廣州地區(qū)兒童空腸彎曲菌感染的檢測(cè)與分析

謝永強(qiáng)，鐘華敏，虢　艷，關(guān)小珊，龐舒尹

(廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心檢驗(yàn)科　510120)

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·臨床研究·

廣州地區(qū)兒童空腸彎曲菌感染的檢測(cè)與分析

謝永強(qiáng)，鐘華敏，虢艷，關(guān)小珊，龐舒尹

(廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心檢驗(yàn)科510120)

目的掌握廣州地區(qū)空腸彎曲菌引起兒童感染性腹瀉的現(xiàn)狀，探索空腸彎曲菌的檢測(cè)方法及耐藥狀況。方法對(duì)2011～2014年該院可疑空腸彎曲菌感染患兒的糞便進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)和常規(guī)生化鑒定，然后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測(cè)序確認(rèn)，同時(shí)對(duì)所分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果近4年來(lái)從2 088例腹瀉患兒糞便標(biāo)本中共檢出154株空腸彎曲菌，經(jīng)生化反應(yīng)鑒定和PCR檢測(cè)確認(rèn)，PCR檢測(cè)限可達(dá)6 CFU/mL；該地區(qū)兒童感染空腸彎曲菌對(duì)亞胺培南和氨基糖苷類藥物敏感，對(duì)氯霉素、林可霉素和紅霉素等抗菌藥物耐藥率<10%,對(duì)氟喹諾酮、氨芐西林和四環(huán)素有較高耐藥率(24.03%～44.16%)，對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑和頭孢菌素耐藥。結(jié)論空腸彎曲菌是兒童腹瀉的重要病原菌之一，重癥患者可導(dǎo)致嚴(yán)重后果，應(yīng)引起重視，積極開(kāi)展對(duì)疑似患者的空腸彎曲菌檢測(cè)；常規(guī)檢測(cè)和特異性的PCR檢測(cè)有利于提高檢出率。

兒童；空腸彎曲菌；感染；抗菌藥物

空腸彎曲菌廣泛寄生于溫血?jiǎng)游锏哪c道，是當(dāng)今全球范圍內(nèi)廣受重視的人畜共患病原菌之一，可引起動(dòng)物腹瀉、流產(chǎn)，可導(dǎo)致人類急性胃腸炎、格林巴利綜合征、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、Reiter′s綜合征等多種疾病。自上個(gè)世紀(jì)末以來(lái)，空腸彎曲菌逐漸上升成食源性感染的主要因素之一，但由于其培養(yǎng)生長(zhǎng)條件苛刻、培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)、對(duì)檢測(cè)人員的經(jīng)驗(yàn)水平要求較高，普通醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室并未普遍開(kāi)展空腸彎曲菌的培養(yǎng)檢測(cè)[1]。為掌握廣州地區(qū)兒童感染空腸彎曲菌的現(xiàn)狀，給臨床防治感染提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，本研究對(duì)本院2010～2014年收治的腹瀉患兒糞便進(jìn)行空腸彎曲菌的檢測(cè)分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料2010～2014年本院收治的腹瀉患兒糞便標(biāo)本2 088例。

1.2儀器與試劑Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基(杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品)，改良木炭-頭孢哌酮-去氧膽酸鹽瓊脂(CCDA)培養(yǎng)基，改良Campy-BAP彎曲菌培養(yǎng)基及藥敏紙片(均為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品)，微需氧袋和API Campy生化鑒定試劑條(法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品)。

1.3標(biāo)本采集將無(wú)菌棉簽用生理鹽水濕潤(rùn)后，蘸取患兒糞便的黏液或膿血部分,置于Carry-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中室溫保存送檢。

1.4病原菌分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室收到待檢糞便標(biāo)本后立即接種于改良CCDA培養(yǎng)基,置微需氧條件(氧氣5%、二氧化碳10%、氮?dú)?5%)42 ℃培養(yǎng)48 h,挑取灰色或紫紅色、有光澤、并從接種線向外有擴(kuò)散傾向的菌落或邊緣完整、微凸、發(fā)亮的水滴樣可疑菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢,若染色為革蘭陰性,呈S形、螺旋狀或紡錘形則初步認(rèn)為符合空腸彎曲菌特征，再接種到改良CCDA培養(yǎng)基或哥倫比亞血瓊脂進(jìn)行純培養(yǎng),繼續(xù)42 ℃微需氧培養(yǎng)24～48 h。

1.5病原菌鑒定

1.5.1病原菌的常規(guī)生化鑒定將疑似空腸彎曲菌的純培養(yǎng)物進(jìn)行氧化酶、過(guò)氧化氫酶(觸酶)、馬尿酸鹽利用和硝酸鹽還原試驗(yàn),如為陽(yáng)性可初步鑒定為彎曲菌。將初步鑒定為彎曲菌的純培養(yǎng)物制成6麥?zhǔn)蠁挝坏木?按要求接種到API Campy生化鑒定試劑條上,孵育24 h后按操作說(shuō)明判讀結(jié)果。

1.5.2聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)鑒定(1)模板提取。用滅菌雙蒸水制備待檢菌懸液(0.5麥?zhǔn)蠁挝?，置于沸水中加熱10 min，然后12 000 r/min 離心15 min，取上清液分裝于Eppendorf管作為擴(kuò)增反應(yīng)的DNA模板。(2)PCR引物。查閱相關(guān)網(wǎng)站關(guān)于空腸彎曲菌的VSI基因序列保守片段，用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，F(xiàn)：5′-TACGATTTGTTTCATTG-3′；R：5′-ATTTCTTTAGCAGGCATA-3′。(3)反應(yīng)體系。包括PCR Buffer 2.5 μL、Taq酶1.25 μL、200 μmol/L dNTP 2.5 μL、引物各10 μmol/L、模板2.5 μL。(4)PCR循環(huán)參數(shù)。95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 1 min→55 ℃退火1 min→72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后延伸10 min。(5)PCR產(chǎn)物分析。取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，然后分析其遷移率，與質(zhì)控菌株ATCC29482進(jìn)行比對(duì)。(6)PCR檢測(cè)的敏感性分析。將0.5麥?zhǔn)蠁挝籔CR分析用菌液作1∶10的依次稀釋進(jìn)行上述PCR檢測(cè)，直至不能檢測(cè)出來(lái)。

1.6病原菌藥敏試驗(yàn)采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦使用的瓊脂紙片擴(kuò)散(Kirby-Bauer)法。將被檢菌制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，均勻涂抹在厚度? mm的Campy-BAP培養(yǎng)基上，42 ℃平衡10～15 min，貼抗菌藥物紙片，置微需氧袋42 ℃孵育48 h后按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果，抑菌環(huán)的邊緣以肉眼觀察不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限。

2　結(jié)　　果

2.1病原菌檢出率對(duì)本院2011～2014年收治的感染性腹瀉患兒2 088例糞便標(biāo)本進(jìn)行空腸彎曲菌的分離培養(yǎng)，經(jīng)API Campy生化鑒定系統(tǒng)分析，共檢出空腸彎曲菌154株，檢出率為7.38%。其年齡構(gòu)成見(jiàn)表1。

表1　　廣州地區(qū)兒童空腸彎曲菌感染情況

2.2PCR鑒定結(jié)果對(duì)分離到的154株菌株進(jìn)行PCR鑒定，對(duì)特異性擴(kuò)增片段進(jìn)行遷移率計(jì)算，大小為516 bp，與質(zhì)控菌株一致，同源性達(dá)99.5%。

2.3PCR方法的敏感性10-5倍菌液還能擴(kuò)增出特異性片段，而10-6倍菌液則不能擴(kuò)增特異性片段，菌液平板記數(shù)得出10-5倍菌液含菌體6 CFU/mL，故該P(yáng)CR方法的檢測(cè)敏感度為6 CFU/mL。

表2　　154株空腸彎曲菌對(duì)常用抗菌藥物的藥敏結(jié)果[n(%)]

續(xù)表2　　154株空腸彎曲菌對(duì)常用抗菌藥物的藥敏結(jié)果[n(%)]

2.4藥敏試驗(yàn)結(jié)果154株空腸彎曲菌對(duì)抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)表明,空腸彎曲菌對(duì)碳青霉烯類、氨基糖苷類和酶抑制劑敏感，對(duì)氯霉素、林可霉素和紅霉素等抗菌藥物耐藥率<10%,對(duì)氨芐西林、喹諾酮類和四環(huán)素有較強(qiáng)耐藥性(耐藥率為24.03%～44.16%)，對(duì)磺胺類和頭孢菌素耐藥，見(jiàn)表2。

3　討　　論

空腸彎曲菌是引起兒童散發(fā)性感染性腹瀉的常見(jiàn)病原之一，常有水樣便，一日可達(dá)10～20次，時(shí)間遷延可轉(zhuǎn)為黏液膿血便。彎曲菌感染可發(fā)生于各個(gè)年齡段，在發(fā)達(dá)國(guó)家，易感者多為大齡兒童和青年[2]。近年來(lái)本院空腸彎曲菌腸炎患者以嬰幼兒多見(jiàn)，占發(fā)病總數(shù)的50%，與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)報(bào)道的患者年齡分布特點(diǎn)類似[3]。彎曲菌腸炎全年均可發(fā)病，以夏秋季為主，不同地區(qū)之間感染高峰季節(jié)可能存在差異。本院腸道門(mén)診收治的空腸彎曲菌腸炎發(fā)病高峰集中在6～8月，與許海燕等[4]報(bào)道揚(yáng)州市區(qū)腹瀉人群中空腸彎曲菌感染流行情況基本相似。

空腸彎曲菌感染病程常呈自限性，輕癥患者不需要抗菌藥物或其他特殊治療，但對(duì)癥狀較重、病情遷延者需要使用敏感抗菌藥物治療。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示碳青霉烯類、酶抑制劑、大環(huán)內(nèi)酯類和氨基糖苷類藥物對(duì)彎曲菌有很好的抑菌活性，氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥性有逐年增加趨勢(shì)[5]，頭孢菌素和磺胺類對(duì)其抑菌活性差。因此，空腸彎曲菌腸炎的抗菌治療宜優(yōu)先考慮胃腸道吸收較好的敏感抗菌藥物，如紅霉素等。

近年來(lái)PCR及其相關(guān)技術(shù)應(yīng)用于空腸彎曲菌的鑒定、診斷取得了顯著進(jìn)展，特別是不斷涌現(xiàn)的分子診斷技術(shù)用于各類標(biāo)本空腸彎曲菌的直接檢測(cè)和分型等研究，有利于對(duì)空腸彎曲菌感染或作為食源性監(jiān)測(cè)的快速、準(zhǔn)確病原學(xué)診斷。PCR檢測(cè)技術(shù)能簡(jiǎn)便、快速地?cái)U(kuò)增目的基因，從微量水平甚至痕量水平檢測(cè)，敏感性和特異性很好，可以做到定量和多重檢測(cè)，但實(shí)際應(yīng)用中一個(gè)最大缺點(diǎn)是容易出現(xiàn)假陽(yáng)性[6-7]。特異性PCR檢測(cè)結(jié)合傳統(tǒng)的生化鑒定方法，能夠相互驗(yàn)證，可以提高檢出率和準(zhǔn)確性，但因?yàn)樾枰厥獾脑O(shè)備和較高的操作水平等多種因素制約其在基層醫(yī)院推廣應(yīng)用。

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廣東省科技廳社會(huì)發(fā)展領(lǐng)域科技計(jì)劃項(xiàng)目(粵科社字2011-106)；廣東省廣州市衛(wèi)生局科研立項(xiàng)(201102A213044)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.037

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1673-4130(2016)17-2448-03

2016-03-03

2016-05-11)