豬繁殖與呼吸綜合征免疫抗體檢測與分析

劉 鴿，于會舉，張培生，張 倩，屈勇剛，楊慧敏

（石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003）

豬繁殖與呼吸綜合征免疫抗體檢測與分析

劉 鴿，于會舉，張培生，張 倩，屈勇剛*，楊慧敏

（石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003）

為了解北疆地區(qū)的豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的免疫抗體水平，以便及時發(fā)現(xiàn)問題，及時淘汰病豬和做好PRRS的補免工作，本試驗從北疆地區(qū)的19個現(xiàn)代規(guī)模豬場采集血液樣品1 027份，采用ELISA抗體檢測試劑盒對樣品進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有965份免疫抗體陽性血清，陽性率為93.96%；樣品KQ平均值為80.25，變異系數(shù)平均值為0.36；免疫抗體陽性率超過90%的豬場有17個，占89.47%；有6個豬場的PRRS免疫抗體陽性率超過95%。本試驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：北疆地區(qū)豬群的PRRS免疫抗體整體水平較高；不同構(gòu)成成分的試驗豬群間PRRS免疫抗體水平存在差異，種公豬的免疫抗體水平最高；雖然仔豬的整體PRRS免疫抗體水平較高，但免疫抗體水平有隨日齡的增長而下降的趨勢。希望本試驗的研究成果對養(yǎng)豬企業(yè)的生產(chǎn)有所幫助，并為豬病研究的組織機構(gòu)提供有價值的參考。

PRRS；ELISA；抗體水平；陽性率

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），又被稱為豬藍耳?。ㄒ蜇i感染后有耳朵發(fā)紫的癥狀而得名），是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種高度接觸性傳染?。?］。PRRSV是冠狀病毒科動脈炎病毒屬的病毒。PRRS常會引起母豬的繁殖障礙、仔豬的呼吸道疾病和高死亡率［2］、公豬的生殖機能下降［3］。PRRS被國際獸醫(yī)局（OIE）列為B類傳染病，我國將之列為二類動物傳染病。PRRS 在1987年出現(xiàn)于美國，隨后在歐美和亞洲的一些國家和地區(qū)相繼出現(xiàn)［4］，并于20世紀90年代初傳入我國。1991年荷蘭分離到1株P(guān)RRSV，中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所在1993年從國內(nèi)病豬體內(nèi)分離到了PRRSV［5］。PRRS的特點是具有高度傳染性、傳播速度快、危害范圍廣，給國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)帶來非常大的損失［6］。我國已經(jīng)將PRRS列為強制免疫預(yù)防的動物疾病，檢測免疫抗體是檢驗免疫效果的有效手段，免疫效果對PRRS的防控起到非常大的作用［7］。而且，PRRS沒有非常有效的治療方法，包括免疫接種在內(nèi)的綜合防治措施是最為有效的方法［8］。

為了解新疆北疆地區(qū)的PRRS的免疫抗體水平，以便及時發(fā)現(xiàn)問題，及時淘汰病豬和做好PRRS的補免工作，本試驗從北疆地區(qū)（巴州、伊犁、克拉瑪依、沙灣、石河子、瑪納斯、奇臺等不同區(qū)域）的19個現(xiàn)代規(guī)模豬場采集血液樣品1 027份，使用豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測試劑盒對樣品進行檢測，并對檢測結(jié)果進行分析。希望本試驗的研究成果對養(yǎng)豬企業(yè)的生產(chǎn)有所幫助，并為豬病研究的組織機構(gòu)提供有價值的參考。

1　試驗材料和方法

1.1 本試驗的材料

1.1.1 試驗樣品的來源 2014年1月—2016年4月期間，從北疆地區(qū)（巴州、伊犁、克拉瑪依、沙灣、石河子、瑪納斯、奇臺等不同區(qū)域）的19個現(xiàn)代規(guī)模豬場采集血液樣品1 027份，其中包括不同類型的豬群（仔豬，后備母豬，經(jīng)產(chǎn)母豬，種公豬、育肥豬）。

1.1.2 所需材料和必備儀器 豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測試劑盒（武漢科前生物，141115）、自動酶標儀（美國 Bio Tek ）、一次性5 mL獸用采血器、微量移液器（Eppendorf公司）、若干個移液槍頭、恒溫培養(yǎng)箱（光明醫(yī)療儀器廠）、平板震蕩儀等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗采集樣品的方法 用一次性獸用采血器（最大量程5 mL）從待檢豬的前腔靜脈或耳靜脈一次性采血2～4 mL/頭，在室溫下靜置一段時間，以便血清析出，收于采樣箱中帶回實驗室（如果距離較遠，一定要放有冰袋）。吸取1～1.2 mL血清（血清應(yīng)清亮）到1.5 mLEP管（使用前高壓滅菌處理），每個EP管上準確對應(yīng)標記好，在4 000～10 000 r/min 、2～10 min的條件下離心，將上清液吸出作為待檢血清。

1.2.2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測方法 把濃縮洗滌液恢復(fù)至室溫，搖勻，對其進行20倍稀釋。在血清稀釋板上，對待檢血清進行1∶40稀釋，對照血清作1∶4稀釋。對合適數(shù)量的抗原包被板進行洗滌后，各取待檢血清和陰、陽對照血清100 μL于各自的抗原包被板微孔中。要求每個待檢樣各設(shè)一孔，陰、陽對照各設(shè)兩孔。用平板震蕩器輕搖15 s左右，放到37 ℃恒溫箱中溫育30 min后，再用稀釋好的洗滌液洗5次。在每個微孔中加100μL羊抗豬酶標二抗，經(jīng)37 ℃孵育30 min后，再洗5次。然后，在每個抗原包被板微孔中加底物A 1滴（大約50 μL）、底物B1滴，在室溫避光條件下顯色10 min左右。最后，加50μL終止液到每個孔中，盡快測定OD630nm值。

1.2.3 試驗結(jié)果判定標準 各孔的OD630nm值在酶標儀上讀出。試驗成立必須滿足：陽性對照孔 OD630nm值均≥0.7，陰性對照孔OD630nm值均＜0.3。

計算，KQ值=（樣品OD630nm值/陽性對照平均值）×100%

若KQ≥20，判為PRRS免疫抗體陽性；若KQ＜20，判為陰性。

1.2.4 統(tǒng)計分析試驗結(jié)果的方法

使用Excel 軟件和SPSS 軟件對本試驗結(jié)果進行分析，計算本試驗豬場的PRRS免疫抗體陽性率、KQ平均值、變異系數(shù)。

2　試驗結(jié)果

2.1 試驗豬場的PRRS免疫抗體陽性率、KQ平均值、變異系數(shù)

北疆地區(qū)的19個試驗豬場用英文字母A～S進行編號。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 027份試驗樣品中有965份被檢測為PRRS免疫抗體陽性，計算該陽性率為93.96%，KQ平均值為80.25，變異系數(shù)平均值為0.36。試驗豬場的PRRS免疫抗體陽性率中最大值為100%，且有2個這樣的豬場，占試驗豬場的10.53%，最小陽性率為86.67%；免疫抗體陽性率超過90%的豬場有17個，占89.47%；有6個豬場的PRRS免疫抗體陽性率超過95%，占31.58%；各豬場的KQ平均值中最大的為95.12，最小的為48.56；試驗豬場的變異系數(shù)小于0.4的豬場有13個，占68.42%，變異系數(shù)都在0.14～0.68之間。統(tǒng)計試驗結(jié)果見表 1 。

表 1 各豬場的PRRS免疫抗體陽性率、KQ平均值、變異系數(shù)

2.2 北疆地區(qū)試驗豬場不同構(gòu)成成分豬群的PRRS免疫抗體水平

對北疆地區(qū)所有試驗豬場不同構(gòu)成成分豬群的PRRS免疫抗體水平進行分析發(fā)現(xiàn)，仔豬、后備母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬、種公豬、育肥豬的免疫抗體陽性率分 別 為：94.18%、94.35%、98.73%、98.80%、55.56%。不難發(fā)現(xiàn)，免疫抗體陽性率最高的是種公豬的，其次是經(jīng)產(chǎn)母豬的，育肥豬的PRRS免疫抗體陽性率最低，只有55.56%；仔豬和后備母豬的抗體陽性率雖然比較接近，但前者的低于后者的。試驗統(tǒng)計結(jié)果見表2 。

表 2 不同構(gòu)成成分豬群的PRRS免疫抗體水平

2.3 試驗豬場所有0～30 d仔豬PRRS免疫抗體陽性率

試驗共采集0～30 d的仔豬血液樣品275份，其中有259份經(jīng)PRRS免疫抗體檢測呈陽性，占94.18%。對所有試驗豬群中0～30 d的仔豬的PRRS免疫抗體陽性率進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：0～10 d的仔豬抗體陽性率最高，為97.78%；其次是11～20 d的仔豬的，陽性率為96.67%；21～30 d仔豬的PRRS免疫抗體陽性率最低，為88.42%，雖然最低，但其免疫抗體陽性率仍大于85%。試驗統(tǒng)計結(jié)果見表 3 。

表 3 0～30 d仔豬PRRS免疫抗體陽性率

3　討論

3.1 北疆地區(qū)試驗豬群的PRRS免疫抗體整體水平較高

使用豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測試劑盒對采集的北疆地區(qū)的不同區(qū)域的1 027份試驗樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)有965份血清樣品檢出PRRS免疫抗體陽性，占93.96%，高于2012年我國農(nóng)業(yè)部制定的70%的合格標準。由試驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，進行試驗的19個豬場中有17個豬場的PRRSV免疫抗體陽性率高于90%，占89.47%，且其中有2個豬場的抗體陽性率為100%，有6個豬場的抗體陽性率大于95%；免疫抗體陽性率最低的為86.67%；各試驗豬場KQ平均值為較高，為80.25；變異系數(shù)平均值較低，為0.36，符合我國農(nóng)業(yè)部在2012年指定的離散度低于0.40的標準［9］。該試驗研究結(jié)果說明：北疆地區(qū)豬群的PRRS免疫抗體整體水平較高，有接近九成的試驗豬場的免疫抗體陽性率高于90%，且比較穩(wěn)定；也比較容易發(fā)現(xiàn)，雖然整體水平較高，但仍然存在PRRS免疫抗體呈陰性的個體，應(yīng)及時對這樣的豬再次進行檢查，或采取補免措施。

3.2 所有豬場的不同構(gòu)成成分豬群間PRRSV免疫抗體水平存在差異

試驗研究發(fā)現(xiàn)，不同構(gòu)成成分的試驗豬群間PRRS免疫抗體水平存在差異：種公豬的免疫抗體水平最高，抗體陽性率接近100%，為98.80%；經(jīng)產(chǎn)母豬的抗體水平也較高，接近于種公豬的免疫抗體陽性率；育肥豬的免疫抗體水平最低，為55.56%，這可能與豬場對育肥豬的疾病預(yù)防意識淡薄有關(guān)系，甚至是不適當?shù)乃枷朐谧鞴郑ㄓ守i的飼養(yǎng)周期相對較短，發(fā)生疾病的風險小，一旦發(fā)病就可把豬處理掉，所以不想在育肥豬身上花更大的預(yù)防接種的成本，這種思想很可怕，因為傳染病對豬群的危害都很大）。對試驗豬群中的0～30 d仔豬的免疫抗體水平進行分析發(fā)現(xiàn)：雖然仔豬的整體PRRS免疫抗體水平較高，但免疫抗體水平有隨日齡的增長而下降的趨勢，這可能與母源抗體隨時間延長而降低有關(guān)，所以應(yīng)適當加強對妊娠母豬的PRRS免疫接種，提高母源抗體對出生仔豬的保護，抵抗飼養(yǎng)環(huán)境中PRRS對出生仔豬的感染；當然，也與種公豬精液品質(zhì)有關(guān)，在配種前應(yīng)對種公豬進行嚴格篩選。

3.3 增強豬場疾病預(yù)防工作，及時有效地進行免疫接種

針對PRRS流行性較廣的特點，建議各豬場應(yīng)制定針對PRRS的科學合理的免疫程序，采取及時有效的免疫接種，以此對豬群進行保護，因為免疫接種是預(yù)防PRRS的最為有效的措施之一，并搞好環(huán)境消毒工作。在選擇疫苗時要慎重，要根據(jù)自己豬場的具體情況而定，雖然弱毒苗的臨床效果較好，但存在一定的風險，可能引起病毒的返祖或散毒現(xiàn)象的發(fā)生［10］。應(yīng)重視PRRS的免疫接種工作，并且PRRSV在一定程度上可抑制豬對豬瘟疫苗的免疫應(yīng)答［11］。建議可在免疫接種前后飼喂適當?shù)狞S芪多糖，以提高豬群的免疫效果和抗病能力［12］。在免疫接種前10 d左右，不要使用影響免疫效果的藥物，如卡那霉素。

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2016-05-31）

新疆石河子市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目（編號：2013NY04）

作者 ：劉 鴿（1986-），男，山東省淄博人，碩士研究生，主要從事動物傳染病診斷與防治工作

屈勇剛（1971-），男，陜西省渭南人，副教授，主要從事動物傳染病診斷與防治工作