膜芯片快速診斷HBV基因型和耐藥性方法的建立*

唐曙明，李愛敏，陳海霞，楊自華

（深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳518020）

根據(jù)乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）全基因核甘酸序列異源性≥8%，或S基因區(qū)核甘酸序列異源性≥4.2%的標(biāo)準(zhǔn)，HBV可分為A～H 8個基因型[1]。不同HBV基因型具有不同的地理區(qū)域性分布特征，在我國流行的HBV基因型主要有B、C、D三種，北方地區(qū)以C型為主，約占81.6%，南方地區(qū)則以B、C型為主[2]。不同HBV基因型在致病性和病毒學(xué)特性上存在明顯差異，C、D基因型較B基因型具有更強的致病能力，更容易導(dǎo)致活動性肝病和肝細(xì)胞癌[3]。隨著拉米夫定（LAM）、阿德福韋酯（ADV）、恩替卡韋（ETV）、替比夫定（LdT）等核苷類抗HBV藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，HBV耐藥的問題日益突出，嚴(yán)重地影響了疾病的轉(zhuǎn)歸。因此，建立簡便、快速、敏感、高通量的HBV基因分型和耐藥性檢測方法對HBV感染的診斷、治療、預(yù)后判斷和流行病學(xué)分析具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 HBV B、C、D基因型標(biāo)準(zhǔn)株；腺病毒ATCC VR-1079AS/RB（Adenovirus,ADV）、人乳頭瘤病毒ATCC VR-2237（human papillomavirus，HPV）和單純皰疹病毒ATCC VR-1544（herpes simplex virus，HSV）標(biāo)準(zhǔn)株由亞能生物科技有限公司提供，11種標(biāo)準(zhǔn)菌株（包括大腸埃希菌、肺炎鏈球菌、綠膿假單胞菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、痢疾桿菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌）從中國生物制品檢定所購入，187例HBV DNA陽性患者（103～109copies/ml）血清樣本來自本院2012年3月-2012年7月門診和住院患者。

1.1.2 儀器與試劑 ABI 9700 PCR擴增儀購于美國ABI公司，電泳儀購于北京六一儀器廠，圖像分析系統(tǒng)為BIO-RAD公司GEL DOC 2000，分子雜交箱購自韓國FINE PCR公司，HBV核酸定量檢測及提取試劑盒購于上?？迫A公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 吸取100μl樣本處理液A于0.5ml離心管中，再加入100μl待檢血清，振蕩混勻，13 000 r/min離心10min，棄上清。加入25μl DNA提取液，震蕩數(shù)秒充分溶解沉淀，2 000 r/min離心30 s。100℃干浴10min，13000 r/min離心10min備用。11種標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)傳代培養(yǎng)后，提取DNA備用。

1.2.2 引物與探針設(shè)計 用DNAMAN軟件對GeneBank中HBV的序列數(shù)據(jù)進行多重比對，于HBV基因保守區(qū)設(shè)計11條特異性探針分別檢測HBV-B、C、D和常見耐藥突變(rtL180M、rtA181V、rtM204V/I、rtV207I、rtN236T)。另設(shè)1條通用探針作為內(nèi)控點（內(nèi)對照），以監(jiān)測整個實驗過程的有效性，探針序列見表1。

選擇2對保守區(qū)片段為擴增引物，其中分型引物為：Prime5'：TCGTGTACAGGCGG，Prime3'：ACCAC TGAACAAAT，擴增片段長510 bp；耐藥引物為：Prime5'：GAGTCTAGACTCGTGGTG，Prime3'：ATTGA TTGGAAAGT，擴增片段長742 bp。引物的5'用生物素進行標(biāo)記，引物和探針由上海生工公司合成。

1.2.3 PCR擴增 在25μl反應(yīng)體系中，dNTP混合物的終濃度為0.2 mmol/L，引物的終濃度均為0.4μmol/L，DNA模板20 ng，Taq DNA聚合酶2.5U。置于PCR儀上按下列條件擴增：50℃3min，93℃預(yù)變性6 min，然后按93℃30 s→58℃40 s→72℃45 s擴增，10個循環(huán)；93℃30 s→56℃40 s→72℃45 s擴增，10個循環(huán)；93℃30 s→55℃40 s→72℃45 s擴增，25個循環(huán)，最后72℃延伸7min。取5μl PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4 膜芯片制備 尼龍膜浸入5% EDAC 20 min，純水洗膜，晾干。探針稀釋液（5μm/L）點樣于膜條上，晾干后，浸于0.1mol/L NaOH作用3min，純水洗膜，晾干，室溫儲藏備用。

1.2.5 雜交與顯色 將制備好的膜條編號后放入15ml雜交管中，加入擴增產(chǎn)物和6ml雜交緩沖液（2×SSC、0.1%SDS）置于沸水浴10min，放入已預(yù)熱的雜交箱中，57℃雜交1.5 h。取出膜條，移至裝有洗液（0.5×SSC、0.1%SDS）并已預(yù)熱至57℃的50ml管中，于57℃輕搖洗滌15min。取出膜條，按雜交緩沖液：POD=2 000∶1配制孵育液，室溫輕搖孵育30 min，棄去孵育液。用雜交緩沖液室溫輕搖洗2次，每次5min。用檸檬酸緩沖液（0.1mol/L）室溫洗膜2 min，同時配制顯色液（19m l0.1mol/L檸檬酸鈉、1 ml 2mg/ml TMB、10μl 3%過氧化氫H2O2），將膜條浸泡于顯色液中避光顯色10～15min觀察結(jié)果。

1.2.6 結(jié)果判讀 膜條在內(nèi)控點（CC）位置應(yīng)出現(xiàn)藍(lán)色斑點，提示本次雜交、顯色正常工作；其他出現(xiàn)的藍(lán)色斑點表示為相應(yīng)的HBV基因型和耐藥突變類型。

表1 HBV基因分型與耐藥突變探針列表

1.2.7 最低檢出限確定 從187例臨床HBV陽性分離株中隨機抽取38例樣本和HBV-B、C、D基因型標(biāo)準(zhǔn)株同步用上?？迫AHBV核酸定量試劑盒定量，然后進行系列稀釋，分別制成104、103和102copies/ml濃度稀釋液，按1.2.1～1.2.5步驟檢測，以確定新建方法的最低檢出限。

1.2.8 測序分析 對1.2.7所述38例臨床樣本和HBV-B、C、D基因型標(biāo)準(zhǔn)株送上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序分析，以檢驗PCR擴增的特異性和膜雜交結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.9 臨床樣本檢測 用新建方法對187例臨床樣本進行檢測，分析深圳地區(qū)HBV基因型與耐藥突變分布情況。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

如圖1所示，對HBV標(biāo)準(zhǔn)株和187例臨床樣本PCR 擴增產(chǎn)物進行電泳，在500 bp和750 bp處可見明顯陽性條帶，與預(yù)期片段大小一致。

圖1 部分PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 膜芯片雜交結(jié)果

膜條上的探針共兩行，探針位置如表2所示，其中CC為內(nèi)對照，其余位置分別對應(yīng)相應(yīng)探針。由圖2可見，所有雜交膜條在CC位置均出現(xiàn)藍(lán)色斑點，其余雜交斑點顯色清晰，提示本次雜交顯色正常。

表2 膜條探針位置示意表

圖2 部分HBV臨床樣本與標(biāo)準(zhǔn)株反向斑點雜交結(jié)果圖

2.3 DNA測序結(jié)果

對38例臨床樣本和HBV-B、C、D基因型標(biāo)準(zhǔn)株進行測序分析，其結(jié)果與膜芯片結(jié)果完全一致（圖3）。

2.4 特異性與最低檢出限確定

將ADV、HPV、HSV標(biāo)準(zhǔn)株和11種標(biāo)準(zhǔn)菌株用新建方法檢測，結(jié)果在膜芯片上未出現(xiàn)陽性反應(yīng)斑點。HBV-B、C、D標(biāo)準(zhǔn)株和38例臨床株分別制成104、103和102copies/ml濃度進行檢測，發(fā)現(xiàn)各株濃度在103copies/ml時檢測結(jié)果仍為陽性，當(dāng)菌液稀釋至102copies/ml時，有8例陽性顯色已經(jīng)明顯變?nèi)酰?0例臨床株未見陽性顯色。

2.5 臨床樣本檢測結(jié)果

在187例HBV陽性臨床樣本中檢出B型108例，占57.8%；C型70例，占37.4%；B+C混合型8例，占4.3%；另有1例不能分型，未測出D型。在187例臨床樣本中共檢出耐藥突變49例，占26.2%。在49例耐藥突變中，20例為rtL180M+rtM204V，占40.8%；13例為rtL180M+rtM204I，占26.5%；8例為rtM204I，占16.3%；4例為rtA181V，占8.2%；2例為rtN236T，占4.1%，1例 為rtA181V+rtN236T，占2.0%；1例為rtV207I，占2.0%。在49例耐藥突變中，有32例為HBV-C，占65.3%；17例為HBV-B，占34.7%。

圖3 部分HBV臨床樣本與標(biāo)準(zhǔn)株擴增產(chǎn)物測序結(jié)果圖

3 討論

HBV為一不完全環(huán)狀雙鏈DNA分子，基因組長約3 200 bp，含前-S/S區(qū)、前-C/C區(qū)、P區(qū)和X區(qū)共4個主要的開放讀碼框（ORF）。HBV復(fù)制的顯著特征是存在一個有逆轉(zhuǎn)錄酶參與的、以mRNA為中間體的DNA-RNA-DNA過程。由于HBV逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏嚴(yán)格的校正機制，故在HBV復(fù)制過程中核苷酸錯配率高，基因突變頻繁發(fā)生[4]。研究顯示，S區(qū)基因序列既含相對穩(wěn)定的序列保守區(qū)，又含相對多態(tài)的序列變異區(qū)，適用于HBV基因分型[5]，而所有核苷（酸）類似物耐藥突變位點都位于HBV DNA聚合酶基因區(qū)（逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)），故耐藥性檢測探針多依據(jù)此區(qū)序列設(shè)計。本研究根據(jù)HBV S區(qū)基因多重比對結(jié)果，于保守區(qū)設(shè)計1條通用探針作為內(nèi)對照，另設(shè)3條特異性探針分別檢測HBV基因型B～D。根據(jù)HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)基因多重比對結(jié)果，設(shè)計了rt180L、rt180M、rt204M、rt204V、rt204I、rt181A、rt181V、rt207M、rt207V、rt207I、rt236N和rt236T 5個位點共12條探針，基本上涵蓋了4種抗HBV核苷（酸）類似物的常見耐藥突變。實驗中，通過多重PCR擴增，電泳出現(xiàn)預(yù)期條帶，表明擴增成功。將HBV-B、C、D標(biāo)準(zhǔn)株和38例HBV臨床樣本的PCR產(chǎn)物與膜條雜交，結(jié)果在內(nèi)控制（CC）位置均有明顯雜交信號，表明雜交成功，擴增片段為目的基因片段。在膜芯片相應(yīng)探針位置出現(xiàn)的陽性顯色背景清晰，無交叉反應(yīng)和其他非特異性反應(yīng)。將ADV、HPV、HSV和11種標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA擴增后雜交，結(jié)果均為陰性，其特異性達到了100%。為進一步驗證膜芯片對HBV分型和耐藥檢測的準(zhǔn)確性,本研究將HBV-B、C、D標(biāo)準(zhǔn)株和38例臨床樣本的PCR產(chǎn)物進行測序，并將雜交結(jié)果與測序結(jié)果進行比較，結(jié)果顯示，膜芯片結(jié)果與測序結(jié)果完全一致，準(zhǔn)確性達到100%。為確定方法的檢測靈敏度，本研究將HBV-B、C、D標(biāo)準(zhǔn)株和38例臨床樣本用實時定量PCR進行載量確認(rèn)后，分別制成104、103和102copies/ml濃度進行檢測，發(fā)現(xiàn)最低檢出限達103copies/ml，表明該方法具有較高的檢測靈敏度，從而肯定了其在分型和耐藥性檢測中的應(yīng)用價值。

目前國際上已統(tǒng)一了HBV耐藥位點的定位命名，即從逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的上游第一個氨基酸起，分別為rtl～rt344[6]。研究表明，拉米夫定（LAM）最常見的耐藥突變?yōu)閞tM 204I/V±rtL180M，其中rtM204V多與rtL180M聯(lián)合出現(xiàn)，rtM204I可單獨出現(xiàn)，其1～5年累積耐藥發(fā)生率分別為24%、38%、49%、67%與70%[7]。阿德福韋酯（ADV） 常見的耐藥突變?yōu)閞tN236T與rtA181V/T變異，兩個位點變異可單獨或聯(lián)合出現(xiàn)，其1～5年累積耐藥發(fā)生率分別為0%、3%、11%、18%與29%[8]。恩替卡韋（ETV）常見的耐藥突變是在rtM204V+rtL180M變異基礎(chǔ)上，再聯(lián)合aT184、rtS202或aM250三個位點中至少一個位點突變，其1～5年累積耐藥發(fā)生率分別為0.2%、0.5%、1.2%、1.2%與1.2%[9]。替比夫定（LdT）常見的耐藥突變?yōu)閞tM204I，其1～2年累積耐藥發(fā)生率分別為4%與22%[10]。

在對187例HBV陽性臨床樣本檢測結(jié)果中，檢出B型108例，占57.8%；C型70例，占37.4%；B+C混合型8例，占4.3%；未測出D型；另有1例不能分型，分析可能為HBV-B、C、D之外的其他基因型。187例HBV陽性臨床樣本共檢出耐藥突變49例，占26.2%。在49例耐藥突變中，20例為rtL180M+rtM204V，占40.8%；13例為rtL180M+rtM204I，占26.5%；8例為rtM204I，占16.3%；4例為rtA181V，占8.2%；2例為rtN236T，占4.1%，1例為rtA181V+rtN236T，占2.0%；1例為rtV207I，占2.0%。在49例耐藥突變中，有32例為HBV-C，占65.3%；17例為HBV-B，占34.7%。上述結(jié)果與以往的研究基本相符[11-12]。

目前常用于HBV基因型與耐藥突變的分子檢測方法一般都基于PCR、核酸分子雜交、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析和DNA測序等原理，在已報道的方法中，或因操作步驟復(fù)雜、檢測位點單一而不適應(yīng)現(xiàn)代大規(guī)模檢測與流行病學(xué)調(diào)查的要求，或因價格昂貴而難以在臨床推廣應(yīng)用。本研究以多重PCR和反向線性雜交為基礎(chǔ)，建立了膜芯片方法來同步檢測HBV的基因型和耐藥性。實驗結(jié)果證實，本方法簡便、快捷，具有較強的特異性和較高的敏感性，可大大降低臨床HBV基因分型和耐藥性檢測的成本、縮短檢測周期，為研究HBV的流行病學(xué)規(guī)律、快速制訂最佳治療方案、降低耐藥毒株在人群中的播散從而最終控制HBV提供了新的技術(shù)平臺，適合在臨床推廣使用。

[1]OKAMOTO H,TSUDA F,TANARA T,et al.Typing Hepatitis B Virus by homology in nucleotide sequence:comparison of surface subtype[J].J Gen Virol,1988,69(10):2575-2583.

[2]ZENG G,WANG Z,WEN S,et al.Geographic distribution,virologic and clinical characteristics of hepatitis Bvirus genotypes in China[J].J Viral Hepat,2005,12(6):609-617.

[3]LIN CL,CHEN JD,LIU CJ,et al.Clinic pathological differences between hepatitis Bviral genotype B-and C-related resectable hepatocellular carcinoma[J].J Viral Hepat,2007,l4(1):64-69.

[4]DIENSTAG JL.Hepatitis Bvirus infection[J].N Engl J Med,2008,359(14):1486-1500.

[5]NORDER H,HAMMAS B,LOFDAL S,et al.Comparison of the amino acid sequence of nine different serotypes of hepatitis B surface antigen and genomic classification of the corresponding hepatitis Bvirus strains[J].J GenVirol,1992,73(5):1201-1208.

[6]乙型肝炎病毒耐藥專家委員會.乙型肝炎病毒耐藥專家共識[J].中華實驗和臨床感染病雜志(電子版),2009,3(1):43-47.

[7]LIAW YF,LEUUG N,KAO JH,et al.Asian-Pacific consensus statement on the management of chronic hepatitis B:a 2008 update[J].Hepatol Int,2008,2(3):263-283.

[8]LOK AS,MEMAHON BJ.Chronic hepatitis B[J].Hepatology,2007,45(2):507-539.

[9]European Association for the Study of the Liver.EASL Clinical Practice Guidelines:Management of Chronic Hepatitis B[J].J Hepatol,2009,50(2):227-242.

[10]PAWLOTSKY JM,DUSHEIKO G,HATZAKIS A,et al.Virological monitoring of hepatitis Bvirus therapy in clinical trials and practice:recommendations for a standardized approach[J].Gastroenterology,2008,134(2):405-415.

[11]張書楠,余文輝,周大橋,等.慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒耐藥基因型研究[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2011,32(16):1797-1799.

[12]劉妍,王春梅,紀(jì)冬,等.1 121例慢性乙型肝炎患者HBV反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的耐藥突變分析[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2009,34(6):659-662.