裸鼴鼠骨髓巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的建立及其功能的初步研究

程繼帥， 李 莉， 肖 邦， 趙善民， 林麗芳， 叢 薇，湯 球， 孫 偉， 余琛琳， 楊文靜， 崔淑芳（. 第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 上海 00433； . 第二軍醫(yī)大學(xué)教學(xué)保障處， 上海 00433）

裸鼴鼠骨髓巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的建立及其功能的初步研究

程繼帥1， 李 莉2， 肖 邦1， 趙善民1， 林麗芳1， 叢 薇1，湯 球1， 孫 偉1， 余琛琳1， 楊文靜1， 崔淑芳1
（1. 第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 上海 200433； 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)教學(xué)保障處， 上海 200433）

目的 建立一種裸鼴鼠骨髓巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法，并通過與小鼠骨髓巨噬細(xì)胞進(jìn)行比較研究其吞噬功能。方法 分離裸鼴鼠骨髓細(xì)胞，在含60 ng/mL巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）完全培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下，體外貼壁培養(yǎng)6～7 d，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)。裸鼴鼠骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)束后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測貼壁細(xì)胞表面抗原CD11b和F4/80的陽性率，鑒定骨髓巨噬細(xì)胞的純度； 采用異硫氰酸熒光素（FITC）-dextran根據(jù)熒光強(qiáng)度比較裸鼴鼠和ICR小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的吞噬功能。 結(jié)果 通過本方法獲得的貼壁細(xì)胞具有典型的巨噬細(xì)胞的形態(tài)特征，且細(xì)胞表面抗原CD11b和F4/80的陽性率均高于80%； 裸鼴鼠與ICR小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的吞噬率分別為99.87%±0.13%和88.79%±0.90%。結(jié)論 本文建立的方法是一種簡單實(shí)用的體外分離培養(yǎng)裸鼴鼠骨髓巨噬細(xì)胞的方法，且能夠獲得高純度、高活性的巨噬細(xì)胞。裸鼴鼠骨髓巨噬細(xì)胞的吞噬功能高于小鼠骨髓巨噬細(xì)胞。

裸鼴鼠； 骨髓巨噬細(xì)胞； 分離培養(yǎng)； 功能

裸鼴鼠是一種特別的嚙齒類動(dòng)物， 具有抗衰老、抗病毒、抗腫瘤等特性。目前， 裸鼴鼠生物學(xué)特性以及抗衰老、抗腫瘤、抗病毒相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制一直是科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)［1］。研究［2］表明，15%的腫瘤是由病毒感染引起的，而某些病毒的長期感染能夠?qū)е聶C(jī)體免疫系統(tǒng)功能的紊亂。巨噬細(xì)胞是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等重要作用［3］。然而由機(jī)體組織器官獲取的巨噬細(xì)胞量較少，且巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群，在適宜的條件下僅能夠生活2～3周，難以長期生存，多做原代培養(yǎng)，而骨髓造血干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化可得到大量的巨噬細(xì)胞［4］。因此，裸鼴鼠骨髓巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的建立是其抗病毒、抗腫瘤特性研究的重要基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)建立了一種簡單實(shí)用的裸鼴鼠骨髓巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法，并檢測其吞噬功能，為其抗病毒、抗腫瘤特性的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡清潔級雄性ICR小鼠3只， 購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［SCXK（滬）2012—0002］； 12～16月齡普通級雄性裸鼴鼠6只， 由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖［5］。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要儀器 超凈工作臺（YJ-1450B，蘇州金燕凈化設(shè)備廠）、恒溫干燥箱（D-6450，Heraeus）、三氣培養(yǎng)箱（INCO246med， Memmert公司， 德國）、流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur， BD公司， 美國）等。1.2.2 主要試劑 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子（GMCSF， Peprotech， 美國）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（MCSF， Peprotech， 美國）、高糖DMEM（H-DMEM，Gibco，美國）、低糖DMEM（L-DMEM，Gibco，美國）、胎牛血清（Gibco，美國）、紅細(xì)胞裂解液（生工生物科技有限公司）、PE-CD11b、PE-F4/80 （Biolegend，美國）、異硫氰酸熒光素（FITC）-Dextran（Sigma，美國）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞準(zhǔn)備 參照文獻(xiàn)方法分離培養(yǎng)ICR小鼠骨髓巨噬細(xì)胞［6］。取成年裸鼴鼠，脫頸椎法處死，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡2～3 min，移入超凈臺，無菌條件下取其兩后肢，剝離皮膚和肌肉，分離股骨和脛骨，去掉兩端軟骨組織，1 mL注射器輕輕插入骨髓腔，用完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，制成單細(xì)胞懸液［7］。離心后棄上清，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，補(bǔ)加完全培養(yǎng)基終止裂解，離心后棄上清，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，37 ℃ 體積分?jǐn)?shù)3%O25%CO2及92%N2條件下培養(yǎng)8～12 h。收集上清，離心后棄上清，分別用含60 ng/mL M-CSF的H-DMEM 和L-DMEM重懸細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)6～7 d。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)特征。

1.3.2 骨髓巨噬細(xì)胞的鑒定 細(xì)胞體外誘導(dǎo)結(jié)束后，棄上清，PBS洗滌后，用胰酶消化細(xì)胞，L-DMEM終止消化，離心棄上清，PBS洗滌后，室溫避光分別孵育PE-CD11b和PE-F4/80，PBS洗滌后，PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.3.3 骨髓巨噬細(xì)胞吞噬功能的檢測 細(xì)胞體外誘導(dǎo)結(jié)束后，棄上清，PBS洗滌后，用胰酶消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)基終止消化，離心棄上清，PBS洗滌后，室溫避光孵育FITC-Dextran，PBS洗滌后，PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，同時(shí)以ICR小鼠骨髓巨噬細(xì)胞為對照。

2 結(jié)果

2.1 骨髓巨噬細(xì)胞的形態(tài)特征

細(xì)胞體外誘導(dǎo)過程中， 顯微鏡下可觀察到: 誘導(dǎo)48 h內(nèi)， 細(xì)胞形仍多為圓形， 與誘導(dǎo)前相比差異不大；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長， 細(xì)胞狀態(tài)趨于穩(wěn)定， 細(xì)胞凋亡減少； 誘導(dǎo)7 d時(shí)， 有些細(xì)胞呈放射狀， 有許多偽足和突起。相較于高糖培養(yǎng)基，細(xì)胞于低糖培養(yǎng)基中的生活狀態(tài)較好，細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定且凋亡少（圖1）。

2.2 骨髓巨噬細(xì)胞鑒定

流式細(xì)胞術(shù)檢測表明: 使用上述方法獲得的貼壁細(xì)胞表面抗原CD11b陽性率為84.51%±0.83%，F(xiàn)4/80的陽性率為82.41%±1.16%， 均高于80%， 說明采用該方法可以獲得較高純度的巨噬細(xì)胞（圖2）。

2.3 裸鼴鼠與ICR小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測表明， 使用上述方法獲得的裸鼴鼠骨髓巨噬細(xì)胞的吞噬率為99.87%±0.13%（圖3），ICR小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的吞噬率為88.79%±0.90%（圖3）。說明相比小鼠骨髓巨噬細(xì)胞，裸鼴鼠骨髓巨噬細(xì)胞的吞噬功能較強(qiáng)（圖4）。

圖 1 裸鼴鼠骨髓巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài)

3 討論

圖 2 裸鼴鼠骨髓巨噬細(xì)胞純度鑒定

圖 3 ICR 小鼠骨髓巨噬細(xì)胞表面抗原CD11b檢測

圖 4 裸鼴鼠骨髓巨噬細(xì)胞表面抗原F4/80檢測

裸鼴鼠于1967年首次被Jarvis引入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行科學(xué)研究，之后不斷有科學(xué)家將裸鼴鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究［8］。由于地理環(huán)境的差異，國內(nèi)學(xué)者對裸鼴鼠的研究很少，僅有個(gè)別單位與國外研究人員合作開展相關(guān)的研究［9］。本實(shí)驗(yàn)室引入裸鼴鼠后，對其生物學(xué)特性展開了一系列研究［10-14］。巨噬細(xì)胞作為一種重要的免疫細(xì)胞，具有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。巨噬細(xì)胞在許多疾病中發(fā)揮著重要的作用，特別是在炎癥性疾病的發(fā)病過程以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［15， 16］。而裸鼴鼠具有抗病毒、抗腫瘤的特性，因此本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行裸鼴鼠巨噬細(xì)胞的研究，以期為人類炎性疾病和腫瘤的防治提供新的思路。

裸鼴鼠脾淋巴細(xì)胞中巨噬細(xì)胞的比例低于5%，分離腹腔巨噬細(xì)胞時(shí)易分離出透明的粘性物質(zhì)（本實(shí)驗(yàn)室檢測數(shù)據(jù)，待發(fā)表），而M-CSF是一種具有譜系特異性的細(xì)胞因子，對單核細(xì)胞的增殖、分化及維持活性具有重要作用，常被用作造血干細(xì)胞增殖分化為巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子。因此，本文所建立的裸鼴鼠巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法選用M-CSF誘導(dǎo)骨髓造血干細(xì)胞分化為骨髓巨噬細(xì)胞， 以期建立一種簡單使用的裸鼴鼠巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)方法。

目前，巨噬細(xì)胞的鑒定通常包括形態(tài)學(xué)觀察、吞噬功能的檢測和免疫學(xué)標(biāo)志檢測［17］。本實(shí)驗(yàn)中，M-CSF誘導(dǎo)分化完成后，通過倒置顯微鏡觀察貼壁細(xì)胞的形態(tài)特征，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原CD11b和F4/80鑒定并檢測細(xì)胞純度，同時(shí)使用FITC標(biāo)記的葡聚糖比較裸鼴鼠和小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的吞噬功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：采用該方法獲得的貼壁細(xì)胞呈放射狀，多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)偽足和突觸，具有巨噬細(xì)胞典型的形態(tài)特征，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，獲得細(xì)胞的CD11b和F4/80的陽性率均高達(dá)80%以上，巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測結(jié)果表明，裸鼴鼠骨髓巨噬細(xì)胞的吞噬率高于小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的吞噬率。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所建立的M-CSF體外誘導(dǎo)骨髓造血干細(xì)胞分化的方法是一種簡單實(shí)用的體外分離培養(yǎng)裸鼴鼠骨髓巨噬細(xì)胞的方法，經(jīng)形態(tài)學(xué)、功能學(xué)和免疫學(xué)鑒定，得到的貼壁細(xì)胞為高純度、高活性的巨噬細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)［18， 19］結(jié)果表明，polyI:C分別刺激裸鼴鼠和小鼠后，小鼠的組織器官產(chǎn)生顯著的病理變化，而裸鼴鼠的組織器官未表現(xiàn)出顯著的病理變化，組織內(nèi)自噬體增多，NF-κB信號通路關(guān)鍵基因NKRF的表達(dá)下降，證實(shí)裸鼴鼠具有較強(qiáng)的抗polyI:C感染的能力，且polyI:C刺激后裸鼴鼠自噬水平顯著升高，并且polyI:C刺激后裸鼴鼠NF-κB信號通路的活化被抑制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明裸鼴鼠巨噬細(xì)胞可能在機(jī)體病毒感染過程中能夠更加高效地清除病毒以及機(jī)體損傷處組織和細(xì)胞的壞死碎片。盡管眾多數(shù)據(jù)證明裸鼴鼠的免疫系統(tǒng)與其抗病毒、抗腫瘤特性相關(guān)，但是免疫細(xì)胞和免疫組織在抵抗病毒侵染和抑制腫瘤發(fā)生過程中是如何相互作用的機(jī)制我們尚不明確。目前，裸鼴鼠免疫系統(tǒng)的研究處于起步階段，仍有許多的未解之謎需要更進(jìn)一步的研究。

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Establishment of Method for Separation， Cultivation of Bone Marrow Macrophage in Naked Mole Rats and Preliminary Research on Function

CHENG Ji-shuai1， LI Li2， XIAO Bang1， ZHAO Shan-min1， LIN Li-fang1， CONG Wei1，TANG Qiu1， SUN Wei1， YU Chen-lin1， YANG Wen-jing1， XU Chen1， CUI Shu-fang1
（1. Laboratory Animal Center； 2. Teaching Guarantee Department，Second Military University， Shanghai 200433， China）

Objective To establish the method for the primary culture of bone marrow macrophage in naked mole rats and study the phagocytosis compared with mice. Method The bone marrow cells from the hing leg of naked mole rats were detached. The cells were induced by 60 ng/mL Macrophage colony-stimulating factor （M-CSF） and cultured for 6～7 days in vitro. During the culture， the cell was observed in microscope. After induced， the flow cytometry was conducted to detect the purity of macrophage and the phagocytosis of macrophage with mouse as control. Result Through this method，the adherent cells with typical morphological characteristics were obtained and the positive rate of the cell surface antigen F4/80 and CD11b were higher than 80%. The phagocytosis rate of naked mole rats bone marrow macrophage was 99.87%±0.13%， but the ICR mice was 88.79%±0.90%. Conclusion This method is simple and practical for separation and culture of highly purified and functional naked mole rats bone marrow macrophage in vitro. It indicates that phagocytosis of naked mole rats bone marrow macrophage is higher than that of mice.

Naked mole rat； Bone marrow macrophage； Separation and cultivation； Function

Q95-33

A

1674-5817（2016）01-0072-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.01.015

2015-12-14

國家科技支撐計(jì)劃（2015BAI09B02）； 上海市科委基金（14140900200）與上海市科委基金（15140900200）聯(lián)合資助

程繼帥（1991-）， 女， 碩士生， 研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化及人類疾病動(dòng)物模型研究。E-mail: handsome_91@163.com

崔淑芳， 教授， 研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化及人類疾病動(dòng)物模型研究。E-mail: youngstar_sf@163.com