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    半夏多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧作用研究

    2016-09-28 09:04:04楊有林齊武強寶雞市婦幼保健院藥劑科陜西寶雞7000寶雞市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科
    西部中醫(yī)藥 2016年7期
    關(guān)鍵詞:面法液料半夏

    楊有林,齊武強寶雞市婦幼保健院藥劑科,陜西 寶雞 7000;寶雞市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科

    半夏多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧作用研究

    楊有林1,齊武強2
    1寶雞市婦幼保健院藥劑科,陜西 寶雞 721000;2寶雞市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科

    目的:通過響應(yīng)面法優(yōu)化復合酶提取半夏多糖的工藝,并評價其抗氧化活性。方法:以半夏多糖得率為響應(yīng)值,以液料比、酶解溫度、酶解時間、復合酶(木瓜蛋白酶、纖維素酶、果膠酶的質(zhì)量比為2∶2∶1)添加量為試驗因素,采用響應(yīng)面法建立數(shù)學模型,優(yōu)化提取條件;體外抗氧化活性考察半夏多糖對DPPH和O2-·自由基的清除能力。結(jié)果:通過二次回歸模型響應(yīng)面分析,酶解溫度、時間、復合酶添加量、液料比4因素對半夏多糖得率的影響依次減弱;酶解溫度與時間優(yōu)化為54℃和57分鐘,復合酶添加量為7.2mg/mL,液料比例為27∶1mL/g,在此最佳工藝條件下半夏多糖得率為27.98%,模型方程理論預測值為28.32%,兩者相對誤差小于5%。半夏多糖具有較強的抗氧化活性,對DPPH和O2-·自由基的半數(shù)抑制濃度分別為0.987mg/mL、1.309mg/mL,但與維生素C比較,抗氧化活性較弱。結(jié)論:采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到了半夏多糖的最佳復合酶提取條件,且半夏多糖有一定的體外抗氧化作用。

    半夏;多糖;復合酶;響應(yīng)面;抗氧化

    中草藥中多糖具有多種藥理活性,如抗氧化、抗炎性反應(yīng)、增強免疫等,且毒性?。?],如山藥[2]、麻黃[3]、靈芝[4]、軟紫草[5]等中藥材都含有多糖成分。半夏[Pinellia ternata(Thunb.)Breit.]具有一定的藥用價值,富含多種有效活性成分。研究表明[6],半夏多糖可抑制鼠嗜鉻細胞瘤細胞株P(guān)C12細胞和神經(jīng)母細胞瘤細胞系增殖并誘導其凋亡,表明具有抗腫瘤作用;半夏多糖還可提高小鼠結(jié)腸腺癌細胞表面MHC-Ⅱ表達,增強免疫反應(yīng)[7]。本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化半夏多糖的復合酶提取工藝,并探討其體外抗氧化作用。

    1 材料與方法

    1.1材料與試劑半夏購自中草藥市場,烘干至恒重備用;D(+)-無水葡萄糖(標準品)由大連美侖生物技術(shù)提供;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,北京中生瑞泰科技);木瓜蛋白酶、纖維素酶、果膠酶(上海士鋒生物科技);維生素C(VC) Sigma(美國);其他為分析純。

    1.2半夏多糖提取半夏藥材粉碎后過100目篩,稱取篩后粉末5.0 g,按具體試驗需要的酶解條件,在搖床上進行酶解提取多糖成分,搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min,酶解完成得到多糖浸提液。

    1.3多糖測定通過苯酚-硫酸法測定多糖含量[8]。以D(+)-無水葡萄糖作為標準品得到標準曲線為Y=0.0148X-0.0387,R2=0.9932,方程式中X為葡萄糖質(zhì)量濃度,單位為mg/mL,Y為吸光度OD值。多糖得率計算公式為:D(%)=[(N×T)/Z]× 100,式中D為多糖得率(%),T為多糖浸提液的體積(mL),N為由回歸方程求得的多糖濃度(mg/mL),Z為藥材半夏粉末的質(zhì)量(g)。

    1.4響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計酶解pH 4.5、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min及復合酶比例(木瓜蛋白酶、纖維素酶、果膠酶的質(zhì)量比為2∶2∶1)[9]3個條件不變,因素水平設(shè)計及數(shù)據(jù)分析方法參考文獻[10],數(shù)據(jù)分析采用Design-Expert軟件(Stat-Ease,Inc.),見表1。

    表1 半夏多糖提取條件優(yōu)化的因素水平值

    1.5半夏多糖抗氧化活性研究自由基DPPH的清除能力測定:0.2mmol/LDPPH溶液與待測樣液等體積(各2mL)混合反應(yīng)0.5小時后,測其在517nm處的吸光度值,標記為C1,測DPPH溶液與蒸餾水在517 nm處的吸光度值,標記為C0,測乙醇與樣液在517 nm處的吸光度值,標記為C2,同法測定對照維生素C的吸光度值[11]。

    自由基O2-·的清除能力測定:詳細步驟參考文獻[10],測定波長為325 nm的吸光度值,標記為C1,蒸餾水替代樣品溶液后的吸光度值為C0,蒸餾水代替鄰苯三酚后的吸光度值為C2,同法測定對照維生素C的吸光度值,并進行比較。兩種自由基的清除率計算公式均為:

    2 結(jié)果與分析

    2.1響應(yīng)面優(yōu)化

    2.1.1試驗方案及結(jié)果試驗方案及結(jié)果見表2—3。

    表2 試驗方案及結(jié)果

    表3 試驗結(jié)果的方差分析

    2.1.2方程建立與結(jié)果分析多糖得率(Y)與自變量的二次多項回歸擬合方程如下:

    Y=27.39+0.12A-1.06B+0.95C-0.17D+1.89AB-0.59AC+0.087AD+1.05BC+1.40BD-1.16CD-1.55A2-2.37B2-1.66C2-1.35D2

    由表3方差分析結(jié)果可知,模型方程達到顯著性(P<0.0001),失擬項不顯著(P=0.4319),調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.9141,總決定系數(shù)R2=0.9571,這些值表明此回歸方程模型成立,擬合程度好,試驗誤差小,可用于半夏多糖酶法提取工藝的優(yōu)化。此外,酶解溫度(B)、酶解時間(C)、復合酶添加量(D)、液料比(A)依次影響半夏多糖的得率,其中B、C達到顯著水平(P<0.0001),BC、AB、CD、BD交互作用均顯著(P<0.01)。

    2.1.3交互作用分析圖1中b、c表明AC、AD間交互作用對半夏多糖得率的影響不顯著,而圖1中a、d、e、f分別顯示AB、BC、BD、CD的交互作用顯著?;貧w模型方程求解得到的最佳工藝參數(shù)為:復合酶酶解溫度53.9℃,酶添加量7.2 mg/mL,酶解時間為57.3分鐘,液料比為27.3∶1(mL/g),此時半夏多糖得率達到28.32%,見圖1。

    圖1 交互作用的響應(yīng)面圖

    2.2驗證優(yōu)化后工藝將半夏多糖提取最佳工藝參數(shù)微調(diào)為:復合酶酶解溫度54℃,酶添加量7.2 mg/mL,酶解時間為57分鐘,液料比為27∶1mL/g,為檢驗響應(yīng)面法優(yōu)化后的工藝可靠性,此條件下平行進行3組試驗,半夏多糖得率均值為27.98%,此值與理論預測值28.32%的相對誤差為1.20%。

    2.3半夏多糖成分抗氧化活性研究半夏多糖濃度為8 mg/mL時,其對DPPH自由基的清除率達到87.23%,但與VitC比較,DPPH清除能力差。半夏多糖清除DPPH的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.987 mg/mL,VitC的 IC50為0.706 mg/mL。半夏多糖濃度達到8mg/mL時,對自由基O2-·的清除率達到87.33%,但當VitC濃度為2 mg/mL時,其對O2-·清除率為91.79%,故與VitC比較,清除O2-·的能力較弱。半夏多糖對自由基O2-·的IC50為1.309 mg/mL,VitC的IC50為0.627 mg/mL,見圖2—3。

    圖2 半夏多糖對DPPH的清除能力測定

    圖3 半夏多糖對自由基O2-·的清除能力測定

    3 結(jié)論

    魏淑紅[12]采用水提醇沉法提取半夏多糖的得率為13.68%。郭輝娟等[13]通過正交試驗確定纖維素酶法提取半夏多糖,得率最高達23.67%,多糖濃度為10 mg/mL時,其對羥自由基的清除率達到71.75%。但未見復合酶法及響應(yīng)面優(yōu)化法針對半夏多糖提取的工藝優(yōu)化。本研究通過響應(yīng)面優(yōu)化得到半夏多糖復合酶提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為復合酶添加量7.2mg/mL、酶解時間57分鐘、酶解溫度54℃、液料比27∶1mL/g,此時得到的多糖得率實際實驗值為27.98%,與理論預測值28.32%相對誤差小于5%,表明通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準確可靠。此外,半夏多糖對自由基O2-·和DPPH均有清除效應(yīng),表明具有一定的體外抗氧化活性,但與VitC比較,清除這兩種自由基的能力較弱。

    [1] 安曉娟,馮琳,宋紅平,等.植物多糖的結(jié)構(gòu)分析及藥理活性研究進展[J].中國藥學雜志,2012,47(16):1271-1275.

    [2] 于蓮,張俊婷,馬淑霞,等.山藥多糖提取工藝優(yōu)化及其抗菌活性研究[J].中成藥,2014,36(6):1194-1198.

    [3] 李友偉,溫東東,張雪敬.麻黃多糖提取工藝優(yōu)化[J].中國藥業(yè),2014,23(19):49-52.

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    [12]魏淑紅.正交試驗法優(yōu)化半夏多糖的提取工藝[J].生物技術(shù),2010,20(2):42-44.

    [13]郭輝娟,魏定國.半夏多糖提取工藝優(yōu)化及其清除自由基能力研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2011,38(34):19341-19342.

    Study on Antioxidant Activity of Polysaccharide from BanXia and Extraction ProcessOptim ization

    YANG Youlin1,QIWuqiang2
    1 Pharmacy Departmentof BaojiMunicipality Maternity and Child-care Hospital,Baoji721000,China;2 Pharmacy Departmentof BaojiMunicipality TCM Hospital

    Objective:To optimize complex enzymatic extraction technology of polysaccharide from BanXia (Pinellia ternata)by response surfacemethod,and evaluate itsantioxidantactivity.Methods:Polysaccharide yield ofBanXia was taken as the response,liquid tomaterial ratio,enzymatic hydrolysis temperature,enzymatic hydrolysis time and complex enzymes(mass ratios of papain,cellulose and pectase were 2:2:1)as experimental factors,mathematical model was established by adopting response surface method to optimize extraction conditions;antioxidantactivity in vitro was used to investigate the clearance ability of polysaccharide extracted from BanXia to DPPH and O2-·radical.Results:By analyzing with two regression model response surface,the influences of enzymatic hydrolysis temperature,enzymatic hydrolysis time,additive amount of complex enzymes and liquid to material ratio became attenuated gradually;enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis time were optimized as 54℃and 57m inutes,additive amount of complex enzymeswere 7.2mg/m L,liquid tomaterial ratio was 27:1m L/g,under the bestextraction technology,polysaccharide yield of BanXia was 27.98%,model equation theoretical prediction value was 28.32%,and relative error between both was less than 5%.Polysaccharide from BanXia presented strongerantioxidantactivity,halfmaximal inhibitory concentrations of DPPH and O2-radicalwere 0.987mg/m L and 1.309mg/m L,but its antioxidantactivity wasweaker compared w ith vitam in C.Conclusion:The best complex enzymatic extraction technology of polysaccharide from BanXia is obtained by adopting response surfacemethod,and the polysaccharide from BanXia showsantioxidantactivity in vitro to a certain degree.

    BanXia;polysaccharide;complex enzyme;response surface;antioxidation

    R283

    A

    1004-6852(2016)07-0037-05

    2015-03-17

    楊有林(1974—),男,主管中藥師。研究方向:中藥飲片的臨床應(yīng)用。

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