不同劑量MPTP所致帕金森病小鼠模型焦慮行為的評(píng)價(jià)

葉素貞，施劍，夏譽(yù)，張書平，黃漢津

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325015；2.綿陽市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，四川 綿陽 621000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325015；4.樂清市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325600；5.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

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不同劑量MPTP所致帕金森病小鼠模型焦慮行為的評(píng)價(jià)

葉素貞1，施劍2，夏譽(yù)3，張書平4，黃漢津5

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325015；2.綿陽市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，四川 綿陽 621000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325015；4.樂清市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325600；5.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

目的：研究不同劑量1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）所致急性帕金森?。≒D）小鼠模型的焦慮行為。方法：選取40只C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、小劑量組、中劑量組和大劑量組，每組10只。用高架十字迷宮和明暗箱檢測(cè)小鼠的焦慮行為。結(jié)果：各模型組小鼠在暗箱停留的時(shí)間較對(duì)照組均有增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但各模型組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），各模型組間小鼠的穿箱次數(shù)差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高架十字迷宮中各模型組小鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)（OE）、開放臂停留時(shí)間（OT）及開放臂停留時(shí)間百分比（OT%）與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但各模型組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組比，小劑量組和中劑量組小鼠OT%顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：MPTP所致急性PD小鼠模型早期即會(huì)出現(xiàn)焦慮行為，但焦慮的嚴(yán)重程度與造模MPTP劑量無關(guān)。

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶；小鼠；焦慮；帕金森病

帕金森病（Parkinson’s disease，PD），又名震顫麻痹（paralysis agitans），是一種常見的中老年神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床以靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)異常為特征。然而，有文獻(xiàn)報(bào)道除運(yùn)動(dòng)障礙外，約60%～80%的患者合并程度不同的精神障礙如抑郁、焦慮、睡眠障礙、癡呆及藥物性精神障礙，對(duì)患者生活質(zhì)量的影響往往比運(yùn)動(dòng)障礙更嚴(yán)重［1-2］。國(guó)內(nèi)研究［3］發(fā)現(xiàn)，焦慮是PD患者常見的非運(yùn)動(dòng)癥狀（non-motor symptoms，NMS）之一，焦慮發(fā)生率為33.87%，而且PD并發(fā)焦慮患者的NMS發(fā)生率也高，嚴(yán)重影響PD患者的日常生活活動(dòng)能力，降低生活質(zhì)量。當(dāng)前對(duì)PD合并焦慮的研究多集中在

對(duì)PD患者的臨床觀察［3-5］，在動(dòng)物模型上得出的實(shí)驗(yàn)觀察較為有限。本實(shí)驗(yàn)的目的在于觀察用不同劑量1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）急性造模PD小鼠的焦慮行為。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物：雄性C57BL/6J小鼠40只，8周齡，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自上海斯來克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。清潔級(jí)飼養(yǎng)，晝夜節(jié)律12/12 h，動(dòng)物可以自由獲取食物和飲水。

1.1.2分組和模型制備：小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，40只C57BL/6小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，每組10只。小劑量組（MPTP 20 mg/kg×1次，0.9%氯化鈉溶液20 mg/kg×7次）、中劑量組（MPTP 20 mg/kg×4次，0.9%氯化鈉溶液20 mg/kg×4次）、大劑量組（MPTP 20 mg/kg×8次）連續(xù)腹腔注射2 d，對(duì)照組0.9%氯化鈉溶液20 mg/kg×8次，每次注射時(shí)間間隔2 h，每天4次，連續(xù)腹腔注射2 d。

1.2方法

1.2.1明暗箱實(shí)驗(yàn)：于造模后第3天進(jìn)行?；贑rawley等［6］的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，明暗箱的長(zhǎng)寬高分別為44 cm×21 cm×21 cm，分為明箱和暗箱，明箱占2/3，暗箱占1/3，明暗箱之間有一通道可供小鼠通過。明箱上方有白熾燈照亮。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)保持安靜，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物在房間內(nèi)先適應(yīng)1 h。操作者將小鼠放入明箱正中，記錄小鼠在箱內(nèi)5 min的行為活動(dòng)，用計(jì)時(shí)器記下小鼠停留在暗箱的時(shí)間，計(jì)數(shù)器記錄明暗箱間的穿梭次數(shù)。

1.2.2高架十字迷宮：于造模后第4天進(jìn)行?；贚ister［7］的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，小鼠面對(duì)開放臂放至迷宮中心的公共區(qū)，用視頻攝像系統(tǒng)記錄小鼠5 min運(yùn)動(dòng)軌跡指標(biāo)：①進(jìn)入開放臂次數(shù)（open arm entry，OE）：進(jìn)入到任一開放臂的次數(shù)，以小鼠4個(gè)爪子均進(jìn)入到臂內(nèi)為準(zhǔn)，中途一個(gè)爪子從該臂中完全退出則為該次進(jìn)入活動(dòng)完成；②開放臂停留時(shí)間（open arm time，OT）；③進(jìn)入封閉臂次數(shù)（close arm entry，CE）：進(jìn)入任一封閉臂的次數(shù)，以小鼠4個(gè)爪子均進(jìn)入到臂內(nèi)為準(zhǔn)；④封閉臂停留時(shí)間（close arm time，CT）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，對(duì)4組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnett’T3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1明暗箱測(cè)試結(jié)果 在明暗箱測(cè)試中，4組小鼠的穿箱次數(shù)不同（F=3.084，P＜0.05），但各造模組與對(duì)照組，以及各造模組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。4組小鼠在暗箱停留的時(shí)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.253，P＜0.05），各劑量造模組小鼠暗箱停留時(shí)間與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但各劑量組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1　明暗箱的穿箱次數(shù)和在暗箱停留的時(shí)間（n=10，±s）

表1　明暗箱的穿箱次數(shù)和在暗箱停留的時(shí)間（n=10，±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05

組別　穿梭次數(shù)（次）　暗箱停留時(shí)間（s）對(duì)照組　8.8±1.8　142.5±18.6小劑量組　7.1±1.7　167.1±24.0a中劑量組　8.6±1.9　164.0±15.0a大劑量組　7.9±1.9　170.8±28.9a

2.2高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在高架十字迷宮測(cè)試中，4組小鼠OE、OT、OE%、OT%的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；其中OE、OT、OT%，小劑量組、中劑量組、大劑量組與對(duì)照組比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但大劑量組和中劑量組、中劑量和小劑量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；OE%小劑量組和中劑量組與對(duì)照組比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），但大劑量組與對(duì)照組間、大劑量組和中劑量組、中劑量和小劑量組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2　小鼠在高架十字迷宮中的行為學(xué)結(jié)果（n=10，±s）

表2　小鼠在高架十字迷宮中的行為學(xué)結(jié)果（n=10，±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.01

組別　OE（次）　OT（s）　OE%　OT%對(duì)照組　3.9±0.6a　34.9±11.9a　23.1±4.0a12.9±4.9a小劑量組　2.0±0.8a　15.3± 9.3a　14.4±5.0a5.4±3.4a中劑量組　2.3±1.0a　14.5± 9.5a　15.1±5.6a7.9±3.4a大劑量組　2.9±1.1a　21.7± 9.8a　19.6±5.8　7.8±4.8a

3　討論

研究［8］發(fā)現(xiàn)，PD患者合并情感障礙，其中70%患者伴發(fā)抑郁，69%患者存在焦慮。MPTP是一種常用的PD造模藥物，C57BL/6小鼠是目前已知對(duì)MPTP最敏感的動(dòng)物，MPTP小鼠模型能很好的復(fù)制PD的神經(jīng)病理和神經(jīng)生化改變。MPTP本身不具有毒性作用，毒性為其活性代謝產(chǎn)物MPP+，它能選擇性地?fù)p害黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)的多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元，進(jìn)而導(dǎo)致DA的丟失，出現(xiàn)選擇性的運(yùn)動(dòng)癥狀［9］。嚙齒類動(dòng)物的焦慮行為主要表現(xiàn)為探索本性和外界環(huán)境的矛盾沖突，其核心癥狀是擔(dān)憂，直接的表現(xiàn)就是對(duì)不熟悉環(huán)境的躲避。

高架十字迷宮和明暗箱是目前比較公認(rèn)的評(píng)價(jià)小鼠焦慮行為的方法［10］。明暗箱是評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物焦慮行為的經(jīng)典方法，水平運(yùn)動(dòng)反映動(dòng)物的一般活動(dòng)習(xí)性，垂直運(yùn)動(dòng)反映動(dòng)物對(duì)新鮮環(huán)境的探索活性，抗焦慮藥物會(huì)增加動(dòng)物在明箱的行為活動(dòng)時(shí)間，而致焦慮劑明顯減少明箱的停留時(shí)間，穿梭次數(shù)反映運(yùn)動(dòng)和探索活動(dòng)，明箱停留時(shí)間反映抗焦慮狀態(tài)；高架十字迷宮的OE%和OT%反映動(dòng)物的焦慮狀態(tài)［11-12］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)明暗箱中各模型組小鼠在暗箱停留時(shí)間增加，明箱的停留時(shí)間縮短；而高架十字迷宮中結(jié)果發(fā)現(xiàn)各模型組小鼠OE、OT、OE%、OT%均有減少，這表明模型組小鼠出現(xiàn)明顯焦慮癥狀。Levitskaya等［13］發(fā)現(xiàn)小鼠腹腔注射神經(jīng)毒素MPTP（20 mg/kg）1次后便會(huì)增加動(dòng)物的焦慮行為。Ho等［14］發(fā)現(xiàn)MPTP造模小鼠在注射后第1天即在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出焦慮行為。一項(xiàng)類似研究提示，基因敲除的PD小鼠在明暗箱實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯焦慮行為［15］。張如意等［16］研究發(fā)現(xiàn)MPTP所致急性PD小鼠1 d及3 d后都出現(xiàn)不同程度爬桿時(shí)間延長(zhǎng)，自發(fā)活動(dòng)次數(shù)減少。研究［17-18］發(fā)現(xiàn)，MPTP所致PD模型C57BL/6J小鼠，在注射MPTP第1天后自主活動(dòng)明顯下降，但是注射后第2天基本恢復(fù)。本研究行為學(xué)評(píng)價(jià)分別在造模后第3、第4天進(jìn)行，可相對(duì)減少M(fèi)PTP所致C57BL/6J小鼠PD模型的運(yùn)動(dòng)障礙干擾。不同的研究對(duì)PD動(dòng)物模型的自主活動(dòng)或是運(yùn)動(dòng)障礙結(jié)果存在差異，這些行為學(xué)的差異與給藥劑量、途徑、時(shí)間以及動(dòng)物品系來源不同有關(guān)［19］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無論是明暗箱停留時(shí)間還是高架十字迷宮中的結(jié)果，各模型組之間的結(jié)果無明顯差異，提示造模所用MPTP劑量大小與小鼠焦慮程度無關(guān)，這說明急性PD小鼠的焦慮癥狀并非只由MPTP劑量決定。然而，本實(shí)驗(yàn)缺少不同病程，如慢性模型的對(duì)照組別，因此不能確定MPTP所致PD模型的急性、亞急性與慢性模型間的焦慮障礙的區(qū)別。

在人體和焦慮動(dòng)物模型中，紋狀體DA受體的結(jié)合能力降低，焦慮障礙患者多巴胺攝取減少。此外，去甲腎上腺素、五羥色胺等也發(fā)揮重要作用，這些都提示焦慮與PD發(fā)病相關(guān)［20］。研究表明，五羥色胺在焦慮中發(fā)揮重要作用，而PD患者的五羥色胺系統(tǒng)異常。而且，中腦皮質(zhì)邊緣葉DA路徑受累，DA含量減少可以加重情感障礙［3］，更重要的是，與非焦慮組相比，焦慮組“開關(guān)”現(xiàn)象發(fā)生率更高，這與腦內(nèi)DA水平的變化相關(guān)。可見PD和焦慮在發(fā)病機(jī)制上存在一定相關(guān)性。

本實(shí)驗(yàn)成功制作PD模型，且明確提示動(dòng)物模型存在明顯焦慮癥狀，目前越來越多的流行病學(xué)和臨床研究發(fā)現(xiàn)在經(jīng)典的運(yùn)動(dòng)癥狀出現(xiàn)之前，已經(jīng)出現(xiàn)了其他的NMS，如情感障礙和認(rèn)知功能損害［21］，但動(dòng)物模型不能完全模擬人體的各種生理病理機(jī)能，且焦慮與PD之間關(guān)系可能互為因果，不同劑量MPTP所致PD小鼠是否在亞急性期及慢性期會(huì)出現(xiàn)不同程度的焦慮癥狀不能確定，有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：趙翠翠，丁敏嬌）

Evaluation the anxiety behavior in different dosage of MPTP-induced Parkinson's mice

YE Suzhen1，SHI Jian2，XIA Yu3，ZHANG Shuping4，HUANG Hanjin5. 1.Department of Rehabilitation Medicine，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325015； 2.Department of Neurology，Mianyang Central Hospital，Mianyang，621000； 3.Department of Emergency Medicine，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325015； 4.Department of Neurology，Yueqing People's Hospital，Wenzhou，325600；5.Department of Neurology，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325027

Objective： To study the anxiety behavior in different dosage of 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine （MPTP） -induced Parkinson's mice. Methods： Forty C57BL/6J were randomly divided into 4 groups： Low-dose group （LG），moderate-dose group （DG），high-dose group （HG） and control group （CG）. The anxiety behavior in mice was tested with the elevated plus-maze test and the light/dark box. Results： The time of stayed in the dark box of model groups mice were longer than those of the control group （P＜0.05），but the time and transition among model groups mice had no difference （P＞0.05）. The OE，OT and OT% in mode groups mic were signifcant lower than that in the control group （P＜0.05） in the elevated plus-maze test，but there was no signifcant difference among the three model groups （P＞0.05）. The OE% in LG and DG was lower than that in control group （P＜0.05） in the elevated plus-maze test. Conclusion： Anxious behavior appears in the model groups of early PD mice. But there is no difference among those model groups. The anxiety behavior is not dose-dependent.

1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine （MPTP）； mice； anxiety； Parkinson's disease

R749.2

A DOI： 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.08.009

2015-12-08

葉素貞（1984-），女，浙江溫州人，住院醫(yī)師，碩士。

黃漢津，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：hhj@ wzmc.edu.cn。