肺炎支原體快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用評(píng)價(jià)

張　杰，胡　軍，劉　楊，李　元

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院　710049；2.陜西省安康市中心醫(yī)院輸血科　725000；3.陜西省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，西安 710068)

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·論著·

肺炎支原體快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用評(píng)價(jià)

張杰1,2，胡軍1,3△，劉楊1,3，李元1,3

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院710049；2.陜西省安康市中心醫(yī)院輸血科725000；3.陜西省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，西安 710068)

目的制備抗肺炎支原體(MP)的特異性單克隆抗體，利用單克隆抗體建立MP膠體金快速檢測(cè)方法。方法采集急性呼吸道感染患兒咽拭子標(biāo)本，分離培養(yǎng)并鑒定MP，純化MP抗原，制備抗MP單抗，利用單抗建立MP膠體金檢測(cè)試紙條。取疑似MP感染患者的咽拭子標(biāo)本，分別使用熒光定量PCR法和膠體金快速檢測(cè)法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，觀察并統(tǒng)計(jì)檢查結(jié)果。結(jié)果成功分離培養(yǎng)出MP菌株，滅活并純化出MP抗原，利用該抗原免疫小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備出抗MP單克隆抗體19株，從中選出效價(jià)高、特異性較好的兩株單克隆抗體(MP-5和MP-19)作為原材料制備MP膠體金快速檢測(cè)試紙條。膠體金試紙條最低檢測(cè)限為20 ng。分別采用膠體金試紙條和熒光定量PCR法對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，本研究制備的MP膠體金快速檢測(cè)法的靈敏度為88.2%，特異度為82.6%。結(jié)論制備出抗MP的特異性單克隆抗體，已初步建立MP膠體金快速檢測(cè)法，并為臨床MP感染患者的快速診斷提供幫助。

肺炎支原體；單克隆抗體；膠體金免疫層析法

肺炎支原體(MP)是引起兒童、成人支氣管炎的重要病原體之一[1],學(xué)齡期兒童是主要的易感人群，可引起兒童大葉性肺炎[2]。由于MP感染的治療方案與其他細(xì)菌感染和病毒感染不同，區(qū)分是否為支原體感染對(duì)臨床治療有指導(dǎo)作用。支原體肺炎并無(wú)典型的臨床體征[3],確診是否為MP感染主要依賴于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。目前MP檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)、血清學(xué)和核酸聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等[4]，這些檢測(cè)手段所需時(shí)間一般在數(shù)小時(shí)，甚至超過(guò)1周，對(duì)于診斷和治療策略選擇的指導(dǎo)價(jià)值均被嚴(yán)重降低。本研究主要利用單克隆抗體技術(shù)和膠體金技術(shù)建立快速檢測(cè)MP的方法，并對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源采集陜西省人民醫(yī)院兒科門診40例疑似MP感染患者的咽拭子標(biāo)本，其中男24例，女16例。標(biāo)記標(biāo)本，立即送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行核酸檢測(cè)和分離培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1MP分離培養(yǎng)和熒光定量PCR鑒定對(duì)采集的臨床咽拭子標(biāo)本進(jìn)行核酸提取和熒光定量PCR檢測(cè)，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書操作(MP核酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)于江蘇碩士生物科技有限公司)。室溫取出所需要數(shù)量的MP增殖鑒定培養(yǎng)管，做好標(biāo)記，取核酸檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本0.2 mL加入培養(yǎng)管中接種、培養(yǎng)，置37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)顏色由原來(lái)的紅色變成黃色為陽(yáng)性，培養(yǎng)基顏色保持不變或者變渾濁為陰性。提取陽(yáng)性分離培養(yǎng)液中MP核酸，熒光定量PCR鑒定分離培養(yǎng)產(chǎn)物。將鑒定準(zhǔn)確的陽(yáng)性培養(yǎng)液用MP分離培養(yǎng)基劃線純菌，純菌用20%甘油-20 ℃保存。

1.2.2MP抗原純化和雜交瘤細(xì)胞株的建立MP分離培養(yǎng)陽(yáng)性菌株P(guān)CR鑒定后，接種MP液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)基顏色由原來(lái)的紅色變?yōu)辄S色后收獲培養(yǎng)產(chǎn)物。18 000 r/min離心1 h，收獲沉淀，用20 mmol/L pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸沉淀，離心洗滌3次。MP純化產(chǎn)物滅火后常規(guī)方法免疫6～8周齡雌性Balb/c小鼠，每次0.2 mL，免疫3次，每次間隔2周。末次免疫后3 d進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞融合，無(wú)菌取小鼠脾臟，無(wú)菌研磨制備細(xì)胞懸液，與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按5︰1混合，緩慢加入PEG4000融合細(xì)胞，用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液(Hyclone公司)1 000 r/min離心洗滌1次，用含HAT的1640培養(yǎng)基(含20%胎牛血清)重懸后，加入鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。

1.2.3腹水制備和單克隆抗體純化取穩(wěn)定分泌抗MP特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，注射入至小鼠腹腔(每只注入0．5 mL)制備腹水。無(wú)菌條件下收獲腹水，飽和硫酸法純化單抗，進(jìn)一步采用蛋白G親和層析法(KTAprime plus系統(tǒng))，純化單抗。

1.2.4抗MP單抗鑒定(1)抗體效價(jià)：pH9.6的緩沖液稀釋MP抗原進(jìn)行包被，倍比系列稀釋腹水單抗，間接ELISA測(cè)定腹水效價(jià)。(2)單抗亞類鑒定：利用SBA Clonotpying System-HRP 試劑盒(Southern Biotech公司)測(cè)定單克隆抗體亞類，按照試劑盒說(shuō)明書操作。(3)單抗特異性鑒定：pH9.6的緩沖液分別稀釋腺病毒抗原、MP抗原、出血熱病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、甲型流感病毒抗原和肺炎衣原體抗原并進(jìn)行包被，間接ELISA鑒定單克隆抗體交叉反應(yīng)性。(4)Western Blot分析：分別將分離株純化產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)菌株蛋白(購(gòu)于Microbix Biosystems 公司)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉孵育1 h，加入1∶1 000稀釋的單抗在4 ℃下與膜結(jié)合過(guò)夜，PBS洗膜6次，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG二抗，室溫結(jié)合1 h，PBS洗膜6次，加入DAB顯色，其中以分離菌株作為抗原，ab53600(抗MP兔多抗，購(gòu)于Abcam公司)作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.5金標(biāo)抗體液的制備取預(yù)先制備的膠體金顆粒溶液10 mL,磁力攪拌下，加30%的H2O232 μL；磁力攪拌混合10 min，加0.2 mmol/L的碳酸鉀300 μL，磁力攪拌混勻10 min，加入純化凍干的單克隆抗體0.2 mg；攪拌混勻60 min，加入牛血清清蛋白0.1 g；攪拌混勻10 min，加入聚乙二醇(相對(duì)分子質(zhì)量為6×103)0.01 g；攪拌混勻30 min。8 000 r/min離心10 min濃縮金標(biāo)抗體。酒紅色單抗標(biāo)記膠體金沉淀用膠體金稀釋液溶解(膠體金稀釋液的組成如下，牛血清清蛋白1%,蔗糖2.5%；吐溫-20 0.05%；PBS 0.01 mol/L，pH7.4；疊氮鈉0.1%)。

1.2.6膠體金試紙條組裝利用噴金儀在金標(biāo)墊上均勻鋪上抗MP單抗標(biāo)記的膠體金，烘干。用點(diǎn)膜儀將純化的抗MP單抗(2 mg/mL)噴入反應(yīng)膜上(檢測(cè)線)，將羊抗鼠IgG(0.8 mg/mL)進(jìn)行點(diǎn)膜(對(duì)照線)，室溫晾干，即制備出反應(yīng)膜。將樣品墊、金墊、反應(yīng)膜、吸收墊、背襯等部分進(jìn)行組裝，最后即得出MP膠體金檢測(cè)試紙條。

1.2.7膠體金試紙條穩(wěn)定性和靈敏性分別將試紙條密封保存于室溫和4 ℃條件下，1個(gè)月后取出，分別取標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品和陰性樣品進(jìn)行試紙條檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性。倍比系列稀釋MP標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品滴加到試紙條樣品墊上，以出現(xiàn)明顯T線時(shí)的最低標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品濃度為試紙條的最低檢測(cè)限值。

1.2.8標(biāo)本檢測(cè)將收集到的急性呼吸道感染患兒鼻/咽拭子40份，分別用MP膠體金試紙條和熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算MP膠體金試紙條檢測(cè)法的靈敏度和特異度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1MP分離培養(yǎng)及鑒定結(jié)果共收集40例患者的咽拭子標(biāo)本，MP熒光定量PCR檢測(cè)陽(yáng)性17例，從熒光定量PCR檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本中分離培養(yǎng)出1株菌株，該菌株能夠特異地在MP培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色在接種24 h后有明顯變化，提取菌株培養(yǎng)產(chǎn)物的核酸，經(jīng)過(guò)熒光定量PCR鑒定后，48、72 h培養(yǎng)周期中均有增殖。

2.2雜交瘤細(xì)胞株建立和單克隆抗體特性分析利用MP分離株進(jìn)行大量培養(yǎng)，滅活后純化抗原免疫小鼠，取脾臟研磨與Sp2/0細(xì)胞融合，融合細(xì)胞篩選及克隆化獲得19株能穩(wěn)定分泌抗MP的單抗雜交瘤細(xì)胞株，其中2株效價(jià)最高達(dá)106，分別為MP-5和MP-19，均為IgG1型，并與腺病毒、出血熱病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、肺炎衣原體不發(fā)生交叉反應(yīng)。單抗Western Blot結(jié)果顯示，MP-5和MP-19均與分離株純化產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)菌體蛋白結(jié)合，2株單抗與分離株純化產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)菌體蛋白結(jié)合條帶一致。見圖1。

注：M為蛋白標(biāo)志物；1表示抗原為MP標(biāo)準(zhǔn)品，一抗為MP-5，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG；2表示抗原為MP標(biāo)準(zhǔn)品，一抗為MP-19，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG；3表示抗原為MP標(biāo)準(zhǔn)品,一抗為ab53600，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG。

圖1抗MP單克隆抗體Western Blot分析

2.3膠體金試紙條穩(wěn)定性和靈敏性利用MP-5單克隆抗體標(biāo)記膠體金顆粒，并均勻鋪到金墊上。用MP-19單克隆抗體噴入反應(yīng)膜上，以MP-5和MP-19為原料建立MP膠體金檢測(cè)試紙條。在不同溫度保存的試紙條上分別滴加標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品和陰性樣品，檢測(cè)線和質(zhì)控線在加樣5 min后條帶顏色深淺相同。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)菌株抗原在20 ng時(shí)，檢測(cè)線肉眼可見；10 ng時(shí)，無(wú)法觀察到檢測(cè)線。因此，膠體金試紙條的最低檢測(cè)限為20 ng。

表1　　熒光定量PCR法和膠體金法檢測(cè)結(jié)果

2.4熒光定量PCR法和膠體金法檢測(cè)結(jié)果比較分別利用膠體金法和熒光定量PCR法對(duì)40份臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，膠體金試紙條檢測(cè)的特異度和靈敏度分別為88.2%和82.6%，熒光定量PCR法的靈敏度和特異度分別為78.9%和90.5%。見表1。

3　討　　論

目前用于MP檢測(cè)的方法較多，主要包括支原體分離培養(yǎng)[5]、血清學(xué)檢測(cè)[6]和PCR法等[7]。傳統(tǒng)的培養(yǎng)法檢測(cè)MP是病原診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于MP營(yíng)養(yǎng)要求高、生長(zhǎng)緩慢、陽(yáng)性分離率低、耗時(shí)長(zhǎng)，限制了其臨床應(yīng)用。多數(shù)實(shí)驗(yàn)室診斷都采用血清學(xué)方法，例如補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、顆粒凝集試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)和不同的ELISA，以及PCR法。但是，由于MP細(xì)胞膜上的糖脂抗原與其他微生物及機(jī)體組織存在非特異交叉反應(yīng)，這些血清學(xué)方法的檢測(cè)質(zhì)量受到一定限制。此外，由于抗體出現(xiàn)的時(shí)機(jī)不宜掌握，兒童、青少年與成人之間又存在MP特異抗體的差異，因此，血清學(xué)檢測(cè)對(duì)標(biāo)本采集時(shí)間和試驗(yàn)技術(shù)、試劑盒的質(zhì)量要求較高。常用的PCR法靈敏度高，卻無(wú)法避免由此引發(fā)假陽(yáng)性結(jié)果的可能，且操作技術(shù)要求相對(duì)較高。有研究根據(jù)豬肺炎支原體(Mhp)的細(xì)胞溶質(zhì)蛋白P36設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，利用PCR法快速、成功地檢測(cè)出Mhp，靈敏度較高，可以檢測(cè)出0.735 ng的Mhp DNA[8]，并驗(yàn)證該方法具有很高的特異性，但由于試劑污染、擴(kuò)增產(chǎn)物污染等原因，避免不了出現(xiàn)假陽(yáng)性的現(xiàn)象[9]。而免疫熒光法檢測(cè)抗原相對(duì)簡(jiǎn)便易行，但受到熒光標(biāo)記物的本身光化學(xué)特點(diǎn)的限制，而出現(xiàn)不能反復(fù)觀察，熒光猝滅等問題，限制了其使用[10]。有研究報(bào)道，同步盲法試驗(yàn)結(jié)果顯示，MP ELISA檢測(cè)試劑盒批內(nèi)、批間產(chǎn)品陽(yáng)性結(jié)果的一致率均為100%,具有較好的準(zhǔn)確性及特異性[11],但其缺點(diǎn)是干擾因素太多，從加樣、預(yù)溫、洗板、顯色到比色步驟繁多，每一步控制不好都可能影響檢測(cè)結(jié)果[12]。趙巖等[13]利用核酸檢測(cè)與抗體檢測(cè)聯(lián)合方法分析MP感染情況，并提出肺泡灌洗液是MP DNA檢測(cè)最佳標(biāo)本類型。

本研究分離出MP菌株，特異性熒光定量PCR法鑒定分離株有明顯增殖，Western Blot結(jié)果也表明抗MP兔多抗可與分離株反應(yīng)，從而說(shuō)明分離株為MP。利用MP分離株純化后免疫小鼠，制備出19株特異性抗MP單克隆抗體，選取其中兩株(分別為MP-5和MP-19，均為IgG1型)效價(jià)最高的單抗作為膠體金試紙條的原材料。采用MP單抗成功研制出MP快速檢測(cè)膠體金試紙條。該試紙條在室溫保存或在4 ℃保存均可，穩(wěn)定性較好。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測(cè)限為20 ng。同時(shí)，分別利用膠體金試紙條和熒光定量PCR法對(duì)40份疑似MP感染患兒的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，膠體金試紙條檢測(cè)的特異度和靈敏度分別為88.2%和82.6%，表明研制的膠體金試紙條具有一定的檢測(cè)能力，而且與其他檢測(cè)方法相比，檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果判斷肉眼可見、保存運(yùn)輸方便，能夠?qū)σ伤芃P患者進(jìn)行初篩。Li等[14]利用MPP1抗原為識(shí)別抗原建立了免疫層析膠體金法，也獲得了較好的收益。

此外，本研究組裝的膠體金試紙條在臨床標(biāo)本檢測(cè)時(shí)，漏診2例，可能是咽拭子標(biāo)本中MP抗原低于試紙條的檢測(cè)限。同時(shí)，也出現(xiàn)4例假陽(yáng)性，可能原因是試紙條存在交叉現(xiàn)象。由于呼吸道感染病原體抗原種類有限，單抗交叉性鑒定不能夠包括所有呼吸道病原體，因此，還需進(jìn)一步優(yōu)化工藝，提高檢測(cè)靈敏度，為臨床早期診斷提供依據(jù)。

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Establishment and application evaluation of rapid detection method of Mycoplasma pneuomoniae

ZHANGJie1,2,HUJun1,3△,LIUYang1,3,LIYuan1,3

(1.MedicalCollege,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi710049,China;2.DepartmentofBloodTransfusion,AnkangMunicipalCentralHospital,Ankang,Shaanxi725000,China;3.CentralLaboratory,ShaanxiProvincialPeople′sHospital,Xi′an,Shaanxi710068,China)

ObjectiveTo prepare the specific monoclonal antibodies(mAb) of Mycoplasma pneumonia(MP) and to establish a colloidal gold rapid detection method of MP by using mAb.MethodsThe nasopharyngeal swab samples were collected from children patients with acute respiratory tract infection,separated and cultured and performed the MP identification,MP antigen was purified,mAb of MP was prepared,then the MP colloidal gold test strip was established by using MP mAb.The throat swab sample was collected from the patients with suspected MP infection and detected by using the fluorescent quantitative PCR and colloidal gold test strip.The detection results were observed and statistically analyzed.ResultsMP strain was successfully isolated and inactivated,the MP antigen was purified.The mouse was immunized by using this antigen,19 strians of mAb against MP were prepared by using the hybridoma technique.Among them,2 strains of mAb with high titer and good specificity(MP-5 and MP-19) were selected as the raw materials for preparing the MP colloidal gold rapid test strip.The lowest detection limit was 20 ng.The clinical samples were detected by using the MP colloidal gold rapid test strip and fluorescent quantitative PCR.The results showed that the sensitivity of MP colloidal gold rapid test strip by using this established method was 88.2% and its specificity was 82.6%.Conclusionspecific mAbs against MP is prepared and the colloidal gold rapid detection method is preliminarily established which provides the help for rapid diagnosis in the patients with MP infection.

Mycoplasma pneumonia;monoclonal antibody;colloidal gold immunochromatographic assay

張杰，男，副主任技師，主要從事臨床輸血工作及肺炎支原體血清學(xué)和病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究?！?/p>

,E-mail:hjj6562@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.008

A

1673-4130(2016)17-2379-03

2016-04-14

2016-06-28)