• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    Dectin-1及相關(guān)細(xì)胞因子在足菌腫皮損中的表達(dá)

    2016-09-28 07:30:29伍方佩胡小平于波陳朝豐劉曉云黃國新
    中國真菌學(xué)雜志 2016年4期
    關(guān)鍵詞:光密度葡聚糖念珠菌

    伍方佩 胡小平 于波 陳朝豐 劉曉云 黃國新

    (北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科,深圳 518000)

    ?

    ·論著·

    Dectin-1及相關(guān)細(xì)胞因子在足菌腫皮損中的表達(dá)

    伍方佩胡小平于波陳朝豐劉曉云黃國新

    (北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科,深圳 518000)

    目的觀察Dectin-1在真菌性足菌腫皮損中的表達(dá),初步分析其在足菌腫發(fā)病中的作用。方法實(shí)驗(yàn)分為3組,A組8例足菌腫病例,B組為10例著色芽生菌病病例,A組和B組統(tǒng)稱為感染組,C組為18例正常皮膚組織。應(yīng)用免疫組化法檢測3組病例的組織蠟塊中Dectin-1、IL-4,IL-10,IFN-γ,TNF-α的表達(dá)。結(jié)果與正常組相比,感染組皮膚的Dectin-1、IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-10的積分光密度增高(P<0.05)。A組與B組相比,兩組間Dectin-1、IL-4、IFN-γ,TNF-α的積分光密度值比較無差異(P>0.05)。結(jié)論真菌感染皮損中Dectin-1的表達(dá)上調(diào),可能說明Dectin-1在足菌腫發(fā)病中具有一定作用。

    Dectin-1;真菌性足菌腫;IL-4;IL-10;IFN-γ;TNF-α

    [Chin J Mycol,2016,11(4):201-204]

    Dectin-1可介導(dǎo)識(shí)別包括曲霉屬在內(nèi)的多種真菌病原體,通過Dectin-1識(shí)別這些菌體可促進(jìn)機(jī)體的保護(hù)性應(yīng)答反應(yīng),包括對(duì)真菌的攝取及殺傷(通過呼吸爆發(fā)介導(dǎo)),以及產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和趨化因子包括TNF、IL-1、IL-6和粒細(xì)胞、單核細(xì)胞集落刺激因子等[1]。本研究通過觀察Dectin-1及細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α在真菌性足菌腫皮損中的表達(dá)變化,初步分析Dectin-1在足菌腫發(fā)病中的作用。

    1 材料與方法

    1.1材料

    收集患者的組織蠟塊在北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科門診,從2012~2015年收集了8例真菌性足菌腫和10例著色芽生菌病患者,分別為A組和B組。根據(jù)患者臨床表現(xiàn),病理活檢和真菌學(xué)檢查確診,皮損活檢后制成蠟塊保存?zhèn)溆?。確診的患者中有14名男性和4名女性,平均年齡46.9歲(26~69歲)。A組共有8例患者,男性7例,女性1例,平均年齡47.5歲;B組10例患者,男性7例,女性3例,平均年齡46.5歲。同時(shí)整形外科留取18例正常的皮膚組織,制成蠟塊保存?zhèn)溆?,分為正常C組,同時(shí)進(jìn)行組織的免疫組化。本實(shí)驗(yàn)通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    主要試劑生物技術(shù)公司Abcam Anti IL-4 antibody(ab9622)、Anti IL-10 antibody(ab34843)、Anti-Interferon gamma antibody(ab25101)、Anti-TNF alpha antibody(ab6671)、Anti-beta Glucan Receptor antibody(ab189961);中杉金橋PV-6001兔二步法檢測試劑盒(K142304F);中杉金橋PV-9003山羊超敏二步法檢測試劑盒(K145620B);中杉金橋ZLI-9036 AEC酶底物試劑盒(K146620D);中杉金橋ZLI-9056進(jìn)口羊血清工作液(15A52806)。

    1.2方法

    蠟塊切片后的病理切片置入65度恒溫烤箱烤片1 h,然后進(jìn)行常規(guī)的無水二甲苯脫水,由高到低濃度梯度酒精復(fù)水,隨后使用pH=6.0的枸櫞酸鈉煮沸抗原修復(fù),3%雙氧水浸泡阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,正常羊血清工作液封閉非特異性抗原1 h,分別滴加稀釋單抗孵育12 h。第2天常溫下復(fù)溫15 min,滴加相應(yīng)二抗常溫靜置45 min,AEC染色,靜置5~10 min,顯微鏡下觀察病理組織是否染色。蘇木素液體浸泡復(fù)染5 min,分化液分化,流水沖洗10 min,待顯微鏡下觀察細(xì)胞核顯色后,晾干水性膠水固定,蓋玻片完成。與之前制備好的陽性玻片進(jìn)行對(duì)比。用顯微成相系統(tǒng)進(jìn)行照相。

    1.3統(tǒng)計(jì)方法

    使用Image-Pro Plus軟件分析免疫組化圖片并進(jìn)行半定量比較,Spss 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(見圖1)。

    2 結(jié)  果

    對(duì)A、B、C組之間Dectin-1、IL-4、IL-10、IFN-γ,TNF-α的積分光密度值分別進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(見表1,圖2)。

    表1 A、B、C組間t、P值的比較

    2.1A和B組與C組積分光密度值比較

    與C組相比,感染組A和B組皮膚的Dectin-1、IL-4、IFN-γ,TNF-α,IL-10的積分光密度值均增高(P<0.05)(見圖3)。

    2.2A組與C組積分光密度值比較

    與C組相比,A組IL-4、IFN-γ的積分光密度值增高(P<0.05),而A組Dectin-1、IL-10、TNF-α積分光密度值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

    2.3B組與C組積分光密度值比較

    與C組相比,B組IL-4、IFN-γ、IL-10、TNF-α的積分光密度值增高(P<0.05),而B組Dectin-1積分光密度值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

    2.4A組與B組積分光密度值比較

    A組與B組相比,兩組間Dectin-1、IL-4、IFN-γ,TNF-α的積分光密度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

    3 討  論

    Dectin-1屬第V組C型凝集素,是由胞外C型凝集素樣碳水化合物識(shí)別域(CTLD)、短桿(Stalk)和具有免疫受體酪氨酸激酶活化基序(ITAM)的胞質(zhì)尾部構(gòu)成的糖基化的II型跨膜受體。人Dectin-1基因編碼33 kDa的糖蛋白,其多肽由247個(gè)氨基酸殘基組成。過去在對(duì)釀酒酵母、白色念珠菌的識(shí)別和非調(diào)理素性吞噬過程中,阻斷Dectin-1可顯著抑制巨噬細(xì)胞對(duì)酵母多糖的吞噬[2],這提示Dectin-1可識(shí)別具有β-1,3連接和β-1,6連接的葡聚糖。又有研究發(fā)現(xiàn)Dectin-1是α-甘露糖的特異性受體[3]。因而Dectin-1是β-葡聚糖和α-甘露糖的特異性受體。Palma等[4]研究發(fā)現(xiàn)吞噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞通過Dectin-1識(shí)別β-葡聚糖,表明Dectin-1廣泛分布于髓樣細(xì)胞,包括巨噬細(xì)胞、DC和中性粒細(xì)胞。而在人正常表皮中,Dectin-1蛋白選擇性表達(dá)于朗格罕細(xì)胞。Li等[5]對(duì)真菌性角膜炎的研究發(fā)現(xiàn),Dectin-1在正常角膜上皮和真菌感染的角膜上皮均有表達(dá),而體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)角膜上皮細(xì)胞在曲霉抗原刺激24 h后表達(dá)增加。

    圖1各組免疫組化的比較:A1、A2、A3、A4、A5為A組Dectin-1、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的表達(dá);B1、B2、B3、B4、B5為B組Dectin-1、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的表達(dá);C1、C2、C3、C4、C5為C組Dectin-1、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的表達(dá)圖2各組積分光密度值的比較(* # &表示兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)圖3感染組與正常組積分光密度的比較(*表示兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)

    Fig.1Comparison of each immunohistochemical group:A1-A5.The group A expression of Dectin-1,IL-4,IL-10,IFN-γ,TNF-α;B1-B5.The group B expression of Dectin-1,IL-4,IL-10,IFN-γ,TNF-α;C1-C5.The group C expression of Dectin-1,IL-4,IL-10,IFN-γ,TNF-α)Fig.2The comparison of each integral optical density valuesFig.3The comparison of the integral optical density values between the infected group and normal group

    本研究中發(fā)現(xiàn)A、B、C三組皮膚中均可以表達(dá)Dectin-1。在正常表皮,Dectin-1表達(dá)于郎罕氏細(xì)胞,本實(shí)驗(yàn)中Dectin-1正常組皮膚表達(dá)證實(shí)了Dectin-1可以作為一種模式識(shí)別分子存在于表皮。真菌感染組A、B組皮膚中Dectin-1的表達(dá)高于正常皮膚組,推測當(dāng)真菌感染皮膚組織,樹突狀細(xì)胞和吞噬細(xì)胞通過Dectin-1識(shí)別真菌β-葡聚糖,趨化中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞,因大多數(shù)固有免疫細(xì)胞表面均有Dectin-1的表達(dá),導(dǎo)致感染組的Dectin-1升高。

    有研究報(bào)道,組織莢膜菌感染CRR2-小鼠,使其體內(nèi)IL-4明顯上升,且在小鼠肺部產(chǎn)生高濃度IL-4。升高的IL-4抑制宿主抗真菌感染,導(dǎo)致小鼠因感染加重而死亡[6]。IL-4能刺激吞噬細(xì)胞產(chǎn)生一種能減少產(chǎn)生一氧化氮獲得抗真菌活性的精氨酸酶-1[7]。此外,IL-4能夠阻滯粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子的活化,提高細(xì)胞內(nèi)的鋅以維持真菌生長[8-9],因此認(rèn)為IL-4能夠抑制抗真菌免疫。宿主對(duì)病原真菌有效的適應(yīng)性免疫反應(yīng)主要依靠Thl和Thl7的共同協(xié)同作用,而菌體的生長則主要依靠抑制Thl、Thl7和上調(diào)Th2細(xì)胞的免疫反應(yīng)[10-11]。d'Avila等[12]對(duì)著色芽生菌病不同臨床時(shí)期如疣狀斑塊期和萎縮紅斑期進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn),所有的皮損組織均表達(dá)IL-4,因此推測為機(jī)體啟動(dòng)細(xì)胞免疫。

    本研究中發(fā)現(xiàn)IL-4可以在正常組織和真菌感染組織中表達(dá),而真菌感染皮膚組織中IL-4的表達(dá)高于正常組,推測本研究中感染組的標(biāo)本均來源為疾病中晚期患者,著色芽生菌病患者臨床表現(xiàn)主要為疣狀斑塊、萎縮性斑塊或者混合型,而足菌腫患者主要表現(xiàn)為肉芽腫結(jié)節(jié),機(jī)體啟動(dòng)了Th2細(xì)胞免疫,抑制抗真菌作用,同時(shí)IL-4是一種典型的Th2細(xì)胞因子,還可以促進(jìn)傷口愈合、組織修復(fù)[13],因而IL-4的產(chǎn)生可以促進(jìn)患者組織的纖維化,修復(fù)傷口。

    Hardison等[14]研究發(fā)現(xiàn)硫代乙酸納誘導(dǎo)的Dectin-1缺失的巨噬細(xì)胞中,β-葡聚糖誘導(dǎo)細(xì)胞因子生成的過程被大部分阻斷,巨噬細(xì)胞幾乎無法表達(dá)TNF-α、IL-10。吳呈霖等[15]研究將24只大鼠隨機(jī)分為兩組,感染組用熱處理的光滑念珠菌處理侵襲大鼠肺部,對(duì)照組不做處理,在第3、6天測定兩組大鼠肺泡灌洗液中IL-10、TNF-α的表達(dá)及肺組織,發(fā)現(xiàn)感染組肺組織Dectin-1及肺泡灌洗液中IL-10、TNF-α的表達(dá)呈進(jìn)行性升高。這些研究均表明在真菌感染組織中TNF-α、IL-10的表達(dá)均與Dectin-1呈相關(guān)性。

    本研究中真菌感染組織皮膚中TNF-α、IL-10的表達(dá)同d'Avila的研究結(jié)果一致。d'Avila等[12]對(duì)不同程度著色芽生菌病患者的皮損進(jìn)行免疫組化研究時(shí),發(fā)現(xiàn)TNF-α在全部皮損中表達(dá),IL-10在大多數(shù)的皮損中表達(dá)。TNF-α是多功能細(xì)胞因子,主要由樹突狀細(xì)胞和吞噬細(xì)胞產(chǎn)生,調(diào)節(jié)炎癥性和免疫反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)感染的細(xì)胞凋亡。推測在真菌感染后期,聚集的吞噬細(xì)胞通過Dectin-1的表達(dá)產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子TNF-α,抑制皮膚組織增生。IL-10作為Th2細(xì)胞因子,作用是免疫抑制,能阻抑T細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的活性和功能[16]。推測本研究中入組的患者真菌感染機(jī)體后活化固有免疫,免疫反應(yīng)持續(xù)加強(qiáng),IL-10表達(dá)增加,抑制Th1促炎反應(yīng),避免組織傷害。

    胡志德等[17]發(fā)現(xiàn)不同濃度Dectin-1封閉劑昆布多糖與PBMC培養(yǎng)1 h后,再用熱滅活白念珠菌刺激PBMC 4 d,再用不同劑量的Dectin-1激活劑酵母聚糖刺激PBMC 4 d,收集培養(yǎng)液上清檢測IFN-γ水平,在此體系中加入不同濃度的昆布多糖則可以部分抑制熱滅活白念珠菌誘導(dǎo)IL-12和IFN-γ的能力,且具有濃度依賴。這提示Dectin-1的激活可能是導(dǎo)致Th1相關(guān)的細(xì)胞因子IFN-γ生成的原因。Gow等[18]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱處理殺死的白念珠菌能使其細(xì)胞壁最內(nèi)層的β-葡聚糖暴露從而被Dectin-1識(shí)別。用人、鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液分別與活白念珠菌、紫外線殺死、熱殺死白念珠菌孵育,熱殺死組較活的白念珠菌釋放更高的IFN-γ,而經(jīng)Dectin-1阻斷劑阻斷后,熱殺死組IFN-γ釋放無差異。這提示了IFN-γ的產(chǎn)生有Dectin-1的參與,可能同時(shí)存在其他途徑。

    本次研究中感染組皮損IFN-γ表達(dá)較正常皮膚組升高,考慮為真菌感染后期啟動(dòng)Th1細(xì)胞免疫,IFN-γ是Th1細(xì)胞因子。這個(gè)結(jié)果與d'Avila等[12]的研究發(fā)現(xiàn)是相違背的,考慮原因可能是測量研究數(shù)據(jù)的方式不一樣,因此得到的結(jié)果也不一樣。A組與B組皮損中IFN-γ結(jié)果無差異,考慮原因還是研究對(duì)象例數(shù)不夠。

    綜上,本研究中驗(yàn)證了Dectin-1在正常皮膚和真菌感染的皮膚均可以表達(dá)。在足菌腫與著色芽生菌病中Dectin-1表達(dá)的無差異,推測Dectin-1受體識(shí)別真菌的防御普遍存在于皮膚真菌感染疾病。而真菌性足菌腫皮損中Dectin-1的表達(dá)上調(diào),可能說明Dectin-1在足菌腫發(fā)病中具有一定作用。

    [1]Drummond RA,Saijo S,Iwakura Y,et al.The role of Syk/CARD9 coupled C-type lectins in antifungal immunity[J].Eur J Immunol,2011,41(2):276-281.

    [2]Diniz SN,Nomizo R,Cisalpino PS,et al.PTX 3 function as an opsonin for the dectin-1-dependent internalization of zymosan by macrophages[J].J Leukoc Biol,2004,75(4):649-656.

    [3]Saijo S,Ikeda S,Yamabe K,et al.Dectin-2 recognition of a-mannans and induction of Th17 cell differentiation is essential for host defense against Candida albicans[J].Immunity,2010,32(5):681-691.

    [4]Palma AS,Feizi T,Zhang Y,et al.Ligands for the beta-glucan receptor,Dectin-1,assigned using designer microarrays of oligosaccharide probes(neoglcolipids) generated from glucan polysaccarides[J].J Biol Chen,2006,281(9):5771-5779.

    [5]Li C,Zhao GQ,Che CY,et al.Expression of dectin-1 during fungus infection in human corneal epithelial cells[J].Int J Ophthalmol,2014,7(1):34-37.

    [6]Szymczak WA,Deepe GS Jr.The CCL7-CCL2-CCR2 axis regulates IL-4 production in lungs and fungal immunity[J].J Immunol,2009,183(3):1964-1974.

    [7]Davis MJ,Tsang TM,Qiu Y,et al.Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection[J].MBio,2013,4(3):e00213-00264.

    [8]Subramanian Vignesh K,Landero Figueroa JA,Porollo A,et al.Granulocyte macrophage-colony stimulating factor induced Zn sequestration enhances macrophage superoxide and limits intracellular pathogen survival[J].Immunity,2013,39(4):697-710.

    [9]Winters MS,Chan Q,Caruso JA,et al.Metallomic analysis of macrophages infected with Histoplasma capsulatum reveals a fundamental role for zinc in host defenses[J].J Infect Dis,2010,202(7):1136-1145.

    [10]Wevers BA,Kaptein TM,Zijlstra-Willems EM,et al.Fungal angagement of the C-type lcctin mincle suppresses dectin-1-induced antifungal immunity[J].Cell Host Microbe,2014,15(4):494-505.

    [11]Wuthrieh M,Deepe Gs Jr,Klein B.Adaptive immunity to fungi[J].Annu Rev Immunol,2012,30:115-148.

    [12]d'Avila SC,Pagliari C,Duarte MI.The cell-mediated immune reaction in the cutaneous lesion of chromoblastomycosis and their correlation with different clinical forms of the disease[J].Mycopathologia,2002,156(2):51-60.

    [13]Gause WC,Wynn TA,Allen JE.Type 2 immunity and wound healing:evolutionary refinement of adaptive immunity by helminths[J].Nat Rev Immunol,2013,13(8):607-614.

    [14]Hardison SE,Brown GD,Gringhuis SI.C-type lectin-1 receptors Orchestrate anti-fungal immunity[J].Immunol,2012,13(9):817-822.

    [15]吳呈霖,駱雪萍,吳曄,等.大鼠侵襲性肺部熱處理光滑念珠菌感染肺組織Dectin-1和IL-10的表達(dá)[J].廣東醫(yī)學(xué),2014,35(22):3468-3470.

    [16]Xu Q,Zhao G,Lin J,et al.Role of Dectin-1 in the innate immune response of rat corneal epithelial cells to Aspergillus fumigatus[J].BMC Ophthalmology,2015,15:126.

    [17]胡志德,黃元蘭,孫懿,等.熱滅活白念珠菌通過Dectin-1誘導(dǎo)外周單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)IL-12和IFN-y[J].現(xiàn)代免疫學(xué),2011,31(1):48-51.

    [18]Gow NA,Netea MG,Munro CA,et al.Immune Recognition of Candida albicans β-glucan by Dectin-1[J].J Infect Dis,2007,196(10):1565-1571.

    Express of Dectin-1 and related cytokines in skin with eumycetic mycetoma

    WU Fang-pei,HU Xiao-ping,YU Bo,CHEN Chao-feng,LIU Xiao-yun,HUANG Guo-xin

    (1.Department of Dermatology,Peking University Shenzhen hospital,Shenzhen 518000)

    ObjectiveTo observe the expression of dectin-1 in the skin with eumycetic mycetoma,and to analyze the role of the pattern recognition receptors dectin-1 when the skin infected with eumycetic mycetoma.MethodsThere were three experiment al groups,group A included 8 cases of chromoblastomycosis,and group B contained 10 cases of mycetoma.The infection group included group A and B.The normal group contained 18 normal skin tissue.The expression of Dectin-1,IL-4,IL-10,IFN-γ and TNF-α were tested by immunohistochemical method in the paraffin embedded tissues.ResultsCompared with normal group,the integral optical density values of Dectin-1,IL-4,IFN-γ,TNF-α,IL-10 of the infected group were increased(P<0.05).The integral optical density values of Dectin-1 and IL-4,IFN-γ,TNF-α had no difference between group A and B.ConclusionIncreased expression of Dectin-1 of the skin with eumycetic mycetoma,suggested that Dectin-1 might have a certain role on the skin with fungal infection.

    Dectin-1;eumycetic mycetoma;IL-4;IL-10;IFN-γ;TNF-α

    深圳市科創(chuàng)委基金(JCYJ20140415162542984);深圳市衛(wèi)計(jì)委基金(201401028)

    伍方佩,女(漢族),碩士研究生在讀.E-mail:491937713@qq.com

    胡小平,E-mail:47776040@qq.com

    R 756.6

    A

    1673-3827(2016)11-0201-04

    2016-02-18[本文編輯]衛(wèi)鳳蓮

    猜你喜歡
    光密度葡聚糖念珠菌
    3 種角膜光密度評(píng)估近視Trans-PRK術(shù)后haze的比較
    病理輔助診斷系統(tǒng)中數(shù)字濾光片的實(shí)現(xiàn)方法
    小麥種子活力測定方法的比較
    念珠菌耐藥機(jī)制研究進(jìn)展
    信鴿白色念珠菌病的診治
    葡聚糖類抗病誘導(dǎo)劑在水稻上的試驗(yàn)初報(bào)
    應(yīng)用數(shù)字圖像技術(shù)測量炮口火焰的方法研究
    臨產(chǎn)孕婦念珠菌感染及不良妊娠結(jié)局調(diào)查
    小麥麩皮中β-葡聚糖的分離純化及組成研究
    PCR-RFLP鑒定常見致病性念珠菌
    中文字幕人妻丝袜制服| 午夜老司机福利剧场| 日本av手机在线免费观看| 丰满少妇做爰视频| 18+在线观看网站| 欧美国产精品一级二级三级| 日本av免费视频播放| 999精品在线视频| 九草在线视频观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 丝袜美足系列| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲欧美一区二区三区国产| 99九九在线精品视频| 一边亲一边摸免费视频| 男女免费视频国产| 一区二区三区乱码不卡18| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 日韩精品有码人妻一区| 极品人妻少妇av视频| 国产精品免费大片| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产一区亚洲一区在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲精品在线美女| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 九九爱精品视频在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 99国产精品免费福利视频| 亚洲成人av在线免费| 97在线人人人人妻| 午夜激情av网站| 色播在线永久视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 午夜福利视频精品| 午夜老司机福利剧场| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 香蕉精品网在线| 中文字幕亚洲精品专区| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美97在线视频| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 国产av码专区亚洲av| 成人手机av| 亚洲av福利一区| 国产一区二区 视频在线| 久久韩国三级中文字幕| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久午夜福利片| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 中国国产av一级| 免费观看a级毛片全部| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 久久久久久免费高清国产稀缺| 三级国产精品片| 亚洲精品成人av观看孕妇| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产视频首页在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久99蜜桃精品久久| 亚洲av电影在线进入| 伊人久久国产一区二区| 亚洲精品第二区| 亚洲成人一二三区av| 男人舔女人的私密视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产精品av久久久久免费| 波多野结衣一区麻豆| 99香蕉大伊视频| 青春草亚洲视频在线观看| 一级a爱视频在线免费观看| 美女中出高潮动态图| 亚洲av日韩在线播放| 日韩大片免费观看网站| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 校园人妻丝袜中文字幕| 九草在线视频观看| 看免费成人av毛片| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲伊人久久精品综合| 青草久久国产| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲人成电影观看| 一边亲一边摸免费视频| 久久97久久精品| 韩国高清视频一区二区三区| 午夜精品国产一区二区电影| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久精品国产亚洲av天美| 午夜精品国产一区二区电影| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲精品一区蜜桃| 久久青草综合色| 一级片'在线观看视频| av网站在线播放免费| 国产麻豆69| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产黄色免费在线视频| 观看av在线不卡| 国产亚洲欧美精品永久| xxxhd国产人妻xxx| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久久久久久国产电影| 国产福利在线免费观看视频| 国产精品三级大全| 国产日韩欧美视频二区| 国产欧美亚洲国产| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲,欧美,日韩| 人体艺术视频欧美日本| 精品酒店卫生间| 国精品久久久久久国模美| 丝袜美足系列| 成年av动漫网址| 国产精品国产av在线观看| 欧美xxⅹ黑人| 久久久久久伊人网av| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 99久久综合免费| 一级a爱视频在线免费观看| www.自偷自拍.com| 国产xxxxx性猛交| 18禁国产床啪视频网站| 国产不卡av网站在线观看| 国产精品二区激情视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久免费观看电影| 亚洲av男天堂| 咕卡用的链子| 久热久热在线精品观看| 午夜精品国产一区二区电影| 黄片小视频在线播放| 久久99一区二区三区| 亚洲av中文av极速乱| 桃花免费在线播放| 精品一区在线观看国产| 欧美日韩av久久| 亚洲精品在线美女| 欧美黄色片欧美黄色片| 2022亚洲国产成人精品| 99久久中文字幕三级久久日本| 色视频在线一区二区三区| 国产老妇伦熟女老妇高清| a 毛片基地| 中文字幕制服av| 久热这里只有精品99| 波野结衣二区三区在线| 国产成人精品久久久久久| 久久99蜜桃精品久久| 日韩一本色道免费dvd| 波多野结衣一区麻豆| 99热网站在线观看| 久久ye,这里只有精品| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久久久久久久久久久大奶| 国产午夜精品一二区理论片| 青春草视频在线免费观看| 日本91视频免费播放| 午夜福利一区二区在线看| 黄色配什么色好看| 丝袜美腿诱惑在线| 免费在线观看完整版高清| 永久网站在线| 天堂中文最新版在线下载| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲欧美成人精品一区二区| 美女午夜性视频免费| 一级爰片在线观看| 黄片小视频在线播放| 国产精品二区激情视频| 在线天堂最新版资源| 亚洲av中文av极速乱| 美女大奶头黄色视频| av在线观看视频网站免费| 最黄视频免费看| 美女国产视频在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品三级大全| 午夜91福利影院| 婷婷成人精品国产| 国产成人精品一,二区| 亚洲成色77777| 最新中文字幕久久久久| 精品少妇久久久久久888优播| 婷婷成人精品国产| 亚洲伊人色综图| 亚洲,欧美精品.| 久久久亚洲精品成人影院| av在线观看视频网站免费| 少妇的丰满在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 性少妇av在线| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 大片免费播放器 马上看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 性色av一级| 国产不卡av网站在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 午夜91福利影院| 国产av一区二区精品久久| 久久精品国产自在天天线| 99久国产av精品国产电影| 人妻一区二区av| 美女国产视频在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 大陆偷拍与自拍| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲欧美色中文字幕在线| 街头女战士在线观看网站| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 少妇被粗大的猛进出69影院| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 少妇熟女欧美另类| 男女免费视频国产| 男男h啪啪无遮挡| 成人午夜精彩视频在线观看| 中文字幕色久视频| 超碰97精品在线观看| 日本免费在线观看一区| 亚洲,一卡二卡三卡| 精品视频人人做人人爽| 少妇被粗大猛烈的视频| 激情视频va一区二区三区| 熟女电影av网| 久久 成人 亚洲| 久久婷婷青草| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲综合精品二区| 黄色配什么色好看| av天堂久久9| 新久久久久国产一级毛片| 大香蕉久久成人网| 9热在线视频观看99| 伦理电影大哥的女人| 国产精品欧美亚洲77777| 国产精品久久久久久精品古装| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产综合精华液| 国产色婷婷99| 成人国产av品久久久| 欧美成人午夜精品| 亚洲欧美精品自产自拍| 大片免费播放器 马上看| 18+在线观看网站| av免费在线看不卡| www.自偷自拍.com| 五月伊人婷婷丁香| 欧美日韩av久久| 国产成人精品福利久久| 我的亚洲天堂| 久久亚洲国产成人精品v| 又大又黄又爽视频免费| 成人手机av| 午夜精品国产一区二区电影| 男人添女人高潮全过程视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| av一本久久久久| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产精品蜜桃在线观看| 两个人免费观看高清视频| 亚洲少妇的诱惑av| 黄片播放在线免费| 亚洲欧美清纯卡通| 热99国产精品久久久久久7| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲美女视频黄频| 欧美日韩av久久| 大香蕉久久网| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 1024香蕉在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| 久久精品亚洲av国产电影网| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产成人欧美| 精品酒店卫生间| 免费人妻精品一区二区三区视频| xxx大片免费视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品少妇久久久久久888优播| 丰满饥渴人妻一区二区三| 考比视频在线观看| 1024视频免费在线观看| 夫妻午夜视频| 国产成人欧美| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 高清av免费在线| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产成人精品福利久久| 搡女人真爽免费视频火全软件| 又黄又粗又硬又大视频| 精品一品国产午夜福利视频| 超色免费av| 日本av手机在线免费观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日韩av免费高清视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 成人午夜精彩视频在线观看| 99香蕉大伊视频| 色播在线永久视频| 国产午夜精品一二区理论片| 69精品国产乱码久久久| 国产在视频线精品| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲av成人精品一二三区| 精品久久久精品久久久| 欧美在线黄色| 免费高清在线观看视频在线观看| 免费av中文字幕在线| 国产成人欧美| 天天操日日干夜夜撸| 日本爱情动作片www.在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久精品国产自在天天线| 亚洲一区中文字幕在线| 久久亚洲国产成人精品v| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产1区2区3区精品| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 免费大片黄手机在线观看| 最近最新中文字幕免费大全7| av女优亚洲男人天堂| 99re6热这里在线精品视频| 日韩精品有码人妻一区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 黄片小视频在线播放| 精品久久久久久电影网| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲中文av在线| 中文字幕色久视频| 超碰成人久久| 男女高潮啪啪啪动态图| 一区二区三区乱码不卡18| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产av精品麻豆| 久久久国产一区二区| 成人二区视频| 亚洲成人av在线免费| 丰满乱子伦码专区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 大话2 男鬼变身卡| 看免费av毛片| 久久久久久久亚洲中文字幕| 91国产中文字幕| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲三级黄色毛片| 国产精品三级大全| 午夜免费观看性视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 日韩三级伦理在线观看| 伊人久久国产一区二区| 亚洲成国产人片在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 一级爰片在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 欧美在线黄色| 丰满乱子伦码专区| 久久av网站| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美日本中文国产一区发布| 久久久久久久精品精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 大片免费播放器 马上看| 国产成人精品在线电影| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久国产精品大桥未久av| 精品国产国语对白av| 欧美日韩综合久久久久久| 精品国产国语对白av| 亚洲成人av在线免费| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 丝袜美腿诱惑在线| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品嫩草影院av在线观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产在视频线精品| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 咕卡用的链子| 国产福利在线免费观看视频| 一级a爱视频在线免费观看| 视频在线观看一区二区三区| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产精品偷伦视频观看了| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 1024视频免费在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 黄片小视频在线播放| 亚洲精品日本国产第一区| 午夜免费观看性视频| 国产精品成人在线| 久久青草综合色| 欧美精品高潮呻吟av久久| 寂寞人妻少妇视频99o| 两个人看的免费小视频| 精品亚洲成国产av| 日本av免费视频播放| 亚洲一区中文字幕在线| 黑丝袜美女国产一区| 精品一区在线观看国产| 免费黄网站久久成人精品| 母亲3免费完整高清在线观看 | 久久久久精品久久久久真实原创| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产在线免费精品| 久久午夜综合久久蜜桃| 午夜影院在线不卡| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品在线美女| 亚洲精品aⅴ在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 色视频在线一区二区三区| 秋霞伦理黄片| 色哟哟·www| 日韩欧美一区视频在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 少妇的丰满在线观看| 曰老女人黄片| 成人亚洲精品一区在线观看| 久久免费观看电影| 七月丁香在线播放| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 免费观看a级毛片全部| 久久精品夜色国产| 寂寞人妻少妇视频99o| 丝袜美足系列| 女性生殖器流出的白浆| av天堂久久9| 另类亚洲欧美激情| 日韩av免费高清视频| 国产成人精品一,二区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲精品aⅴ在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 97在线视频观看| 秋霞伦理黄片| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产精品久久久av美女十八| 日韩大片免费观看网站| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 精品久久久久久电影网| 亚洲精品第二区| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲av成人精品一二三区| 一级黄片播放器| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美成人午夜免费资源| 一级,二级,三级黄色视频| 午夜老司机福利剧场| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲国产av新网站| 亚洲成人一二三区av| 久久久久久久久久久久大奶| 中文字幕av电影在线播放| 国产伦理片在线播放av一区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲天堂av无毛| 一级黄片播放器| 久久99一区二区三区| 综合色丁香网| 国产av一区二区精品久久| 日韩大片免费观看网站| 欧美日韩亚洲高清精品| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 美国免费a级毛片| 国产在线视频一区二区| 久久久久人妻精品一区果冻| av在线app专区| 黄片无遮挡物在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 在线天堂中文资源库| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久婷婷青草| 少妇的丰满在线观看| 男女午夜视频在线观看| 又大又黄又爽视频免费| 热re99久久精品国产66热6| 麻豆av在线久日| a 毛片基地| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 美女午夜性视频免费| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲精品国产av成人精品| 国产探花极品一区二区| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产午夜精品一二区理论片| 国产成人91sexporn| 美女国产高潮福利片在线看| 十八禁网站网址无遮挡| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产精品蜜桃在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 国产免费视频播放在线视频| 岛国毛片在线播放| 伦理电影免费视频| 波多野结衣av一区二区av| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 天堂中文最新版在线下载| 熟女av电影| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 成人手机av| 欧美人与性动交α欧美软件| 最近中文字幕2019免费版| 成年人午夜在线观看视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 精品视频人人做人人爽| 美女主播在线视频| 老司机亚洲免费影院| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 看免费成人av毛片| 多毛熟女@视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲国产最新在线播放| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产精品人妻久久久影院| 女性被躁到高潮视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产精品 欧美亚洲| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 婷婷色综合www| 男女啪啪激烈高潮av片| 伊人久久国产一区二区| 97在线视频观看| 国产精品.久久久| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 亚洲精品日本国产第一区| 这个男人来自地球电影免费观看 | 人体艺术视频欧美日本| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 欧美 日韩 精品 国产| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产成人欧美| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久久精品免费免费高清| 久久 成人 亚洲| 中文天堂在线官网| 如何舔出高潮| 2018国产大陆天天弄谢| 捣出白浆h1v1| 成年人午夜在线观看视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 老女人水多毛片| 黑人欧美特级aaaaaa片| 熟女电影av网| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 中国三级夫妇交换| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 国产不卡av网站在线观看| 91精品国产国语对白视频| 美女大奶头黄色视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产人伦9x9x在线观看 | 日韩 亚洲 欧美在线| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 午夜福利乱码中文字幕| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 99久久综合免费| 精品少妇黑人巨大在线播放| www.精华液| 国产在线一区二区三区精| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲综合精品二区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲国产av新网站| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 午夜精品国产一区二区电影| 国产熟女欧美一区二区| 丰满乱子伦码专区| 亚洲av在线观看美女高潮| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产成人a∨麻豆精品| av视频免费观看在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲四区av| www.av在线官网国产| 欧美国产精品一级二级三级| 99久久人妻综合| 国产精品偷伦视频观看了| 国产精品熟女久久久久浪|