精神分裂癥樣小鼠血液中miRNA-132的表達(dá)分析

張高麗，于海川

(1.河南省周口市中心血站　466000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院　453003)

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·論著·

精神分裂癥樣小鼠血液中miRNA-132的表達(dá)分析

張高麗1，于海川2

(1.河南省周口市中心血站466000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院453003)

目的使用地卓西平馬來酸鹽(MK-801)腹腔注射制備精神分裂癥小鼠模型，研究精神分裂癥小鼠外周血中miRNA-132的異常表達(dá)情況。方法選取成年雄性昆明小鼠，隨機(jī)分為注射生理鹽水組(對(duì)照組)和注射MK-801組(實(shí)驗(yàn)組)，觀察小鼠的行為學(xué)改變，用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測各小鼠血液中miRNA-132的表達(dá)情況。結(jié)果(1)實(shí)驗(yàn)組小鼠刻板行為評(píng)分與對(duì)照組比較有顯著增高(P<0.05)，自發(fā)活動(dòng)增加顯著，表現(xiàn)為直立數(shù)明顯減少而走格數(shù)明顯增多(P<0.05)，符合精神分裂癥模型小鼠的表現(xiàn)。(2)與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組miRNA-132表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論miRNA-132在精神分裂癥小鼠血液中有異常表達(dá)。

地卓西平馬來酸鹽;小鼠模型;精神分裂癥;miRNA-132

精神分裂癥是一組病因未明的、復(fù)雜的精神疾病，臨床表現(xiàn)為感知、思維、情感、行為等方面的障礙，精神活動(dòng)與環(huán)境的不協(xié)調(diào)為主要特征的一類最常見的、反復(fù)發(fā)作的慢性遷延性疾病。近些年，盡管對(duì)精神分裂癥已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，但其準(zhǔn)確的分子機(jī)制還未闡明。miRNA是一種非編碼的單鏈小分子RNA，長度為19～24個(gè)核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后其通過抑制基因表達(dá)調(diào)節(jié)幾乎所有的生物過程[1]。研究表明，miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因功能的失調(diào)，與神經(jīng)精神障礙的起始和發(fā)生過程有著密切關(guān)系。本研究擬對(duì)昆明小鼠連續(xù)注射地卓西平馬來酸鹽(MK-801)制備精神分裂癥樣模型，觀察小鼠行為學(xué)的改變，研究精神分裂癥樣小鼠外周血中miRNA-132的異常表達(dá)，進(jìn)而探討miRNA-132與精神分裂癥的相關(guān)性，為深入研究精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制提供新的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠，成年，雄性，體質(zhì)量20～30 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。于12 h晝夜節(jié)律下(8:00～20:00)籠養(yǎng)，保證動(dòng)物飲水與進(jìn)食自由，小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境1周后將其隨機(jī)分為注射生理鹽水組的對(duì)照組和注射MK-801的實(shí)驗(yàn)組，每組各20只。

1.2方法將Sigma公司生產(chǎn)的MK-801溶于生理鹽水中，實(shí)驗(yàn)組小鼠右后側(cè)腹腔注射0.6 mg/kg，對(duì)照組小鼠右后側(cè)腹腔注射等體積生理鹽水，均連續(xù)注射7 d。

1.2.1MK-801誘導(dǎo)昆明小鼠精神分裂癥模型的建立[2]實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均于末次注射后10 min，開場實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠自發(fā)活動(dòng)能力和記錄小鼠刻板性動(dòng)作。

1.2.2開場實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[2]，開場實(shí)驗(yàn)箱(36 cm×36 cm×38 cm)，將底面劃成16塊相等的方格(9 cm×9 cm)，上方敞開。觀察時(shí)輕提鼠尾將動(dòng)物放在敞箱中央，每次測試10 min，記錄小鼠自發(fā)活動(dòng)能力(爬格數(shù)為觀察期內(nèi)昆明小鼠四肢爬過的格子數(shù))。

1.2.3刻板性動(dòng)作MK-801作用于昆明小鼠，產(chǎn)生類似精神分裂癥的刻板性動(dòng)作癥狀，如小鼠反復(fù)搖頭、轉(zhuǎn)圈、小范圍內(nèi)不停的無規(guī)則運(yùn)動(dòng)等。采用5分級(jí)評(píng)分，每10 min評(píng)分1次，觀察2 h取其平均值。由3名不知情人員按評(píng)分表的要求進(jìn)行盲法測評(píng)，以3名測評(píng)者評(píng)分的平均分納入統(tǒng)計(jì)。

1.2.4標(biāo)本采集與制備摘除眼球，顛倒試管2～3次，使血液與抗凝劑充分混勻。快速收集小鼠新鮮血液2～4 mL，放入含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，混勻后用低溫冰箱2 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入1mL Trizol，室溫放置5 min后提取總RNA。

1.2.5總RNA和反轉(zhuǎn)錄總RNA提取試劑由本實(shí)驗(yàn)室自配，按照總RNA快速提取步驟操作。miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司,貨號(hào)RR047A)按照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測儀器為Thermo公司，按照Takara公司試劑盒(貨號(hào)DR037S)說明書操作。RT-PCR反應(yīng)體系如下：cDNA 1.0 μL，ddH2O 3.6 μL，Primer 10.2 μL，Primer 20.2 μL，2×Mix 5.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。

2　結(jié)　　果

2.1兩組小鼠自發(fā)活動(dòng)和刻板行為比較經(jīng)MK-801誘導(dǎo)后的實(shí)驗(yàn)組小鼠自發(fā)活動(dòng)增加。末次給藥10 min后，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的昆明小鼠直立數(shù)明顯減少而走格數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　　兩組小鼠自發(fā)活動(dòng)和刻板行為比較±s)

注：與對(duì)照組給藥后比較，△P<0.05。

2.2實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)模型小鼠刻板行為的表現(xiàn)MK-801可使昆明小鼠的行為出現(xiàn)明顯異常。一般給藥10 min后開始出現(xiàn)行為異常，20～60 min最明顯，2 h后逐漸減弱。主要表現(xiàn)為反復(fù)搖頭、轉(zhuǎn)圈、小范圍內(nèi)不停地?zé)o規(guī)則運(yùn)動(dòng)等刻板性動(dòng)作，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組刻板行為明顯增多(P<0.05)，見表1。

2.3兩組小鼠miRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中miRNA-432、miRNA-132、miRNA-181b表達(dá)水平顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miRNA-30a表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

圖1實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組miRNA的表達(dá)變化

3　討　　論

MK-801是一種高親和力的NMDA受體非競爭性拮抗劑，可以使模型小鼠模擬精神分裂癥的陽性癥狀和陰性癥狀，從而導(dǎo)致小鼠認(rèn)知能力下降。同時(shí)也可改變腦部及血液中部分miRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MK-801可以導(dǎo)致昆明小鼠產(chǎn)生類似精神分裂癥的癥狀，且精神分裂癥表現(xiàn)較明顯，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型具有可重復(fù)性。

miRNA是在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，一類短的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，能夠與特定mRNA靶點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的翻譯過程，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)。有研究預(yù)測，人約有60%的蛋白基因表達(dá)受到miRNA分子的調(diào)節(jié)[3]。miRNA廣泛存在于血漿和血清中，且在血漿和血清中非常穩(wěn)定。由于小鼠腦組織標(biāo)本不易獲得miRNA，而血液miRNA檢測相對(duì)簡單可行，且在血液和腦組織中的miRNA表達(dá)具有一定的一致性，因此血液miRNA相關(guān)的研究也獲得科學(xué)家的認(rèn)可。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中miRNA-30a表達(dá)水平上調(diào)，miRNA-432、miRNA-132、miRNA-181b表達(dá)水平下調(diào)。表明這4種miRNA可能與精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制存在相關(guān)性。miR-132是一種在神經(jīng)和免疫方面起重要調(diào)節(jié)作用的miRNA[4]。Hansen等[5]的研究表明，CAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白可以調(diào)節(jié)miRNA-132，在成熟神經(jīng)系統(tǒng)中miRNA-132的減少會(huì)導(dǎo)致突觸異常，從而帶來一系列與神經(jīng)認(rèn)知方面相關(guān)的疾病。Miller等[6]研究表明，精神分裂癥中miRNA-132與神經(jīng)發(fā)育和成人腦功能有密切關(guān)系，通過對(duì)100 例患者的研究中，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照者相比，精神分裂癥患者前額皮質(zhì)層miRNA-132表達(dá)顯著下降。這一結(jié)果與本研究發(fā)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)組血液中miRNA-132表達(dá)顯著降低的結(jié)果相互吻合，說明miRNA-132不管在腦組織中還是血液中都可能成為精神分裂癥生物標(biāo)志物之一，具有很大的研究價(jià)值。

生物信息學(xué)技術(shù)的運(yùn)用使得miRNA靶基因的預(yù)測有了很大進(jìn)展。接下來本研究將收集偏執(zhí)型精神分裂癥的臨床患者，進(jìn)一步尋找及驗(yàn)證miRNA-132精神分裂癥相關(guān)靶基因，并檢測這些靶基因的表達(dá)情況，這將有助于揭示miRNA-132在調(diào)控精神分裂癥發(fā)病和治療中的詳細(xì)分子機(jī)制，進(jìn)而為深入研究精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制提供新的思路，甚至為最終治療精神分裂癥找到新的突破方向。

[1]Ding XC,Weiler J,Grosshans H.Regulating the regulators:mechanisms controlling the maturation of microRNAs[J].Trends Biotechnol,2009,27(1):27-36.

[2]Kuzmin A,Madjid N,Terenius L,et al.Big dynorphin,a prodynorphin-derived peptide produces NMDA receptor-mediated effects on memory,anxiolytic-like and locomotor behavior in mice[J].Neuropsychopharmacology,2006,31(9):1928-1937.

[3]Bartel DP.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions[J].Cell,2009,136(2):215-233.

[4]Wanet A,Tacheny A,Arnould T,et al.miR-212/132 expression and functions:within and beyond the neuronal compartment[J].Nucleic Acids Res,2012,40(11):4742-4753.

[5]Hansen KF,Karelina K,Sakamoto K,et al.miRNA-132:a dynamic regulator of cognitive capacity[J].Brain Struct Funct,2013,218(3):817-831.

[6]Miller BH,Zeier Z,Xi L,et al.MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(8):3125-3130.

Analysis on blood miRNA-132 expression in schizophrenia mice

ZHANGGaoli1,YUHaichuan2

(1.ZhoukouBloodCenter,Zhoukou,Henan466000,China;2.SchoolofLaboratoryMedicine,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453003,China)

ObjectiveTo prepare the schizophrenia mouse model by using peritoneal injection of dizocilpine maleate(MK-801),then to study the peripheral blood miRNA-132 abnormal expression in schizophrenia mouse model.MethodsAdult male Kunming mice(KM) were selected and randomly divided into the normal saline group(control group) and MK-801 group(experimental group).The behaviors changes were observed.Real-time PCR method was used to detect the miRNA-132 expression in peripheral blood.Results(1) Compared with the control group,the stereotyped behavior score in the experimental group was increased significantly(P<0.05),the spontaneous activity was increased significantly(P<0.05),showing that the up-right number was significantly decreased,while the walking-grid number was significantly increased(P<0.05),which was consistent with the manifestations of schizophrenia mouse model.(2)Compared with the control group,the miRNA-132 expressed in the experimental group was down-regulated,the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionmiRNA-132 is abnormally expressed in blood of schizophrenia mouse.

dizocilpine maleate;mouse model;schizophrenia;miRNA-132

張高麗，女，主管技師，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.014

A

1673-4130(2016)17-2394-02

2016-03-07

2016-05-15)