體細(xì)胞核移植技術(shù)的研究進(jìn)展

張鵬

[摘要]體細(xì)胞核移植這是近年來人類在細(xì)胞生物學(xué)及發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域取得的最偉大的成就之一，他的成功表明動物體細(xì)胞的分化是可逆的。然而體細(xì)胞核移植的基礎(chǔ)理論以及技術(shù)研究目前還有很多薄弱點(diǎn)，存在著克隆成功率較低等問題，在一定程度上限制了它的發(fā)展。本研究根據(jù)近年體細(xì)胞核移植技術(shù)的研究情況，對應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行克隆的主要步驟、該技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用前景以及目前仍需克服的一些問題作一綜述。

[關(guān)鍵詞]體細(xì)胞；核移植；克?。槐碛^遺傳重構(gòu)

[中圖分類號]Q819 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]2095-0616（2016）05-40-04

一直以來研究人員普遍認(rèn)為只有通過卵子和精子相互結(jié)合形成受精卵，隨著受精卵的不斷分化，最終才能發(fā)育成為一個新的生命，但在這個過程中，受精卵細(xì)胞同時也將逐漸地失去其發(fā)育成為完整后代的能力，把受精卵細(xì)胞具備發(fā)育成為完整個體的能力稱為全能性。體細(xì)胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術(shù)的成功歸因于人們對細(xì)胞全能性的逐步認(rèn)識。核移植（NT）就是將動物的體細(xì)胞或者早期胚胎卵裂球的細(xì)胞核，移植進(jìn)經(jīng)去核的發(fā)育成熟的卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中或受精卵中，得到重構(gòu)的卵母細(xì)胞，然后通過重新激活，恢復(fù)其細(xì)胞分裂及分化，從而促使其發(fā)育成為與供體細(xì)胞的基因型完全相同的子代，這一技術(shù)也可稱為體細(xì)胞克隆技術(shù)。體細(xì)胞核移植技術(shù)最早是由德國的胚胎學(xué)家Spemann 1938年提出的，他起初提出這個理論，主要是為了研究細(xì)胞核全能性的機(jī)制以及在胚胎發(fā)育的過程中細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核的相互作用機(jī)理。直到1952年Briggs和King按照他的理論，首次成功地進(jìn)行核移植試驗(yàn)，他們首先將非洲爪蟾的卵子去除其細(xì)胞核，然后向其中移植進(jìn)其囊胚細(xì)胞核，從而得到了正常的后代。隨著胚胎工程技術(shù)的不斷進(jìn)步，人們先后以不同動物的胚胎細(xì)胞等作為供體，不斷成功地培育出了各種克隆動物，如克隆羊、克隆牛、克隆豬、克隆小鼠以及克隆家兔等。其中最具有標(biāo)志意義的是1997年Roslin、研究所的Wilmut等，首次在世界上報道了他們利用體細(xì)胞核移植技術(shù)，用成熟綿羊的體細(xì)胞（乳腺上皮細(xì)胞）作為核供體，成功地克隆出“多莉”羊，一下在全世界掀起了軒然大波。這一實(shí)驗(yàn)充分證明了高度分化的體細(xì)胞仍然具有全能性，人們可以利用體細(xì)胞，通過體細(xì)胞移植技術(shù)獲得基因型與供體細(xì)胞基因型基本相同的子代個體。成為了生物學(xué)以及遺傳學(xué)發(fā)展史上一個重要的里程碑事件。家兔是生物醫(yī)學(xué)研究中最常用的實(shí)驗(yàn)動物之一。利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)克隆兔子是目前研究的熱點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有十分誘人的應(yīng)用前景。而家兔被認(rèn)為是利用體細(xì)胞核移植技術(shù)難以成功克隆的哺乳動物之一，直到2002年法國學(xué)者Patrick Chesne等用卵丘細(xì)胞作為核供體首次成功克隆了家兔，突破了家兔難以成功克隆的關(guān)鍵問題，為擴(kuò)大家兔在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用研究提供了方法。應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)，2006年我國學(xué)者李善剛博士應(yīng)用成纖維細(xì)胞作為核供體成功地培育出克隆家兔，在此基礎(chǔ)上他又進(jìn)一步將轉(zhuǎn)基因技術(shù)與體細(xì)胞核移植技術(shù)結(jié)合起來，成功培育出了表達(dá)綠色熒光蛋白的克隆兔，將該項(xiàng)技術(shù)推向新的高度。

1體細(xì)胞核移植的主要方法

具體來講，體細(xì)胞核移植技術(shù)主要包括受體細(xì)胞的去核、核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備與選擇、細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞融合、重組胚胎細(xì)胞的激活以及培養(yǎng)等步驟。

1.1受體細(xì)胞的選擇

在哺乳動物體細(xì)胞核移植的實(shí)驗(yàn)中，可以作為受體的細(xì)胞主要有以下三種：（1）去核的受精卯；（2）去核的MⅡ期成熟卵母細(xì)胞；（3）去核的早期胚胎細(xì)胞，其中MⅡ期卵母細(xì)胞是目前采用較多的核移植受體細(xì)胞，因?yàn)樵谶@個時期，一方面該細(xì)胞體積較大，便于顯微操作；另一方面重組胚胎所需要的各種細(xì)胞因子在MⅡ卵母細(xì)胞質(zhì)中均存在，而且細(xì)胞營養(yǎng)成分充足。在細(xì)胞分裂過程中，結(jié)合在DNA上的各種細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)錄因子等從DNA螺旋軸上脫離下來，與此同時胞質(zhì)中的大量重組因子即可與DNA螺旋軸結(jié)合，從而促進(jìn)基因重組的發(fā)生。另外一方面，因?yàn)檫x擇合適卵齡的卵母細(xì)胞作為胞質(zhì)受體，對體細(xì)胞核移植是否能夠成功產(chǎn)生巨大的影響，故細(xì)胞培養(yǎng)的時間也特別重要，實(shí)驗(yàn)中一般多選擇培養(yǎng)40～44h，傳代4～6代的卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞。因?yàn)榇罅康膶?shí)驗(yàn)證明，傳代越多重組胚的囊胚率也越多。

1.2受體細(xì)胞去核的方法

先要對受體細(xì)胞進(jìn)行去核，才能進(jìn)行供體核的移植。受體細(xì)胞去核必須完全，如果去核不完全，一方面可能導(dǎo)致重組的胚胎細(xì)胞染色體形成非整倍體或多倍體從而使克隆直接失敗，另一方面也可能使卵母細(xì)胞產(chǎn)生異常分裂進(jìn)而發(fā)育受阻甚至可以導(dǎo)致胚胎的早期死亡從而使克隆最終失敗。所以是否完全使卵母細(xì)胞去核，是保證核移植所形成的新的胚胎細(xì)胞能否發(fā)育成為正常個體的前提條件。為了減少實(shí)驗(yàn)中的干擾因素，可以通過縮短體外操作的時間并快速而準(zhǔn)確的去除受體細(xì)胞核以避免孤雌發(fā)育。大體上受體細(xì)胞去核的方法可以分為兩種方法，即化學(xué)去核法和機(jī)械去核法。具體有以下幾種操作方法（1）盲吸法：這一方法的優(yōu)點(diǎn)是不用借助于其他的化學(xué)物質(zhì)，但此法耗費(fèi)時間較長、易影響細(xì)胞質(zhì)空間結(jié)構(gòu)故對卵母細(xì)胞損傷比較嚴(yán)重，所以技術(shù)要求較高，不同動物去核率相差也較大，應(yīng)用較少；（2）半卵法：這個方法是應(yīng)用特制的卵母細(xì)胞切割刀，將卵母細(xì)胞切割成為兩個半卵，然后丟棄含有極體的那一半半卵細(xì)胞，用兩個不含極體的半卵細(xì)胞與供體細(xì)胞核進(jìn)行融合，構(gòu)建核移植胚胎。（3）化學(xué)試劑去核法：這種方法的原理是利用蔗糖或者脫羰秋水仙堿等化學(xué)試劑的作用，使受體細(xì)胞能夠自行排出第二極體，從而實(shí)現(xiàn)去核的目的，但目前還不清楚化學(xué)試劑是否對受體細(xì)胞造成損傷；（4）擠壓法及點(diǎn)壓法：此兩種方法均是利用固定管固定住細(xì)胞，使細(xì)胞染色體位于特定位置，然后擠壓透明帶，用去核針取出第一極體，再用熒光染料Hoechest33342染色后觀察其去核率。點(diǎn)壓法是擠壓法的改進(jìn)方法，優(yōu)點(diǎn)是對卵母細(xì)胞胞質(zhì)的損傷較小，在去核操作的過程中不用更換去核針，節(jié)省了時間，有效的提高了去核效率；（5）紡錘體探測技術(shù)：此法去除細(xì)胞核的方法是將卵母細(xì)胞放置于Spindle-view偏振光系統(tǒng)的倒置顯微鏡下，受體卵母細(xì)胞的紡錘體區(qū)域較其它部位明亮，從而清楚顯示其染色體位置，而后再用去核針通過顯微鏡下操作去核，以利于去核的操作準(zhǔn)確完全。（6）透明帶膨脹輔助去核法：此法是先用去核針吸入適量操作液后稍施正壓，使吸入的操作液平緩流出，推進(jìn)去核管，使透明帶逐漸膨脹，然后用去核針將細(xì)胞核取出，此法的優(yōu)點(diǎn)是縮短了去核操作的時間并且顯著地提高了去核操作后卵母細(xì)胞的生存率。（7）離心去核法：這個方法的原理是根據(jù)細(xì)胞質(zhì)的密度小于細(xì)胞核，通過離心的方法將沒有透明帶的細(xì)胞核甩向一側(cè)進(jìn)而脫離卵母細(xì)胞。該方法的缺點(diǎn)是必須去除透明帶，不利于之后核移植胚胎的發(fā)育。

1.3供體細(xì)胞選擇與核的移植

實(shí)驗(yàn)中可用于核供體的細(xì)胞很多，主要有胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）、卵丘細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、睪丸支柱細(xì)胞、精子細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞等，其中最主要的是兩種：一是生殖細(xì)胞如卵丘細(xì)胞，二是胎兒或成年成纖維細(xì)胞。影響核移植成敗的一個重要因素是受體與供體細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化發(fā)育，早期的研究認(rèn)為要使體細(xì)胞核移植成功必需使供體細(xì)胞處于GO期，獲得GO期細(xì)胞主要是通過兩種方法：選擇細(xì)胞類型或者人工誘導(dǎo)的方法。Inoue等研究人員在小鼠的核移植實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，移植的效率較大的受到供體細(xì)胞的細(xì)胞類型以及其基因型的影響。近年來許多科研人員通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)把沒有經(jīng)過休眠誘導(dǎo)的處于細(xì)胞周期中G1期、G2期以至于M期的細(xì)胞作為供體細(xì)胞進(jìn)行核移植也可以獲得成功。將供體細(xì)胞核移植進(jìn)入受體細(xì)胞的常用方法主要可分為融合法以及注射法兩類。其中融合法中目前最常用的是電融合的方法，這是因?yàn)殡娙诤系姆椒ň哂屑?xì)胞損害較小、可重復(fù)性好而且融合的效果較好等明顯的優(yōu)點(diǎn)，所以逐漸被廣大的研究人員所應(yīng)用。電融合方法的原理是通過細(xì)胞在強(qiáng)電場短時間的作用下，使細(xì)胞膜產(chǎn)生一過性的擊穿，當(dāng)電流使兩個相鄰的細(xì)胞膜接觸的區(qū)域發(fā)生擊穿時，兩側(cè)的細(xì)胞膜就可以在擊穿的瞬間發(fā)生接觸并融合成為一個細(xì)胞。注射法一般分為透明帶下注射和胞質(zhì)內(nèi)注射。透明帶下注射是把整個供核細(xì)胞注射至受體細(xì)胞卵周隙，這就需要在注射后還需使供體細(xì)胞與受體細(xì)胞進(jìn)行融合。胞質(zhì)內(nèi)注射一般是用壓電一陶瓷微注射系統(tǒng)，直接把供體核注入胞質(zhì)內(nèi)。

1.4卵母細(xì)胞的激活

因?yàn)槿鄙倭耸芫@一步驟，在以成熟的卵母細(xì)胞作為受體的核移植實(shí)驗(yàn)中，缺少了自然受精過程中受精卵的激活過程，所以必須進(jìn)行人工激活核移植后重構(gòu)的卵母細(xì)胞從而促使其進(jìn)一步分化發(fā)育。根據(jù)激活時期的不同，可分為移核前激活、移核時激活、移核后激活三種不同的時期。使卵母細(xì)胞激活的方法可以分為化學(xué)或者物理刺激的方法兩類。激活方法目前應(yīng)用較多的有鈣離子載體A23187激活和離子霉素激活、乙醇激活、蛋白質(zhì)合成抑制劑激活、氯化鍶激活、精子提取物激活、蛋白質(zhì)磷酸化抑制劑激活以及電脈沖激活、聯(lián)合激活等。雖然卵母細(xì)胞可以被以上的各種化學(xué)物質(zhì)以及物理刺激的方法激活，但是卻不可避免地在激活的同時也造成受體細(xì)胞一定程度的損害，影響胚胎的發(fā)育。所以，是否能夠盡快地探索出對卵母細(xì)胞損傷較小并且激活效率高的激活方法對體細(xì)胞核移植技術(shù)最終能否成功尤為重要。

2體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景

體細(xì)胞核移植技術(shù)作為細(xì)胞生物學(xué)及發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域取得的最偉大的成就之一，應(yīng)用前景必然是特別廣闊的甚至是我們一時無法估量的！其潛在的經(jīng)濟(jì)效益是十分巨大的，隨著這項(xiàng)技術(shù)的不斷發(fā)展、逐步完善，必將帶來生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一場深刻變革。這項(xiàng)技術(shù)在生物學(xué)方面如在保護(hù)瀕危動植物物種、新物種的培育、優(yōu)良畜種培育以及轉(zhuǎn)基因動植物生產(chǎn)方面前景十分廣闊。另外，這項(xiàng)技術(shù)在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域同樣具有巨大的應(yīng)用潛力和發(fā)展前景。尤其在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域，可能為機(jī)體損傷修復(fù)、器官移植乃至遺傳性疾病、老年性疾病的治療等打下堅實(shí)的基礎(chǔ)，有著不可估量的作用，所以值得科研人員持續(xù)關(guān)注并為體細(xì)胞核移植技術(shù)的不斷完善發(fā)展付出不懈的努力。

3目前存在的問題

自從1997年首次報道體細(xì)胞核移植克隆羊獲得成功以來，雖然目前科研人員通過體細(xì)胞核移植克隆動物已經(jīng)取得了不少的進(jìn)展，但是依然存在很多問題，仍缺乏重大突破，比如核移植成功的總體效率仍較低、核移植的胚胎流產(chǎn)率仍然較高以及胚胎發(fā)育異常如“巨胎癥”等問題，一直困擾著廣大的科研人員。有研究人員在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在以卵母細(xì)胞作為受體的核移植小鼠的重構(gòu)胚胎中，其中90%的染色體結(jié)構(gòu)是正常的，這就說明這些染色體結(jié)構(gòu)正常的核移植小鼠的基因組應(yīng)該也是正常的，所以他們推測重構(gòu)胚胎發(fā)育異常絕大部分的原因可能是由于表觀遺傳重構(gòu)的錯誤造成核移植胚胎的異常。表觀遺傳重構(gòu)錯誤主要表現(xiàn)在這幾個方面：X染色體失活，基因組印跡，組蛋白乙?；?，DNA甲基化，端粒與端粒酶長度異常等。近些年來，越來越多的體細(xì)胞核移植相關(guān)實(shí)驗(yàn)逐漸證明了核移植中表觀遺傳重構(gòu)的錯誤造成核移植胚胎異常這一理論的正確性。雖然當(dāng)前核移植技術(shù)越來越成熟，但是研究人員對造成這種錯誤的原因以及其作用的機(jī)制仍未完全清楚。各種原因使得核移植的成功率目前仍然較低（<10%），即使胚胎能夠正常發(fā)育，克隆動物能夠出生，但出生后也經(jīng)常出現(xiàn)各種異常。所以，進(jìn)一步研究核重構(gòu)的分子機(jī)制，明確已經(jīng)高度分化的體細(xì)胞在卵母細(xì)胞中是如何重新去分化的，以及核移植過程中如何發(fā)生表觀遺傳重構(gòu)等均是急需研究人員不斷進(jìn)行探索的問題。