乙型肝炎病毒基因型耐藥檢測和臨床因素分析

張書鳳，華文浩，何艷群，丁曉燕，陳京龍

(首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院檢驗科　100015)

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·論著·

乙型肝炎病毒基因型耐藥檢測和臨床因素分析

張書鳳，華文浩△，何艷群，丁曉燕，陳京龍

(首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院檢驗科100015)

目的探討乙型肝炎病毒(HBV)耐藥的相關(guān)因素和臨床意義。方法回顧性分析該院2011～2013年的153例慢性乙型肝炎(CHB)患者的臨床資料，對已知4種核苷(酸)類似物拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋和替比夫定的8個病毒耐藥位點使用雙脫氧末端終止法(Sanger法)直接測序，檢測耐藥；統(tǒng)計分析病毒基因型耐藥的相關(guān)臨床因素，分析預(yù)后與耐藥的相關(guān)性。結(jié)果CHB患者共有47例(29.8%)出現(xiàn)了病毒基因型耐藥，常見的變異位點為204M-I(18例)、204M-V(8例)、181A-T(10例)、181A-V(5例)、180L-M(14例)。有家族史、HBeAg陽性，既往使用核苷(酸)類似物、基線丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)≥5倍患者病毒耐藥比例顯著增加，發(fā)生率分別為38.8%，34.8%，34.6%和50.0%。COX多因素回歸還發(fā)現(xiàn)HBV-DNA基因型耐藥增加進展為肝硬化的風險，OR值為4.704(95%CI：1.199～18.454)。結(jié)論Sanger法直接測序是HBV-DNA基因型耐藥的可靠方法。有乙型肝炎家族史、HBeAg陽性以及使用過核苷(酸)類似物、基線ALT≥5倍患者中病毒耐藥比例顯著增加；HBV-DNA基因型耐藥還增加進展為肝硬化的風險。

慢性乙型肝炎；病毒耐藥；雙脫氧末端終止法

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈全球性流行，我國尤為高發(fā)，2006年HBV感染率高達7.18%，現(xiàn)有約9 300萬慢性HBV感染者，約2 000萬為慢性乙型肝炎(CHB)患者。HBV感染是肝癌、肝硬化的重要危險因素[1-2]。由于核苷(酸)類似物能抑制HBV反轉(zhuǎn)錄酶的活性，但它們對HBV cccDNA無直接作用，需長期使用，在長時間的應(yīng)用過程中，HBV耐藥變異日益成為臨床關(guān)注的焦點[3]。HBV的耐藥常見類型之一為基因型耐藥，指HBV基因組出現(xiàn)某種特定的突變，這些突變點已通過體內(nèi)外實驗證實與耐藥密切相關(guān)[4-5]。目前在我國臨床范圍內(nèi)廣泛、長期使用的核苷(酸)類似物有拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋和替比夫定，一旦出現(xiàn)對上述藥物的基因型耐藥將會影響患者的治療策略[4-6]。然而對于HBV耐藥的相關(guān)因素尚不明確，因此本研究回顧性分析本院2011～2013年153例CHB患者的資料，對已知的8個病毒耐藥位點進行HBV-DNA測序檢測耐藥，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料收集2011～2013年于本院住院的153例診斷為CHB患者的臨床資料和血清標本，血清標本-80 ℃保存；患者在進行HBV-DNA基因型耐藥檢測前至少3個月未服用任何核苷(酸)類似物。153例CHB患者，男122例，女31例；年齡13～67歲，中位年齡38歲；CHB病史為1～30年，平均7年。既往使用核苷(酸)類似物(3個月以上)患者共127例；檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)≥5倍者90例，占58.8%；進展為肝硬化19例，肝癌1例；死亡3例。CHB診斷符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》[2]，并排除其他肝臟疾病，如自身免疫性肝炎合并丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒感染，原發(fā)性膽汁性肝硬化，血色素沉著，酒精性肝炎等。

1.2儀器與試劑血清標本離心使用IEC CL30離心機(Thermo公司)和5417R離心機(Eppendorf公司)。病毒核苷酸擴增儀為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的Veriti PCR儀。HBV耐藥檢測采用3730XL測序儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)及真空泵。

1.3檢測方法

1.3.1HBV-DNA核酸提取和擴增采用北京莊盟國際生物基因科技有限公司生產(chǎn)的病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒，第一輪PCR引物為P3與AP3。第二輪PCR引物為Xnp與Xanp。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、回收和純化后，送北京金諾銳杰基因科技有限公司測序。

1.3.2HBV耐藥測序測序采用基于引物延伸的雙脫氧末端終止法(Sanger法)直接測序。采用Vector NTI9.0軟件對測序結(jié)果進行耐藥位點分析。

2　結(jié)　　果

2.1HBV-DNA測序基因型耐藥和患者臨床因素相關(guān)性分析153例患者HBV-DNA測序檢測基因型耐藥成功率為100.0%，共有47例(30.7%)出現(xiàn)了病毒基因型耐藥，18例204M-I，8例204M-V，10例181A-T，5例181A-V，14例180L-M，2例236N-T，1例236A-T，205M-S、250M-I各1例，1例203M-V，1例202S-G。多位點突變患者14例，1例為3位點變異，其余均為2位點變異。拉米夫定耐藥率為63.8%(30例)，恩替卡韋耐藥率為59.6%(28例)，阿德福韋酯耐藥率34.0%(16例)，替比夫定耐藥率為30.0%(14例)。有家族史、乙型肝炎E抗原(HBeAg)陽性，既往使用核苷(酸)類似物、基線ALT≥5倍患者病毒耐藥比例顯著增加(P<0.05)，檢出率分別為38.8%、34.8%、34.6%和50.0%。其余不同組別患者HBV-DNA基因型耐藥檢出率，見表1。

表1　　HBV-DNA測序基因型耐藥和患者臨床因素相關(guān)性分析[(%)n/n]

表2　　肝硬化致病風險COX多因素回歸分析

2.2肝硬化致病風險COX多因素回歸分析COX多因素回歸發(fā)現(xiàn)HBV-DNA基因型耐藥增加了進展為肝硬化的風險，OR值為4.704(95%CI：1.199～18.454，P=0.026)；既往使用核苷(酸)類似物能減少發(fā)展為肝硬化的風險，OR值為0.268(95%CI：0.059～1.220，P=0.038)，其他具體因素和肝硬化的致病風險，見表2。

3　討　　論

CHB是全世界廣泛流行的一種傳染病，其最常用的抗病毒藥物是核苷(酸)藥物治療，但是核苷(酸)類似物長期使用易引起HBV耐藥突變，而HBV耐藥突變進一步影響核苷(酸)類似物療效，與慢性肝炎活動、病毒學突破密切相關(guān)[4-7]，因此HBV-DNA基因型耐藥檢測有著重要的臨床意義。目前國內(nèi)檢測HBV基因耐藥變異的方法主要有線性探針反向雜交基因芯片技術(shù)和DNA測序法等。二者費事費力，造價高，只能檢測已知的耐藥位點，不利于臨床普及，目前DNA測序法已成為HBV突變檢測的標準方法[8]。本文中耐藥DNA測序所用為Sanger法，該方法簡便、分辨率高、測序片段長、提供信息多、成功率高。本研究顯示，DNA測序成功率為100.0%，顯著高于戴晨陽等[9]和陳占國等[10]使用焦磷酸測序法的檢測成功率，后者分別為62.2%和78.7%；發(fā)現(xiàn)新的突變位點203M-V和205M-S，具體意義尚不明確。

本研究顯示檢測時既往使用核苷(酸)類似物的CHB患者耐藥率為34.6%，與徐東平等[11]報道的未經(jīng)選擇的乙型肝炎患者耐藥率相一致，而明顯低于文獻[9]報道的耐藥率(45.59%)。而蘇何玲等[12]報道HBV突變率僅為10.5%，考慮與本研究選擇的患者檢測時均未使用或中斷核苷(酸)類似物3個月以上有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)變異位點11個，最常見的變異位點為204M-I(18例)、204M-V(8例)、181A-T(10例)、181A-V(5例)、180L-M(14例)。拉米夫定耐藥位點檢出比例最高，達63.8%，與文獻[9-10]報道一致；但本研究中恩替卡韋耐藥位點檢出率為59.6%，顯著高于其他報道的檢出率，也和臨床上恩替卡韋耐藥率低相違背[11-13]?？赡芘c回顧性研究選擇的病例病情復(fù)雜有關(guān)，本研究中基線ALT≥5倍的患者比例達58.8%，其他文獻未報道基線轉(zhuǎn)氨酶情況。

HBV基因型耐藥的預(yù)測因素尚不明確，目前公認的僅為核苷(酸)類似物使用增加HBV基因型耐藥的概率，尤其以拉米夫定最高，其次為阿德福韋酯，恩替卡韋耐藥率最低[6,13]。本研究發(fā)現(xiàn)既往使用核苷(酸)類似物患者病毒耐藥比例顯著增加，和文獻[6,13]一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)有基線ALT≥5倍、HBeAg陽性、有家族史患者病毒耐藥比例顯著增加，檢出率分別為50.0%，34.8%和38.8%。ALT顯著增高是慢性肝炎活動的標志之一，考慮基因耐藥突變和肝炎活動有關(guān)[8]。有關(guān)家族史和HBV-DNA基因型耐藥的關(guān)系尚不明確，HBV家族性聚集可能與遺傳基因有關(guān)，從而出現(xiàn)HBV-DNA耐藥突變位點增加。榮海燕等[14]對131例正在使用核苷(酸)類似物的CHB患者使用基因芯片法進行HBV-DNA基因耐藥分析時發(fā)現(xiàn)，HBeAg陽性患者和HBV-DNA定量高者HBV基因型耐藥率顯著增高。但是，本研究并未發(fā)現(xiàn)以上結(jié)果，考慮與全部患者均停藥3個月以上進行檢測有關(guān)，并不像其他研究均在拉米夫定或阿德福韋酯治療過程中進行檢測分析。

HBV感染是肝癌、肝硬化的重要危險因素。COX多因素回歸分析還發(fā)現(xiàn)HBV-DNA基因型耐藥顯著增加進展為肝硬化的風險，OR值為4.704(95%CI：1.199～18.454，P=0.026)。HBV-DNA基因型耐藥導致抗病毒治療療效差，HBV-DNA長期處于高負荷狀態(tài)，而HBV-DNA高負荷是導致乙型肝炎肝硬化的重要原因[15]。HBV-DNA基因型耐藥涉及的突變位點多，其與肝硬化的關(guān)系尚待進一步研究。而檢測時HBV-DNA>106copy/mL并不增加肝硬化發(fā)病風險，OR為0.268(95%CI：0.059～1.220，P=0.451)，可能是通過以HBV-DNA基因型耐藥檢測為指導的治療，可使HBV-DNA病毒轉(zhuǎn)陰，肝炎活動得到控制，進而減少進展為肝硬化的風險。

本研究為回顧性研究，提示Sanger法直接測序是HBV-DNA基因型耐藥的可靠方法。此外，研究對象的選擇有隨機性，但所反映的臨床用藥情況更接近臨床實際情況，不僅限于文獻經(jīng)常報道的幾種常規(guī)形式。應(yīng)用HBV序列測定多位點耐藥突變檢測，有助于及時發(fā)現(xiàn)基因型病毒耐藥，而病毒基因型耐藥增加肝硬化的進展風險，檢驗結(jié)果有助于采取有效的干預(yù)措施，控制HBV-DNA負荷，改善預(yù)后。

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Drug resistance detection of virus genotype in hepatitis B and analysis of its clinical factors

ZHANGShufeng,HUAWenhao△,HEYanqun,DINGXiaoyan,CHENJinglong

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedBeijingDitanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100015,China)

ObjectiveTo explore the related factors of hepatitis B virus(HBV) drug resistance and their clinical significance.MethodsThe retrospective analysis was performed on the dinical data in 153 cases of CHB in our hospital during 2011-2013.The 8 viral drug resistance loci of 4 known nucleosides analogues lamivudine,adefovir ester,entecavir and telbivudine were performed the direct sequencing by using the double DNA end termination method(Sanger method);the related clinical factors of drug-resistant virus genotypes were statistically analyzed and the correlation between prognosis and drug resistance was analyzed.ResultsAmong 153 patients with CHB,47 cases(29.8%) appeared virus genotype drug-resistant,the common sites were 204M-I(18 cases),204M-V(8 cases),followed by 181A-T(10 cases),181A-V(5 cases),then 180L-M(14 cases).The proportion of viral drug resistance in the patients with family history,HBeAg positive,using the nucleotide analogues in the past and the baseline ALT≥5 times was significantly increased,the incidence rates were 38.8%,34.8%,34.6% and 50.0% respectively.The multivariable COX regression found that HBV-DNA genetic drug resistance increased the risk of progression to cirrhosis of the liver,theORvalue was 4.704(95%CI：1.199-18.454).Conclusionthe Sanger method for direct sequencing is reliable and accurate method of HBV-DNA genotype drug resistance.The proportion of viral drug resistance in the patients with a family history of hepatitis B,HBeAg positive,using nucleotide analogues and baseline ALT≥5 times is significantly increased;HBV-DNA genotype drug resistance also increases the risk of progression to cirrhosis of the liver.

chronic hepatitis B;viral drug resistance;double DNA end termination method

張書風，女，主管技師，主要從事感染免疫與微生物檢驗研究。△

，E-mail：dtjykhua@126.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.007

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1673-4130(2016)17-2376-03

2016-03-10

2016-06-18)