鈣蛋白酶抑制蛋白基因過(guò)表達(dá)Balb/C小鼠的繁育及鑒定

虞　勇， 李明輝， 劉桂劍， 李冰玉， 鄒云增， 陳瑞珍

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科，上海市心血管病研究所中心實(shí)驗(yàn)室，上?！?00032

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·技術(shù)與方法·

鈣蛋白酶抑制蛋白基因過(guò)表達(dá)Balb/C小鼠的繁育及鑒定

虞勇， 李明輝， 劉桂劍， 李冰玉， 鄒云增， 陳瑞珍*

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科，上海市心血管病研究所中心實(shí)驗(yàn)室，上海200032

目的： 建立鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin, CAST)基因過(guò)表達(dá)Balb/C小鼠的培育方法，并探討堿性裂解液提取基因組DNA在子代鼠基因型鑒定中的價(jià)值。方法： 將雄性C57BL/6-CAST+/-轉(zhuǎn)基因小鼠與雌性Balb/C野生型小鼠雜交，將雄性CAST+/-雜合子代小鼠與雌性Balb/C野生型子代小鼠雜交，連續(xù)雜交至消除C57BL/6小鼠遺傳背景。取子代小鼠鼠尾組織，采用堿性裂解液提取基因組DNA，PCR法擴(kuò)增CAST基因片段，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。采用柯薩奇B3病毒(CVB3)感染Balb/C-CAST-/-小鼠以建立急性病毒性心肌炎小鼠模型。結(jié)果： C57BL/6-CAST+/-轉(zhuǎn)基因小鼠與雌性Balb/C野生型小鼠連續(xù)雜交10代可消除C57BL/6小鼠遺傳背景。采用堿性裂解液提取的基因組DNA數(shù)量、純度能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要，且產(chǎn)物大小與目的片段一致。成功建立Balb/C-CAST-/-基因型小鼠急性病毒性心肌炎模型。結(jié)論： 成功建立Balb/C-CAST基因過(guò)表達(dá)小鼠，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)；堿性裂解液提取基因組DNA簡(jiǎn)便、高效，值得推廣。

鈣蛋白酶；鈣蛋白酶抑制蛋白；柯薩奇B3病毒；轉(zhuǎn)基因；基因型鑒定

Calpain(鈣蛋白酶)是主要存在于細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子依賴(lài)性半胱氨酸蛋白酶，激活后能通過(guò)有限酶切割其底物，參與包括心血管疾病等的病理過(guò)程[1-2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，calpain在急性病毒性心肌炎(VMC)發(fā)病過(guò)程中被激活，介導(dǎo)柯薩奇B3病毒(CVB3)感染導(dǎo)致的心肌損傷。而calpain抑制劑表現(xiàn)出相應(yīng)的器官保護(hù)作用[4]。

Calpain抑制蛋白(calpastatin, CAST)是calpain的內(nèi)源性抑制劑。在心肌細(xì)胞內(nèi)，兩者共定位。CAST負(fù)向調(diào)控calpain的活性，在體內(nèi)及體外過(guò)表達(dá)CAST均可抑制calpain活性[5]。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型常用于致病機(jī)制的探討及藥物的篩選。2011年本研究室從加拿大西安大略大學(xué)病理生理學(xué)系彭天慶教授實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了C57BL/6-CAST基因過(guò)表達(dá)小鼠。本研究通過(guò)C57BL/6-CAST基因過(guò)表達(dá)小鼠建立有穩(wěn)定Balb/C遺傳背景的CAST基因過(guò)表達(dá)模型，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1主要材料及試劑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6-CAST+/-雜合子轉(zhuǎn)基因小鼠雌、雄各1只(5～6周齡)，由加拿大西安大略大學(xué)病理生理學(xué)系彭天慶教授實(shí)驗(yàn)室；Balb/C雌性野生型小鼠(5～6周齡)購(gòu)于復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。試劑：2×PCR Master mix、DNA Marker購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；小鼠心肌肌鈣蛋白(cTnI) ELISA試劑盒購(gòu)自上海威奧生物科技有限公司。 CVB 3(Nancy株，由本實(shí)驗(yàn)室保存復(fù)制)，在Vero細(xì)胞中復(fù)制?；蚪MDNA裂解液配制：溶液A成分為25 mmol/L NaOH、0.2 mmol/L EDTA；溶液B成分為40 mmol/L Tris-HCl(pH值5.0)。小鼠組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。儀器：美國(guó)Thermo Fisher公司高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)；美國(guó)Bio-Rad公司PCR儀、電泳槽、ChemiDocMPSystem 全能型成像系統(tǒng)；美國(guó)Eppendorf紫外分光光度計(jì)。1.2Balb/C遺傳背景CAST基因過(guò)表達(dá)小鼠的培育轉(zhuǎn)基因小鼠飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，光照及黑暗每隔12 h交替，恒溫、恒濕，自由飲水、進(jìn)食，自然交配。采用1雄配3雌合籠的方法將雄性C57BL/6-CAST+/-小鼠與雌性Balb/C近交系小鼠交配繁殖。F1代子鼠在3周齡時(shí)與親代分離，提取鼠尾DNA，用PCR方法鑒定并篩選CAST基因表達(dá)陽(yáng)性小鼠。將雄性CAST基因表達(dá)陽(yáng)性小鼠與雌性Balb/C近交系小鼠交配繁殖，獲得的F2代雄性CAST+/-小鼠繼續(xù)與雌性Balb/C近交系小鼠交配、繁殖，連續(xù)交配至獲得遺傳背景穩(wěn)定的Balb/C-CAST基因過(guò)表達(dá)小鼠。具體繁殖方案見(jiàn)圖1。

圖1　Balb/C遺傳背景CAST基因過(guò)表達(dá)小鼠繁育方法

1.3堿性裂解液提取子代小鼠基因組DNA及PCR鑒定子代小鼠斷奶打耳號(hào)標(biāo)記后，剪取1～2 mm鼠尾，采用堿性裂解液法提取DNA。將鼠尾放入1.5 mL EP管，加入50 μL溶液A，于金屬浴上95℃孵育40 min，室溫放置1.5 h，再加入50 μL溶液B，充分震蕩混合，4℃ 10 000×g離心5 min，放4℃冰箱待用?；蚪MDNA提取試劑盒(北京天根)提取DNA按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

基因組DNA擴(kuò)增：CAST基因引物上游為5′-GTT GGC TTA GGC TGC TTT TCG T-3′；下游為5′-CCA GAC TCC GTG ACA CCC CTT-3′。目的基因片段長(zhǎng)度為518 bp。PCR反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix 12.5 μL，Primer(25 μmol/L)0.4 μL，DEPC-H2O 10.1 μL，cDNA 2 μL；總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件：(1)預(yù)變性94℃，3 min；(2)變性94℃，30 s；(3)退火60℃,30 s；(4)延伸72℃，60 s；(5)重復(fù)步驟(2)～(4)40次；(6)延伸72℃，10 min；(7)4℃保存。

瓊脂糖凝膠電泳:用0.5×TBE緩沖液配置1%瓊脂糖凝膠，加熱融化，待溫度降至60℃左右加入溴化乙啶(EB)1～2 μL(10 mg/mL)，混勻后鋪板，室溫放置30 min，待凝膠完全凝固后放入電泳槽。上樣25 μL PCR樣本+5 μL 6×Loading Buffer(共30 μL)，電壓90 V，電泳40 min，使用Bio-Rad凝膠成像儀進(jìn)行凝膠掃描。Eppendorf紫外分光光度計(jì)檢測(cè)示各樣本濃度為600～800 ng/mL，D260/280值為1.6～1.8。

1.4Balb/C-CAST-/-小鼠VMC模型的建立第10代同窩3～4周齡、基因型鑒定為CAST-/-的雄性小鼠腹腔注射100半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染量(TCID50)的CVB 3(0.1 mL/只)。對(duì)照組腹腔注射Eagle液(0.1 mL/只)，兩組小鼠正常飼養(yǎng)7 d時(shí)斷頸處死，取心肌組織在10%中性甲醛中固定，蘇木精-伊紅(H-E)染色觀察心肌組織病變程度；取小鼠外周血分離血清，ELISA法檢測(cè)外周血中cTnI含量。

2　結(jié)　果

2.1轉(zhuǎn)基因小鼠造模結(jié)果結(jié)果(圖2)表明：經(jīng)過(guò)連續(xù)10代以上雜交，得到遺傳背景穩(wěn)定的Balb/C-CAST小鼠。

圖2　不同遺傳背景CAST基因過(guò)表達(dá)小鼠

A: C57BL/6-CAST基因過(guò)表達(dá)小鼠;B: 雜交F1代CAST基因過(guò)表達(dá)小鼠;C: 雜交F10 Balb/C-CAST基因過(guò)表達(dá)小鼠

2.2堿性裂解液法及試劑盒提取基因組DNA效果的比較結(jié)果(圖3)表明：堿性裂解液提取的DNA與DNA提取試劑盒完全符合。

圖3　雜交F10 Balb/C-CAST小鼠不同基因型

1～5：堿性裂解液法提取DNA；6：DNA marker; 7～11: 試劑盒提取DNA. 1,7:Balb/C-CAST+/-；2,8：Balb/C-CAST+/-；3,9： Balb/C-CAST-/-；4,10： Balb/C-CAST-/-；5，11： Balb/C-CAST+/-

2.3Balb/C-CAST-/-基因型小鼠VMC模型的建立同窩基因型鑒定為CAST-/-的3周齡雄性小鼠感染CVB 3造模后7 d，可見(jiàn)心臟表面有點(diǎn)狀、片狀白斑(圖4)。H-E染色(圖5)顯示：心肌組織可見(jiàn)明顯炎性病灶(炎性細(xì)胞浸潤(rùn))，心肌纖維排列紊亂，局部鈣化。與對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠外周血cTnI濃度顯著上升[(5.87±3.03) ng/mLvs(0.23±0.24) ng/mL,P<0.01]。

圖4　VMC小鼠心臟外觀

圖5　VMC小鼠心肌組織H-E染色

A～C:對(duì)照組；D～F: 模型組. Original magnification:×10(A,D); ×100(B,E); ×400(C,F)

3　討　論

Calpain是多種疾病的潛在分子治療靶點(diǎn)[6-7]。前期研究[3]已證實(shí)，calpain在VMC發(fā)病過(guò)程中被激活，介導(dǎo)CVB 3直接感染導(dǎo)致的心肌損傷。CAST是calpain的內(nèi)源性抑制劑，通過(guò)其C末端的Ⅰ、Ⅳ結(jié)構(gòu)域結(jié)合calpain，抑制calpain活性；同時(shí)通過(guò)其特定的氨基酸序列調(diào)節(jié)Ca2+通道的啟閉，進(jìn)而調(diào)控calpain活性[8]。

Balb/C小鼠是公認(rèn)的VMC模型動(dòng)物，而C57BL/6-CAST基因過(guò)表達(dá)小鼠因其C57BL/6小鼠遺傳背景導(dǎo)致的免疫偏離不適合用作VMC模型[9]。因此，本研究將C57BL/6-CAST基因過(guò)表達(dá)小鼠與Balb/C小鼠雜交，以消除C57BL/6遺傳背景。一般認(rèn)為，通過(guò)至少10代的雜交，同類(lèi)系基本可以去除C57BL/6小鼠遺傳背景；8代及以上代數(shù)的種群小鼠，可基本認(rèn)為遺傳背景一致[10]。本研究以第11代同窩3周齡基因型鑒定為Balb/C-CAST-/-的雄性小鼠感染CVB 3制作VMC小鼠模型，5只小鼠造模成功。

本研究采用堿性裂解液裂解法提取DNA，所用試劑均為常規(guī)化學(xué)試劑，不需用蛋白酶K，DNA得率較高、成本低廉；不使用酚、氯仿等試劑，不污染環(huán)境；不需要?jiǎng)驖{操作，避免交叉污染；鑒定結(jié)果與試劑盒提取的DNA一致。此外，使用堿裂解法提取DNA能節(jié)約實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)，尤其節(jié)約大批量小鼠基因型鑒定所需費(fèi)用。本研究室自2012年起使用該方法對(duì)轉(zhuǎn)基因/基因敲除小鼠進(jìn)行基因型鑒定，取得了穩(wěn)定、可靠的鑒定結(jié)果，證明其是一種高效、低成本的解決方案，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要。

綜上所述，本研究成功建立Balb/C-CAST基因過(guò)表達(dá)小鼠，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)；堿性裂解液提取基因組DNA高效、可靠、低成本，值得推廣。

[1]Ono Y, Sorimachi H. Calpains:an elaborate proteolytic system[J]. Biochim Biophys Acta, 2012,1824(1):224-236.

[2]Inserte J, Hernando V, Garcia-Dorado D. Contribution of calpains to myocardial ischaemia/reperfusion injury[J].Cardiovasc Res, 2012, 96(1):23-31.

[3]李明輝,汪云開(kāi),虞勇，等.急性病毒性心肌炎小鼠心肌中Calpain mRNA表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究[J].中國(guó)分子心臟病學(xué)雜志, 2009, 9(5):277-281.

[4]Li X, Li Y, Shan L, et al. Over-expression of calpastatin inhibits calpain activation and attenuates myocardial dysfunction during endotoxaemia[J]. Cardiovasc Res, 2009, 83(1):72-79.

[5]Campbell RL, Davies PL. Structure-function relationships in calpains[J]. Biochem J, 2012, 447(3):335-351.

[6]Pietsch M, Chua KC, Abell AD. Calpain:attractive targets for the development of synthetic inhibitors[J]. Curr Top Med Chem, 2010, 10(3):270-293.

[7]Parameswaran S, Sharma RK. High molecular weight calmodulin-binding protein:20 years onwards-a potential therapeutic calpain inhibitor[J]. Cardiovasc Drugs Ther,2012, 26(4):321-330.

[8]Saud ZA, Minobe E, Wang WY, et al. Calpastatin binds to a calmodulin-binding site of cardiac Cav1.2 Ca2+channels[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 364(2):372-377.

[9]蔣正剛,徐薇,王纓,等.柯薩奇病毒B3型誘導(dǎo)的免疫偏離與心肌炎發(fā)病關(guān)系的研究[J].微生物與感染,2007,2(1):7-12.

[10]Wong GT. Speed congenics: applications for transgenic and knock-out mouse strains[J]. Neuropeptides, 2002, 36(2-3):230-236.

[本文編輯]葉婷， 賈澤軍

Breeding and identification of calpastatin gene overexpression in Balb/C mice

YU Yong, LI Ming-hui, LIU Gui-jian, LI Bing-yu, ZOU Yun-zeng, CHEN Rui-zhen*

Laboratory of Cardiovascular Disease Research Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

Objective： To establish breeding methods of calpastatin (CAST)gene overexpression in genetic background of Balb/C mice, and to investigate the application value of alkaline lysis solution extracted genomic DNA in genotyping.Methods： The C57BL/6-CAST+/-male mice were hybridized with Balb/C wild type female mice. In the filial generations,CAST+/-heterozygous male mice were hybridized with Balb/C wild type female mice, continuous hybridization until C57BL/6 genetic background was removed. The genomic DNA was extracted from mice tails, and CAST gene fragment was amplified by PCR, the results were identified by agarose gel electrophoresis. The Balb/C-CAST-/-mice were infected with coxsakievirus(CVB3)to establish the mouse model of acute viral myocarditis.Results： The C57BL/6 genetic background can be removed by the method of C57BL/6- CAST+/-mice countinously hybridized with Balb/C wild type female mice for 10 generations. The alkaline lysis solution extracted genomic DNA amount, purity can fulfill the needs of following experiments, and the sizes were accordance with target fragment. The Balb/C-CAST-/-micemodel of acute viral myocarditis was succesfully established.Conclusions： The Balb/C-CAST gene overexpression transgenic mice is establishes the foundation for following experiments, the use of alkaline lysis solution to extract genomic DNA is easy, effective, which is worth for promotion.

calpain; calpastatin; coxsakie virus group B type3; transgenic; genotyping

2016-02-03[接受日期]2016-06-04

國(guó)家自然科學(xué)基金(31070786). Supported by National Natural Science Foundation of China(31070786).

虞勇，主管技師. E-mail: yu.yong1@zs-hospital.sh.cn

Corresponding author).Tel: 021-64041990-8543,E-mail: chen.ruizhen@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160117

R 542.2+1

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