL/L硫酸，料液比1∶0，溫度為60 ℃條件下浸潤(rùn)提取5次，收集提取液Na2CO3調(diào)節(jié)pH，減壓濃縮，乙酸乙酯萃取，干燥萃取物。碘化鉍鉀顯色法進(jìn)行含量測(cè)定[7]。用二甲基亞砜配置成25.0、12.5、6.25 mg/mL的溶液備用。

1.2.5揮發(fā)油提取物的制備采用CO2超臨界萃取儀，于25 MPa、50 ℃、20 L/h流速下，萃取1 h，得黃色油狀物，干燥提取物。香草醛硫酸顯色法進(jìn)行含量測(cè)定[7]。用20 mL/L的吐溫-80配置成25.0、12.5、6.25 mg/mL的溶液備用。

1.2.6平板打孔法測(cè)定抑菌效果每板分別加入50 μL供試菌，同滅菌處理過的培養(yǎng)基一起倒板，搖勻。用直徑為7 mm的打孔器均勻打孔。將各有效部位加入孔中，每個(gè)濃度重復(fù)3次，以無菌水、20 mL/L吐溫-80及二甲基亞砜為空白對(duì)照組，以慶大霉素、環(huán)丙沙星為陽性對(duì)照組。恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃條件下，培養(yǎng)18 h后測(cè)量抑菌圈直徑大小。

1.2.7最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定通過打孔法篩選出抑菌作用較強(qiáng)的有效部位，進(jìn)行MIC的測(cè)定。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和鏈球菌分別置于10只試管中，第11只試管不含藥物為菌液對(duì)照，第12只試管不含菌液和藥液為培養(yǎng)基對(duì)照組，每支試管加1 mL培養(yǎng)基，藥物以100 mg/mL為起始濃度倍比稀釋10個(gè)濃度，后每管加20 μL菌液。恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)18 h～24 h，觀察無渾濁變化的最高藥物稀釋濃度作為最低抑菌濃度。

1.2.8最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定從最低抑菌濃度試驗(yàn)，未見細(xì)菌生長(zhǎng)的透明試管中分別取培養(yǎng)物20 μL,接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)18 h～24 h，平板中菌落數(shù)小于3個(gè)即判定為無細(xì)菌生長(zhǎng)，以無細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最高稀釋濃度作為最低殺菌濃度。

2　結(jié)果

2.1阿里紅提取物的含量測(cè)定

提取到阿里紅多糖、多酚、黃酮、生物堿及揮發(fā)油，根據(jù)回歸方程計(jì)算得各有效部位含量分別為阿里紅多糖61.8%、阿里紅多酚25.7%、阿里紅黃酮26.2%、阿里紅生物堿25.4%及阿里紅揮發(fā)油60.4%。

2.2阿里紅有效部位的抑制效果

檢測(cè)阿里紅不同提取部位對(duì)奶牛乳房炎致病菌的抑菌活性，如表1所示，阿里紅多酚對(duì)金黃色葡萄球菌和鏈球菌有一定的抑菌作用，阿里紅黃酮和生物堿對(duì)3種致病菌均顯現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑菌作用，阿里紅揮發(fā)油對(duì)鏈球菌有一定的抑菌作用。隨著藥物濃度的增加，抑菌圈直徑有不同程度的增加。揮發(fā)油除外，各有效部位對(duì)3種致病菌的抑菌強(qiáng)弱大小為金黃色葡萄球菌>鏈球菌>大腸埃希菌。

表1　阿里紅有效提取部位的抑菌結(jié)果

續(xù)表1

有效部位Activeingredient濃度/(mg·mL-1)Concent抑菌圈直徑/mmAntibacterialcirclediameter金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus大腸埃希菌Escherichiacoli鏈球菌Streptococcus25.0--11.93±0.45g揮發(fā)油Volatileoil12.5--9.53±0.45i6.25---環(huán)丙沙星Ciprofloxacin25.53±0.60a25.57±0.86a19.50±0.30b無菌水Sterilewater---吐溫80Tween80---二甲基亞砜Dimethylsulfoxide---

注：角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：The same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

2.3阿里紅有效部位的MIC試驗(yàn)

阿里紅多酚對(duì)3種菌的MIC分別為3.13、6.25、3.13 mg/mL，說明對(duì)3種細(xì)菌均具有一定的抑菌作用。阿里紅黃酮和生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、鏈球菌的MIC均為0.78、1.56、0.78 mg/mL，說明阿里紅黃酮和生物堿對(duì)3種細(xì)菌有較強(qiáng)的抑菌作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)。揮發(fā)油對(duì)鏈球菌的MIC為12.5 mg/mL，對(duì)鏈球菌未表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌作用。

表2　4種有效提取部位的MIC測(cè)定

2.4阿里紅有效提取部位的MBC試驗(yàn)

阿里紅多酚對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、鏈球菌的MBC分別為6.25、12.5、6.25 mg/mL，說明對(duì)3種細(xì)菌均具有一定的殺菌作用。阿里紅黃酮對(duì)3種菌的MBC為0.78、1.56、1.56 mg/mL，生物堿對(duì)3種菌的MBC為0.78、3.13、1.56 mg/mL，說明這2種成分對(duì)3種細(xì)菌均具有較強(qiáng)的的殺菌作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌作用尤為明顯。揮發(fā)油對(duì)鏈球菌的MBC為12.5 mg/mL，對(duì)鏈球菌未表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺菌作用。

表3　4種有效提取部位的MBC測(cè)定

3　討論

為篩選出阿里紅有效部位中對(duì)奶牛乳房炎常見致病菌的抑菌活性最強(qiáng)成分，提取阿里紅各有效部位，并檢測(cè)其體外抑制奶牛乳房炎致病菌的抑菌作用。天然藥物有效部位對(duì)奶牛乳房炎致病菌具有較好的抑菌作用，張代玉等[10]提取苦參生物堿，研究其抗奶牛乳房炎致病菌的活性，結(jié)果表明，苦參生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和無乳鏈球菌均有良好的抑菌和殺菌效果。Ananda B S等[11]研究植物源抗菌劑，桂皮醛、丁香油酚、香芹酚、麝香草酚對(duì)奶牛乳房炎常見致病菌，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及鏈球菌的抑菌作用，4種多酚對(duì)上述細(xì)菌均有抑菌作用，其中桂皮醛抑菌作用最佳，且抑菌持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。Meignanalakshmi S等[12]提取鴨嘴花葉水提物及甲醇提取物，作用于奶牛乳房炎致病菌，其中甲醇提取物抗菌作用明顯。甲醇提取物濃度為200 mg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌的抑菌圈大小分別為21.7 mm±0.58 mm，18.3 mm±0.58 mm和28.3 mm±0.58 mm。

本次試驗(yàn)通過提取阿里紅各有效部位，體外試驗(yàn)檢測(cè)其抗奶牛乳房炎致病菌的抑菌活性，從中篩選出了具有顯著抑菌作用的有效部位。打孔法檢測(cè)阿里紅不同有效部位的抑菌作用，且與獸醫(yī)臨床治療奶牛乳房炎常用藥物環(huán)丙沙星進(jìn)行比較。結(jié)果表明，阿里紅多酚對(duì)金黃色葡萄球菌和鏈球菌有一定的抑菌和殺菌作用，而揮發(fā)油只對(duì)鏈球菌表現(xiàn)出了抑菌作用。阿里紅黃酮和生物堿對(duì)3種致病菌均具有一定的抑菌和殺菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌和鏈球菌的抑菌和殺菌作用強(qiáng)于對(duì)大腸埃希菌的抑菌作用。與環(huán)丙沙星相比，25.0 mg/mL濃度時(shí)的黃酮對(duì)鏈球菌的抑菌作用顯著高于環(huán)丙沙星，25.0 mg/mL濃度時(shí)的生物堿抑菌作用與環(huán)丙沙星無顯著差異。濃度為25.0 mg/mL時(shí)的黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌的的抑菌作用與環(huán)丙沙星的抑菌作用相接近。而各有效部位對(duì)大腸埃希菌的抑菌作用均低于環(huán)丙沙星的抑菌作用。綜上所述，阿里紅黃酮和生物堿對(duì)奶牛乳房炎致病菌的抑制作用最強(qiáng)，可作為抗金黃色葡萄球菌和鏈球菌進(jìn)一步研究的材料。

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Inhibition Effects of Active parts of Fomes officinalis on Pathogenic Bacteria of Cow MastitisinVitro

ADELIJIANG Wusiman， NUERAILI Maitiniyazi， BUHELIQIANMU Yiming，AYIGULI Maimaitiming DELIBAIER， SAIFUDING Abula

(College of Veterinary Medicine， Xinjiang Agricultural University， Xinjiang，Urumqi，830052， China)

In order to research on different active components fromFomesofficinalisagainst pathogenic bacteria of cow mastitisinvitro,total polysaccharides,polyphenols,flavonoids,alkaloids and volatile oil were extracted and their contents were measured.According to the main pathogens of cow mastitis (Staphylococcusaureus,EscherichiacoliandStreptococcus),we determined the inhibition effects of active components ofFomesofficinalisinvitro.The results indicated that flavonoids and alkaloids ofFomesofficinalishad obvious effects on the all kinds of pathogens of cow mastitis.Flavonoids and alkaloids possessed better activity toStaphylococcusaureusandStreptococcusin three pathogens and would be as the materials for further research.

Fomesofficinalis；active part；cow mastitis；bacteriostatic test

2016-04-07

新疆維吾爾自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(XJGRI2015097)

阿得力江·吾斯曼(1990-)，男(維吾爾族)，新疆伊寧人，主要從事中藥藥理學(xué)研究。*通訊作者

S853.73

A

1007-5038(2016)09-0063-04