貽貝蛋白Mgfp-5的原核表達與純化

呂玉偉,呂亞維,楊澤熵,王睿劼,張雨靖,王英娟

(西北大學 生命科學學院/西部資源生物與現(xiàn)代生物技術教育部重點實驗室/生物技術省級重點實驗室, 陜西 西安　710069)

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貽貝蛋白Mgfp-5的原核表達與純化

呂玉偉,呂亞維,楊澤熵,王睿劼,張雨靖,王英娟

(西北大學 生命科學學院/西部資源生物與現(xiàn)代生物技術教育部重點實驗室/生物技術省級重點實驗室, 陜西 西安710069)

貽貝(Mytilus galloprovincialis) 足絲中黏附蛋白，是一種黏合強度高、生物相容性好、優(yōu)質的生物黏合劑,可以應用于醫(yī)學、表面化學、海洋工程等領域,其中富含DOPA(多巴,3,4-二羥基苯丙氨酸)的貽貝足絲蛋白5(Mytilus galloprovincialis foot protein type 5, Mgfp-5)顯著表現(xiàn)出此特性。天然獲取Mgfp-5含量低,易固化,純化困難,越來越多學者嘗試基因工程獲得黏蛋白。文中構建重組質粒pET28a-mgfp,在大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中誘導表達出重組蛋白Mgfp-5。為得到高質量的Mgfp-5蛋白,優(yōu)化了Mgfp-5蛋白誘導表達參數(shù):菌液OD600=0.8,誘導劑異丙基-β-D巰基半乳糖苷(IPTG)0.8 mmol/L,37℃,誘導8h;優(yōu)化鎳離子親和層析純化蛋白Mgfp-5最佳條件為:Elution Buffer的pH為7.0,500 mmol/L咪唑。Western Blot鑒定到重組Mgfp-5可以特異性表達。該研究為得到大量Mgfp-5蛋白奠定了基礎,為加速黏蛋白的黏附機理及生物醫(yī)學黏合劑的開發(fā)提供參考。

貽貝;mgfp-5基因;原核表達;優(yōu)化;純化

雙殼類軟體動物貽貝(Mytilusgalloprovincialis)足腺分泌的黏性蛋白質,亦稱貽貝黏蛋白、多酚蛋白質或貽貝足絲蛋白(Mytilusgalloprovincialisfoot protein,Mgfp)[1-3],富含酪氨酸經羥基化修飾后的DOPA(多巴,3,4-二羥基苯丙氨酸)殘基[4-6]。DOPA殘基強的金屬螯合能力和強氫鍵的能力,利于Mgfp在任何環(huán)境尤其在潮濕性環(huán)境中,牢固黏附于不同材料表面[7-8]。Mgfp生物相容性好、無免疫原性,具有生物降解性[9-10],是一種優(yōu)質的生物黏合劑,應用于生物醫(yī)學[11-13]、表面化學及海洋工程領域[14-16]。Mgfp是由多種黏蛋白組成的復合體,目前已鑒定主要有Mgfp-1～Mgfp-6 6種類型黏附蛋白以及3種膠原蛋白質前體(precollagen,preCoI)preCoI-D, preCoI-P,preCoI-NG。其中，Mgfp-5每4個氨基酸中就會有超過1個的DOPA,總含量高達25%～30%[17],具有強黏合力,是發(fā)揮黏附功能的主要蛋白分子,分布于貽貝足基底面及與外界接觸界面。

天然狀態(tài)下,從貽貝足部提取獲得的液態(tài)蛋白量極少,容易固化,而且提取成本很高。近年來有用大腸桿菌及酵母基因工程手段表達貽貝黏合蛋白的研究[18-20],但是效率極低,基因工程表達和純化仍然是制約貽貝黏合蛋白基因工程獲取的瓶頸。本研究通過構建含有mgfp-5基因的原核表達載體,在E.coliBL21(DE3)中誘導Mgfp-5蛋白表達,優(yōu)化Mgfp-5的誘導表達、純化條件,以期提高Mgfp-5蛋白的表達量，奠定大量獲得Mgfp-5蛋白的基礎,為加速黏蛋白的黏附機理及生物醫(yī)學黏合劑的開發(fā)提供參考。

1　材料和方法

1.1菌株與載體

大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)BL21(DE3)及質粒pET-28a由西北大學付愛根教授饋贈。

1.2主要試劑與儀器

質粒DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化生物公司;DNA Marker、限制性內切酶、連接酶等購自Takara公司;Protein Marker、ECL發(fā)光液購自Thermo;Ni-NTA Agarose購自Qiagen公司;一抗購自Vazyme公司、二抗購自北京中杉金橋生物有限公司;引物合成、測序于上海生工生物有限公司,其余化學試劑為國產分析純。

1.3mgfp-5基因原核表達載體的構建

根據貽貝Mgfp-5的cDNA mgfp-5(GenBank:AY521220.1)基因序列構建含有目的基因mgfp-5的pUC57的克隆載體(本實驗室構建并保存),以mgfp-5基因和pET-28a載體設計引物,PCR擴增。正向引物(NdeI酶切位點和保護堿基):mgfp-5-F(5′-GGAATTCCATATGAGTTCTGAAGAAT);反向引物(EcoRI酶切位點保護堿基):mgfp-5-R(5′-CGGAATTCCTAACTGCTACCACCT)。PCR擴增程序:94℃預變性5min;94℃變性30s;55℃退火30s;72℃延伸45s,循環(huán)34次,72℃延伸10min;凝膠電泳鑒定。

試劑盒回收的PCR產物和載體pET-28a,經NdeI和EcoRI雙酶切,回收,T4DNA連接酶4℃連接16 h,轉化E.coliBL21,50 mg/L卡那霉素(Kan.)的LB固體篩選培養(yǎng)。挑取單克隆進行菌落PCR和雙酶切驗證,陽性克隆測序,測序正確的質粒命名為pET28a-mgfp。

1.4重組Mgfp-5蛋白的表達

1.4.1重組Mgfp-5的IPTG誘導pET28a-mgfp單克隆在含50 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min過夜培養(yǎng)。同時設不含pET28a-mgfp的BL21為陰性對照。按體積比1∶100的比例擴大培養(yǎng),37℃，180 r/min培養(yǎng)至菌液OD600為0.6～0.8,取1.0 mL為對照,其余菌液中加IPTG至終濃度1.0 mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,取1.0 mL為誘導后樣品。12 000 r/min,2 min,PBS沖洗菌體沉淀2次,加上樣緩沖液,98℃,10 min,冰上冷卻,12 000 r/min,10 min,15% SDS-PAGE電泳分析Mgfp-5蛋白的表達。

1.4.2重組Mgfp-5的Western Blot用Western Blot鑒定E.coliBL21/pET28a-mgfp未誘導和誘導后的總蛋白:SDS-PAGE凝膠電泳電轉(濕轉)到0.22 μm的PVDF膜上,轉化完全的膜,用TBST(20 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,150 mmol/L NaCl，體積分數(shù)0.05% Tween 20)沖洗干凈;0.05g/mLTBST-脫脂奶粉封閉1.5～2h,TBST洗滌4次,每次8 min;加入抗His一抗(體積比1∶2 000,鼠單抗),4℃過夜孵育,TBST洗滌4次,每次8 min;加入二抗(體積比1∶5 000),常溫孵育3～4 h,TBST洗滌4次,每次8 min;ECL化學發(fā)光顯影。

1.5重組Mgfp-5表達形式的確定

設E.coliBL21(DE3)空載體菌落作為陰性對照,培養(yǎng)陽性單克隆BL21/pET28a-mgfp至OD600為0.6～0.8時,加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L，4 h。收集1.0 mL菌液細胞,裂解液重懸沉淀,冰上超聲,4℃，12 000 r/min，15 min,取上清;沉淀用相同量裂解液重懸,SDS-PAGE分析Mgfp-5蛋白的表達形式。

1.6重組Mgfp-5表達條件優(yōu)化

誘導前菌體生物量:培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)至不同OD600(0.4，0.6，0.8和1.0)菌液,同時加入IPTG誘導劑至終濃度為1.0 mmol/L,37℃，200 r/min，4 h誘導培養(yǎng);誘導溫度:菌液OD600=0.8,IPTG終濃度1.0 mmol/L,不同溫度(25，30，37℃),200 r/min，4 h誘導培養(yǎng);誘導時間:菌液OD600=0.8,IPTG終濃度1.0 mmol/L,37℃,200r/min,不同時間(0，2，4，6，8，10，12，16h)誘導培養(yǎng);IPTG濃度:菌液OD600=0.8,不同IPTG終濃度(0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mmol/L),37℃,200 r/min，4 h誘導培養(yǎng)。取誘導及未誘導菌液1.0 mL,冰上超聲裂解,離心后取上清,分析上述因素對蛋白Mgfp-5表達的影響。

1.7Mgfp-5的純化及條件的優(yōu)化

用優(yōu)化后的最佳表達條件進行誘導、 培養(yǎng)、 收集菌體, PBS洗滌2次, 菌體用Binding Buffer(50 mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl,10 mmol/L咪唑, pH 8.0)重懸沉淀, 超聲破碎菌體細胞, 12 000 r/min離心20 min,0.45 μm過濾上清,濾液與Binding Buffer預處理的Ni2+柱結合;Wash Buffer (50 mmol/L,NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,100 mmol/L咪唑,pH 8.0)沖洗3次;收集Elution Buffer洗脫液。以Elution Buffer洗脫液進行SDS-PAGE電泳分析,依次優(yōu)化Elution Buffer中的咪唑濃度(250，375，500，625 mmol/L;pH 8.0)及適合咪唑濃度條件下的最適pH(8.0，7.5，7.0，6.5)。

1.8Mgfp-5的Western Blot鑒定

方法同1.4.2,Western Blot分析重組菌株的未誘導及誘導后總蛋白、純化后的蛋白。

1.9蛋白量的檢測方法

灰度掃描SDS-PAGE凝膠并運用軟件分析目的蛋白含量,以15kD左右特異性條帶為目標,計算Mgfp-5蛋白在可溶性蛋白中的含量。利用Bradford法檢測Mgfp-5蛋白濃度。

2　結果與分析

2.1原核表達載體pET28a-mgfp的構建

以克隆載體pUC57-mgfp為模板,用1.3中的引物進行PCR擴增mgfp-5目的基因,擴增的產物在預期的250bp附近出現(xiàn)條帶(圖1)。菌落PCR顯示(圖2)陽性轉化子中有約250bp的目的條帶,而陰性對照菌落未見此條帶;在雙酶切鑒定結果(圖3)中,均出現(xiàn)了2條帶,其中可見大小約250bp的目的條帶,與mgfp-5基因預期大小一致;陽性菌測序結果與GenBank中的mgfp-5基因序列比對100%相同,且插入位點正確(圖4),表明mgfp-5基因已經成功嵌入表達載體pET-28a。

M DL15000 DNA Marker; 1-5 PCR擴增的mgfp-5基因片段; 6 空白對照圖1　貽貝mgfp-5 PCR擴增產物凝膠電泳圖Fig.1　Agarose gel electrophoresis of the mgfp-5 PCR products

M DL2000 DNA Marker; 1-6 單克隆菌體; 7 陰性對照圖2　重組表達質粒的菌落PCR電泳圖Fig.2　Colony PCR identification of recombiannt expression vector

M DL15000 DNA Marker; 1-2 重組質粒雙酶產物圖3　重組質粒pET28a-mgfp的雙酶切鑒定Fig.3　Restriction enzyme digestion of the pET28a-mgfp prokaryotic expression plasmid by Nde I and EcoR I

圖4　DNA序列比對結果Fig.4　Result of DNA sequence alignment

2.2重組Mgfp-5蛋白的表達

2.2.1重組Mgfp-5的IPTG誘導pET28a-mgfp重組質粒轉化后經過IPTG誘導(圖5), 重組Mgfp-5的SDS-PAGE分析符合預期,目的條帶出現(xiàn)在15kD附近,而陰性對照沒有，說明Mgfp-5蛋白可以原核表達。重組Mgfp-5分子量約11.4kD,但是電泳條帶顯示目標蛋白分子量大于11.4kD,分析可能是由于Mgfp-5蛋白的等電點(9.3左右)所致,高等電點的蛋白更易于結合SDS,從而增加了重組Mgfp-5蛋白的SDS-PAGE分子量[21]。

M Marker; 1-2 重組誘導，未誘導; 3-4 空載誘導，未誘導圖5　融合蛋白的表達分析Fig.5　Expression analysis of Mgfp-5 fusion protein

2.2.2重組Mgfp-5的Western Blot利用pET28a-mgfp載體的mgfp-5基因序列的上游含有的組氨酸標簽(His-tag),進行重組Mgfp-5的Western Blot(圖6),可見誘導后的蛋白陽性反應帶,而未誘導蛋白無任何特異性的反應條帶,證明Mgfp-5蛋白在E.coliBL21中已成功的表達。

1-2 未誘導; 3-4 誘導圖6　Mgfp-5融合蛋白的Western Blot分析Fig.6　Western Blot analysis of Mgfp-5 fusion protein

2.3Mgfp-5蛋白存在形式的確定

IPTG誘導后分析上清和沉淀(圖7),陽性重組BL21/pET28a-mgfp菌的上清液在約15kD處出現(xiàn)明顯的高水平表達的外源蛋白條帶,而在沉淀里沒有,說明Mgfp-5蛋白主要以可溶性的形式存在,這與Hwang等在對重組Mgfp-5以可溶形式存在的研究相似[21]。

M Marker; 1-2空載上清，沉淀; 3-4 重組菌上清，沉淀圖7　融合蛋白Mgfp-5誘導表達的可溶性分析Fig.7　Soluble analysis of Mgfp-5 fusion protein

2.4誘導條件的優(yōu)化

2.4.1誘導前菌體生物量外源蛋白的表達會因細菌的生長速率的變化而變化, 因此需要優(yōu)化菌液濃度。灰度掃描電泳條帶分析(圖8), Mgfp-5的表達量開始時隨著菌液OD600值的增加而增加,在0.8時最高,為10.7%,當OD600>0.8時表達量隨OD值增加而減少。這可能是細菌已處于過度生長狀態(tài),細菌活力下降,死亡菌體數(shù)量增加,Mgfp-5的表達量隨之減少。選定蛋白表達量最高時的OD600=0.8,作為誘導前實驗所選的最佳菌體培養(yǎng)生物量標準。

A SDS-PAGE結果　　　　　B 蛋白含量M Marker; 1-4 OD600依次為1.0, 0.8, 0.6, 0.4; 5 未誘導(OD600為0.6)圖8　誘導前菌體生物量對重組蛋白Mgfp-5表達的影響Fig.8　Optimization of for bacteria biomass inducing recombinant protein Mgfp-5 expression

2.4.2誘導溫度的確定誘導溫度不僅影響菌體的生長,也影響著外源蛋白的表達以及蛋白的可溶性,被認為是表達外源蛋白時最大的影響因素[22]?；叶葤呙桦娪緱l帶,分析不同培養(yǎng)溫度對Mgfp-5蛋白表達量的影響(圖9),在37℃誘導重組蛋白Mgfp-5時,可溶性形式存在的重組蛋白Mgfp-5表達量(12.3%)明顯優(yōu)于其他溫度的誘導。通常較高溫度誘導蛋白表達時容易出現(xiàn)錯誤性折疊，形成包涵體而沉淀,而低溫誘導可以有助于蛋白的可溶性表達[23],與本實驗嘗試的較高溫度誘導可溶性表達有異。

A SDS-PAGE結果　　　　　B 蛋白含量M Marke; 1 未誘導; 2-4 依次為25, 30, 37℃誘導上清圖9　Mgfp-5蛋白的誘導溫度優(yōu)化Fig.9　Optimization of temperature for inducing recombinant protein Mgfp-5 expression

2.4.3誘導時間的優(yōu)化選擇不同時間誘導培養(yǎng)(圖10), Mgfp-5的表達量在8h之內呈上升趨勢, 8h后下降, 可能是隨著誘導時間的延長, Mgfp-5蛋白自身不穩(wěn)定或者被菌體內源酶解所致;當誘導8h時,Mgfp-5的表達量最大(11.2%)。8h為最佳誘導時間。

2.4.4誘導劑IPTG濃度的優(yōu)化常采用誘導劑IPTG,誘導表達型工程菌的重組蛋白高效表達[24]。不同濃度IPTG誘導(圖11)Mgfp-5蛋白表達,當IPTG<0.8 mmol/L時，表達量與IPTG濃度呈正相關,IPTG>0.8 mmol/L時蛋白的表達量與誘導劑濃度出現(xiàn)負相關。推測IPTG作為誘導劑時,高濃度對菌株本身有一定的毒害作用,抑制菌株生長[25],從而造成目標蛋白的表達量的下降。0.8 mmol/L IPTG誘導時,Mgfp-5表達量最高(16.7%),選定誘導最佳濃度為0.8 mmol/L。

A SDS-PAGE結果　　　　　B 蛋白含量M Marker; 1-8 誘導時間依次為0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 h圖10　Mgfp-5 蛋白的誘導時間優(yōu)化Fig.10　Optimization of time for inducing recombinant protein Mgfp-5 expression

A SDS-PAGE結果　　　　　B 蛋白含量M Marker; 1-5 IPTG濃度依次為1.2, 1.0, 0.8, 0.6, 0.4mmol/L; 6 未誘導圖11　Mgfp-5蛋白的IPTG誘導濃度優(yōu)化Fig.11　Optimization of IPTG concentration for inducing recombinant protein Mgfp-5

2.5重組蛋白純化條件的優(yōu)化

在Ni2+親和層析時,咪唑起最關鍵的作用,Binding Buffer和Wash Buffer中低濃度的咪唑能夠有效的降低雜蛋白與Ni2+柱的結合,可減少純化步驟。Elution Buffer中高濃度的咪唑與His競爭Ni2+有利于洗脫蛋白。pH的降低會使His殘基質子化,減弱重組蛋白與樹脂結合位點的作用,使標簽蛋白中的His不能夠與Ni2+結合,蛋白易被洗脫。

Ni2+柱純化的蛋白Mgfp-5,SDS-PAGE分析呈現(xiàn)單一條帶;Elution Buffer咪唑濃度為500 mmol/L時效果最好,繼續(xù)提高濃度洗脫效果變化不明顯(圖12)。在500 mmol/L咪唑時優(yōu)化洗脫pH,洗脫效果(圖13)隨著pH的降低而逐漸提高,當pH降至7.0和6.5時洗脫效果相差不大?？紤]到較低的pH會降低蛋白活性[26],最終確定洗脫液pH為7.0。

M Marker; 1-4 咪唑濃度依次為625, 500, 375 , 250 mmol/L; 5 全蛋白圖12　不同咪唑對重組蛋白純化的影響Fig.12　Influence of different imidazole concentration on the Mgfp-5 purification

M Marker; 1-4 pH分別為8.0, 7.5, 7.0 , 6.5; 5 全蛋白圖13　不同pH對重組蛋白純化的影響Fig.13　Influence of different pH on the Mgfp-5 purification

2.6純化后Mgfp-5蛋白的鑒定

分別取重組菌株未誘導及誘導總蛋白,純化重組蛋白,Western Blot鑒定,結果顯示(圖14)純化蛋白與全菌液上清蛋白的顯色條帶與電泳中的條帶位置一致,為預期的重組蛋白Mgfp-5。

1 未誘導; 2 誘導; 3 純化的Mgfp-5圖14　Mgfp-5蛋白Western blot分析Fig.14　Western blot analysis of Mgfp-5

3　討論與結論

貽貝足絲蛋白組分中,Mgfp-5蛋白分子量最小,但多巴(DOPA)含量最高，為25%～30%[17],是開發(fā)新型防水和生物醫(yī)療黏合劑的主要候選分子之一。20世紀80年代,人們開始關注貽貝足絲蛋白及其基因的結構、功能和相關黏附機制,但是其研究瓶頸一直是沒有足夠量的純品Mgfp-5蛋白?，F(xiàn)有的Mgfp-5蛋白主要靠天然獲取,然而其易固化、純化難、獲取量低,使得越來越多研究者嘗試基因工程解決此問題。目前僅有Hwang等[21]在大腸桿菌中的表達地中海貽貝Mgfp-5蛋白,試圖得到重組蛋白,但是表達的重組蛋白在變性條件下,純化率低,蛋白量極少。資料少有通過探討不同誘導表達條件,來有效誘導Mgfp-5重組蛋白表達的研究。本文從Mgfp-5的高效表達入手,優(yōu)化了重組蛋白Mgfp-5誘導及純化條件。

His-tag是由6個組氨酸組成的短肽,目的蛋白與標簽一起表達可以增加蛋白的可溶性,組氨酸短肽對重組蛋白的大小、功能以及免疫原性的影響都相對較低,且純化的蛋白可以直接制備抗體[27],本實驗擇其優(yōu)點選取His-tag純化Mgfp-5蛋白。

重組蛋白原核表達系統(tǒng)中的菌液OD、誘導溫度、時間及誘導劑等,都影響到蛋白的表達量[22-26],優(yōu)化合適的工程菌株表達條件可以提高重組蛋白的產量。E.coliBL21/pET28a-mgfp在37℃,OD600=0.8,IPTG濃度為0.8 mmol/L誘導8h,可有效得到可溶性表達的目的蛋白Mgfp-5。在Ni2+柱的純化中,選擇合適的咪唑濃度和洗脫液的pH有助于獲得較高純度和較好功能的重組蛋白[26]。在Elution Buffer pH7.0時,用500 mmol/L咪唑洗脫,可以純化得到Mgfp-5蛋白,SDS-PAGE灰度掃描分析純度達到96%。

本研究構建了pET28a-mgfp表達載體并在E.coliBL21成功表達Mgfp-5,使用Ni2+柱層析純化、Western Blot鑒定重組的Mgfp-5。純化的蛋白Mgfp-5特異性條帶,比預估的11.4kD目標條帶稍大一些,可能與蛋白本身攜帶電荷、高等電點更易結合SDS,造成電泳條帶有了一定的遷移[21]。在蛋白能夠表達的同時優(yōu)化了Mgfp-5蛋白在E.coliBL21中的表達及純化條件,獲得重組蛋白Mgfp-5,濃度為4.32 mg/mL,純化率為8.3%。本工作為后續(xù)單克隆抗體的制備、黏蛋白黏附機理研究及生物醫(yī)用黏合劑的發(fā)展奠定了基礎。

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(編輯陳鐿文)

Prokaryotic expression and purification ofMytilusgalloprovincialisfoot protein-5

Lü Yu-wei, Lü Ya-wei, YANG Ze-shang, WANG Rui-jie, ZHANG Yu-jing, WANG Ying-juan

(College of Life Science, Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education/Provincial Key Laboratory of Biotechnology, Northwestern University， Xi′an 710069， China)

The byssus ofMytilusgalloprovincialisproduce and secrete specialized adhesivesMytilusgalloprovincialisfoot protein type 5 (Mgfp-5) which has significant adhesive ability and biocompatibility and which is rich in high DOPA. It can be widely used in medical, chemical surface and ocean engineering or other fields. But the natural extraction of Mgfp-5 resulted in very little purified protein since this process is labor-intensive and inefficient, and these issues restrict its application. To obtain enough Mgfp-5 for the further study, gene fragments mgfp-5 were amplified and cloned it into the prokaryotic expression vector pET28a, then transformed it intoEscherichiacoli(E.coli) BL21(DE3) expression system. The expression of Mgfp-5 protein was induced by isopropyl-β-d-thiogalactoside (IPTG) and SDS-PAGE was used to identify Mgfp-5. The recombinant plasmid pET28a-mgfp was constructed correctly and the recombinant protein was expressed successfully. The factors including bacteria biomass, temperature, time and concentration of IPTG were optimized before induction. Recombinant protein was purified using Ni-NTA Purification System under native conditions. The optimum conditions for the induced expression of recombinant protein were determined as follows: the OD600of bacterial before induction with 0.8, the IPTG concentration of 0.8 mmol/L, the induction temperature of 37℃ and the induction time of 8 h. Recombinant protein was eluted with Native Elution Buffer (pH 7.0) containing 500 mmol/L imidazole. The specificity of the recombinant protein was confirmed using western blots. It can provide the basis for the Mgfp-5 manufacture, in-depth theoretical research and practical application. It can also provide a new way to develop a bioadhesive in medical or underwater environments.

Mytilusgalloprovincialis; mgfp-5 gene; prokaryotic expression; purification; optimization

2015-12-28

國家自然科學基金資助項目(31270411;31572665);陜西省教育廳社會發(fā)展攻關計劃基金資助項目(2012K120102);陜西省教育廳專項基金資助項目(12JK0827;12JS105)

呂玉偉,女,山東新泰人,從事轉基因及蛋白提取方面的研究。

王英娟,女,陜西西安人,西北大學副教授,博士,從事生物技術及細胞工程研究。

Q78

A

10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-03-016