HBV基因分型和耐藥突變基因檢測

楊紅起,魯　榮,于本章

(勝利油田中心醫(yī)院檢驗科,山東東營 257034)

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·論著·

HBV基因分型和耐藥突變基因檢測

楊紅起,魯榮,于本章△

(勝利油田中心醫(yī)院檢驗科,山東東營 257034)

目的探討東營地區(qū)乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布，乙型肝炎患者耐藥情況，HBV基因型別與耐藥以及突變位點關(guān)系。方法收集乙型肝炎患者血清300例，采用離心柱法提取HBV-DNA，聚合酶鏈反應(PCR)-反向點雜交法檢測HBV分型和耐藥突變。 結(jié)果300例HBV-DNA陽性患者中，檢出B型、C型、B/C型及其他未檢測出的基因型，未檢出D型分型，檢出結(jié)果中以C型為主，占81.8%；HBV患者耐藥藥物以拉米夫定和替比夫定的聯(lián)合耐藥為主，占43.6%；HBV耐藥突變基因型主要為rt204I(24.35%)、rt204V(17.39%)及rt180M(17.39%)；B型和C型的耐藥突變率分別為30.77%和42.42%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論東營地區(qū)HBV基因C型多于B型，C型容易產(chǎn)生耐藥，以rt204I，rt204V及rt180M基因突變型多見，拉米夫定和替比夫定的聯(lián)合耐藥多見，應根據(jù)基因分型和耐藥突變結(jié)果對乙型肝炎患者選擇適合的治療方案。

HBV分型；耐藥性；耐藥突變位點

隨著新型抗病毒藥物的應用，乙型肝炎病毒(HBV)基因變異檢測方法的更新，新的變異位點不斷涌現(xiàn)，給臨床醫(yī)生的工作帶來了很大的難題。盡管目前對HBV基因變異的研究取得了一些成果，但對于具有多個變異位點的HBV基因組，研究還遠遠不夠[1]。HBV基因型在乙型肝炎患者的臨床表現(xiàn)、治療預后和藥物突變上都有一定的影響[2-3]?，F(xiàn)有的一些研究成果尚存在爭議，而且HBV基因組還會有新的變異點的出現(xiàn)，因此，HBV變異與臨床的關(guān)系尚需要大量的臨床標本，從病毒的全基因組出發(fā)來進一步研究。用發(fā)展的眼光看待HBV變異，將使人們對HBV變異及其臨床意義的認識得到不斷的深入和研究。本文對東營地區(qū)300例乙型肝炎患者檢測結(jié)果進行比較分析，總結(jié)基因分型及耐藥位點分布情況。現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料收集2013年11月至2015年6月本院門診及住院部申請進行HBV基因分型和耐藥突變基因檢測的乙型肝炎患者共300例，其中男208例,中位年齡58.56歲；女92例，中位年齡59.25歲。

1.2儀器與試劑全自動熒光聚合酶鏈反應擴增儀(LightCycler 480)由羅氏公司提供，相關(guān)試劑盒由亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供。

1.3方法HBV-DNA提取采用離心柱法，HBV分型和耐藥突變基因檢測采用聚合酶鏈反應(PCR)-反向點雜交法。檢測具體方法及判斷標準均嚴格按照試劑盒說明進行。使用亞能試劑對HBV 4種核苷(酸)類藥物的耐藥突變位點(野生型:rt250M、rt180L、rt202S、rt204M、rt207M、rt184T、rt207V、rt181A、rt236N;突變型:rt250V、rt180M、rt184S、rt184A、rt184L、rt184F、rt184I、rt204V、rt202G、rt202I、rt204I、rt207I、rt250I、rt250L、rt181V、rt236T)進行檢測。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)　　果

2.1HBV基因型檢出情況300例乙型肝炎患者中,檢出HBV型別者有114例,檢出率為38.00%。東營地區(qū)HBV感染者基因型有B型(13例)、C型(99例)、B/C型(2例)及其他未檢測出的基因型(11例)，而無D型分型。檢出型別以C型為主(81.8%)，11例未檢出基因型別中，7例檢出突變型位點，4例檢出野生型位點。

2.2HBV感染者核苷(酸)類藥物耐藥性分布300例HBV感染者中，耐藥性檢測呈陽性的患者有55例，占總感染人數(shù)的18.33%。東營地區(qū)HBV患者耐藥藥物主要為拉米夫定(LAM)和替比夫定(LDT)的聯(lián)合耐藥，占43.6%。其次為LAM、LDT和恩替卡韋(ETV)的聯(lián)合耐藥，占23.6%。出現(xiàn)LAM和阿德福韋酷(ADV)單項耐藥的比例較小，分別為5.6%和3.6%。見表1。

表1　　耐藥性檢測陽性患者耐藥分布統(tǒng)計

2.3HBV基因型與耐藥突變位點關(guān)系HBV患者所有分型中耐藥陽性中耐藥突變位點突變型主要為rt204I(24.35%)，rt204V(17.39%)及rt180M(17.39%)。見表2。

表2　　HBV基因型與耐藥突變位點關(guān)系

注:檢出率為單個突變位點檢出次數(shù)/所有突變位點檢出次數(shù)×100%。

2.4HBV基因型與核苷(酸)類藥物耐藥的關(guān)系B型中耐藥有4例,耐藥率為30.77%,其中ADV單項耐藥有1例,LAM、LDT和ETV三重耐藥2例，LAM、ADV、ETV和LDT四重耐藥1例。C型中耐藥有42例,耐藥率為42.42%,其中LAM單項耐藥有3例,ADV單項耐藥的有1例，LAM和ETV聯(lián)合耐藥1例,LAM和LDT聯(lián)合耐藥20例，LAM、LDT和ETV三重耐藥8例，LAM、LDT和ADV三重耐藥9例。B/C混合型中耐藥2例,耐藥率為100.00%,其中LAM和LDT聯(lián)合耐藥有1例，LAM、ADV、ETV和LDT四重耐藥1例。其他基因型中耐藥7例，耐藥率為63.64%，LAM和LDT聯(lián)合耐藥3例，LAM和ETV聯(lián)合耐藥1例,LAM、LDT和ETV三重耐藥3例。C型耐藥率高于B型,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.694,P<0.05),D型、B/C混合型等因例數(shù)較少,未進行統(tǒng)計分析。

3　討　　論

PCR-反向點雜交技術(shù)是Okamoto等[4]于1989年提出的，是采用PCR體外擴增和DNA反向點雜交相結(jié)合的DNA芯片技術(shù)[5]。該方法將多種核酸檢測探針固定在膜條上，通過與擴增后的待檢靶序列雜交，一次即可進行多種基因亞型的分類，這項技術(shù)不僅能檢測HBV基因型,同時也能檢測多個HBV耐藥突變位點，因此具有很高的檢測效率，而且簡單、經(jīng)濟[6]。在耐藥突變方面,其針對LAM、ADV、ETV和LDT 4種核苷(酸)類藥物常見的8種耐藥位點的野生型和突變型共25種耐藥模式設(shè)計特異性探針。本試驗使用亞能生物技術(shù)公司相關(guān)試劑進行試驗，并對其結(jié)果進行總結(jié)分析。HBV基因的復制通過反轉(zhuǎn)錄途徑進行，由于其反轉(zhuǎn)錄酶缺乏矯正功能，HBV基因復制過程中會產(chǎn)生自然變異。而在這種變異的不斷積累下，HBV基因組核苷酸序列產(chǎn)生了巨大的變化,形成了HBV基因組的差異。

目前國內(nèi)批準用于治療乙型肝炎的核苷(酸)類藥物有LAM、ADV、ETV和LDT等4種?？共《局委煹哪繕耸沁^抑制病毒復制[7]，最終阻止或延緩慢性HBV感染所導致的并發(fā)癥，停止或逆轉(zhuǎn)肝損傷、肝硬化或肝癌、肝纖維化的進展。由于持久性的共價閉合環(huán)DNA(cccDNA)的存在和病毒整合到受感染的肝細胞的細胞核基因組中，HBV感染的根除是不可行的[8]。在初始治療中，首選抗病毒作用強大，耐藥基因屏障高且耐藥發(fā)生率較低的單藥，或者聯(lián)合使用2種以上無交叉耐藥的藥物[9]。而這些藥物的長期應用可引起病毒耐藥突變是導致臨床抗病毒治療失敗的原因之一[10]。本研究結(jié)果顯示，東營地區(qū)300例乙型肝炎患者中耐藥突變陽性患者有55例，其中以LAM和LDT的聯(lián)合耐藥為主(43.6%)；出現(xiàn)兩重耐藥的比例為47.2%;出現(xiàn)三重耐藥的比例高達40.0%；出現(xiàn)四重耐藥的比例低，為3.6%。LAM和LDT聯(lián)合耐藥比例較高，與這兩種藥物臨床使用率高且應用時間較長有關(guān)，也可能與ETV耐藥有關(guān)，因為ETV耐藥會帶有LAM和LDT的耐藥位點。從表1可以看出，ADV和ETV總的耐藥率分別為23.6%(3.6%+3.6%+16.4%)和30.8%(3.6%+3.6%+23.6%)，所以ADV和ETV可以作為東營地區(qū)慢性乙型肝炎抗病毒治療的一線藥物。

本研究中發(fā)現(xiàn)，東營地區(qū)出現(xiàn)的耐藥突變位點主要為rt204I(24.35%)，其次為rt204V(17.39%)和rt180M(17.39%)。204位點的變異發(fā)生在活性高且高度保守的HBV聚合酶C區(qū)YMDD位點上，YMDD基因序列直接參與HBV聚合酶的催化反應，單一位點的變異即可造成對LAM或LDT的耐藥，這也造成了本地區(qū)LAM和LDT的高耐藥率。rt180M是乙型肝炎患者204位點變異后如果繼續(xù)服用LAM或LDT，使病毒再增加的變異位點,這將大大降低這兩種藥的抗病毒效果[11]，如果rt204I/V和rt180M突變位點同時出現(xiàn)，那臨床上應避開這兩種藥的選擇。

通過耐藥突變基因位點的檢測,可以了解不同基因型的耐藥表型,對指導乙型肝炎患者的抗病毒治療有重要作用。HBV有A、B、C、D、E、F、G、H、I等9種不同的基因型，我國以“南B北C”的情況為主[12-13]。本研究對HBV感染者基因型分型，結(jié)果顯示東營地區(qū)乙型肝炎分型有B型、C型、B/C型及其他未檢測出的基因型，而無D型；C型為主要檢出基因型，反映了北方地區(qū)的HBV基因分布情況。此次檢測出一定比例的B型和B/C混合型，可能與東營地區(qū)地處油田，外來人口特別是四川、福建等地人群比例較大有關(guān)。本研究研究對象為乙型肝炎患者，沒有涉及肝硬化患者，排除了疾病類型對HBV基因分型的影響[13]。研究表明,乙型肝炎的進展和預后與所感染HBV的基因型及HBV突變密切有關(guān),在不同類型乙型肝炎患者中,HBV基因型的流行病學存在顯著性的差異,基因型是影響HBV感染預后的重要因素[14-16]。C基因型感染者病情發(fā)展比較重，在重癥肝炎、原發(fā)性肝癌患者中C型較為多見,易引起較重肝損傷和不佳的臨床預后[17]。從HBV基因型的耐藥率來看，本地區(qū)C型的耐藥率明顯高于B型，所以慢性乙型肝炎在治療前進行基因分型是必要的。

本研究中共有7例檢出突變型位點，4例檢出野生型位點，但均未檢出基因型別，這與11份標本HBV-DNA濃度低于試劑盒最低檢出靈敏度(1 000 CFU/mL)有關(guān)，對于HBV-DNA低濃度標本如何檢測，是下一步研究的課題。

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Hepatitis B virus genotypes and drug resistance mutation gene detection

YANGHongqi,LURong,YUBenzhang△

(DepartmentofClinicalLaboratory,ShengliOilFieldCentralHospital,Dongying,Shandong257034,China)

ObjectiveTo investigate the distribution of hepatitis B virus(HBV) genotypes,drug resistance situation of hepatitis B patients and the relation between HBV genotype with drug resistance and mutation sites.MethodsThree hundred serum samples of HBV patients were collected and HBV-DNA was extracted by adopting the centrifugal column method.The HBV genotype and drug resistant mutant were detected by using PCR-reverse dot blot hybridization method.ResultsIn 300 cases of HBV-DNA positive,genotye B,C,B/C and other undetected genotypes were detected out,but genotype D was not detected out,in which genotype C was predominant,accounting for 81.8%;in the HBV patients,the resistant drugs were dominated by- lamivudine and telbivudine,accounting for 43.6%;the HBV drug resistant mutation genotypes were mainly rt204I(24.35%),rt204V(17.39%) and rt180M(17.39%);the drug resistance mutation rates of genotype B and C were 30.77% and 42.42% respectively;the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionHBV genotype C in Dongying area is more than genotype B,genotype C is prone to produce drug resistance,rt204I,rt204V and rt180M gene mutations are common,lamivudine and telbivudine combined resistance is common,the suitable treatment scheme should be selected according to genotyping and drug resistance mutations results.

HBV genotyping;resistance;resistance mutations

楊紅起，男，副主任技師，主要從事生物分子學檢驗研究。△

，E-mail：slyubz@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.024

A

1673-4130(2016)17-2418-03

2016-04-03

2016-06-11)