酶催化多功能性研究進展

胡居吾，付建平，韓曉丹，徐國良，王慧賓，熊偉

（江西省科學院應用化學研究所，江西南昌 330096）

酶催化多功能性研究進展

胡居吾，付建平*，韓曉丹，徐國良，王慧賓，熊偉

（江西省科學院應用化學研究所，江西南昌 330096）

酶催化反應具有高選擇性、條件溫和和可再生等優(yōu)點，是一種綠色環(huán)保的有機合成方法。近年來人們發(fā)現(xiàn)酶具有催化非天然底物發(fā)生天然反應或非天然反應的能力。這種獨特的能力被定義為酶催化多功能性，近年來備受人們的關注，為有機合成開辟了新的途徑。因此研究酶催化多功能性具有重要意義。本文敘述了酶的多功能性在催化aldol縮合，M annich反應，M ichael加成反應以及多米諾反應中的應用，展望了酶催化多功能性的研究趨勢。

酶催化多功能性；合成；反應

酶一直以來被認為是一種高效、專一，對一定反應具有高度識別性的生物催化劑，且已被應用到有機化合物的合成中[1]。然而，近年來，越來越多的酶被發(fā)現(xiàn)可以催化除天然反應以外的一種甚至多種反應類型，這種特性被稱為催化多功能性（Catalytic Promiscuity）。根據(jù)Hult和Berglund的報道[2]可以把酶催化多功能性分為3種類型。第一種，底物多樣性，即一種酶可以催化非天然底物進行天然反應；第二種，反應條件多樣性，即酶可以在不同于天然反應條件的催化環(huán)境中表現(xiàn)出催化活性，例如一些酶已經被證明可以在有機溶劑、各種pH和溫度條件下催化有機反應。第三種，催化反應多樣性，通過同一個活性位點或者不同活性部位亦或引入新的活性位點催化各種反應類型，這些反應在鍵的斷裂、形成和機理上都與酶催化天然底物的反應不同[3]。一般說的酶催化的多功能性指的都是第三種類型，酶催化非天然底物的反應，這些反應中鍵的斷裂、形成和機理都與酶催化天然底物反應不一樣。當然，催化多樣性都不可避免地會涉及到引發(fā)反應的條件、各種非天然底物和分子機理[4]。雖然酶催化多功能性這一概念相對來說比較新，但是這種多樣性卻是普遍存在于酶中。酶學的這塊新領域還有幾個重要的原理和實踐應用。例如，酶催化多功能性是研究學進化的一個很好的出發(fā)點，已經在進化之間的相關性方面得到了應用[5]。研究催化多樣性的機理和結構為開發(fā)已知酶新的催化功能提供了重要的切入點。這些具有催化多功能性的酶為有機合成提供了諸多新型催化劑。

1 酶催化反應媒介

長期以來，人們一直認為生物功能大分子如蛋白質、核酸等只能在水溶液中行使各自的生物功能，水溶液是這些大分子存在及其相互作用的天然介質。然而，工業(yè)上的許多反應都是在有機溶劑中進行的，很多化合物在水中不溶，水還會導致副反應的發(fā)生和腐蝕對水敏感的反應試劑等，以上這些原因大大限制了酶的工業(yè)用途。原則上，把酶的反應介質換成有機溶劑可以解決以上大部分問題。1984年，Zaks 和Klibanov首次報道了脂肪酶在有機溶劑中具有極高的熱穩(wěn)定性和較高的催化活性，這使酶在有機介質中催化作用的研究取得了突破性進展[6]。2001年，Klibanov更是系統(tǒng)地報道了酶在有機溶劑中的催化活性提高了，因為酶在有機介質中穩(wěn)定性更高，還具有“分子記憶”（Molecular Memory）功能，而且有機溶劑對酶的空間和立體選擇都有很大影響，有的時候甚至跟在水相中反應的結果相反。當然這不是說水在酶催化反應中的作用完全不重要，1995年，Giacomo Carrea報道了來自假絲酵母菌的脂肪酶催化動力學拆分，在有機溶劑中加入一定量的水，拆分效果達到最好[7]。加入一定量的水增加了酶的“柔性”，在最佳含水量時，蛋白質結構的動力學剛性（Kinetic Rigidity）和熱力學穩(wěn)定性（Thermodynamic Stability）之間達到最佳平衡點，酶才表現(xiàn)出最大活力（見圖1）。

圖1 “鋼性”與“柔性”的動態(tài)平衡

有了以上的研究結果作為理論基礎，就能利用酶來催化一些基本的反應類型，為構建C-C鍵的方法學開拓新的領域。事實上，近年來酶多功能性催化的aldol反應、Mannich反應、Micheal加成反應及多米諾反應都有了很大進展。本文重點介紹了這幾類反應的研究進展。

2 酶多功能性催化的aldol反應

Aldol反應是構建C-C鍵的反應之一，并被廣泛應用在許多復雜天然或非天然有機化合物的合成中[8， 9]。Aldol反應被發(fā)現(xiàn)以來，人們一直都在對其進行研究，尋找更好更有效的催化劑來不斷改善它。最早用酶來催化aldol反應的人是Wong及其合作者，他們首次報道了用脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶來催化aldol反應，他們的靈感出自醛縮酶的天然屬性（見圖2）[10]。2002年Berglund等首次報道了醛縮酶以外的酶催化aldol反應，他們利用生物工程改變脂肪酶B（來自假絲酵母菌）(Candida Antarctica lipase B，CAL-B)活性位點的氨基酸，結果得到了對aldol反應有催化作用的變異酶（見圖3）[11]。2000年，List等和Barbas等分別報道了L-脯氨酸催化的不對稱aldol反應，開辟了小分子催化有機反應的新領域，這種催化劑的設計思路來自于模擬生物酶的催化特點（見圖4）[12]。這項研究成果大大激勵了生物有機化學家們對酶催化aldol反應的興趣。2008年，余孝其課題組報道了豬胰脂肪酶催化的丙酮和苯甲醛的直接不對稱aldol反應，并取得了最高43.6%的ee值（見圖5）[13]。當然，這個結果還可以有很大的提高空間。何延紅課題組致力于這方面的研究，連續(xù)報道了木瓜凝乳蛋白酶催化的直接不對稱aldol反應，獲得了很好的反應結果（＞99%收率，＞99%的ee值）[14]。

圖2 首例酶催化的aldol反應

圖3 脂肪酶B（來自假絲酵母菌）催化的己醛自身aldol反應

圖4 L-脯氨酸催化的不對稱aldol反應

圖5 首例酶催化的直接不對稱aldol反應

圖6 核酸酶催化的直接不對稱aldol反應

3 酶多功能性催化的Mannich反應

Mannich反應是有機合成中形成C-C鍵和引入含氮化合物最常用最經濟的方法之一，在各種藥物和天然產物的合成中都有重要用途[15，16]。較理想的反應過程是三組分一鍋法進行。然而，事實是，大部分的反應方法是兩組份分步進行的，比如先生成親電的亞胺或者親核的烯醇和烯胺[17]。這些方法就降低了反應的原子經濟性并且還增加了實驗操作的復雜性。因此，Mannich反應一鍋法作為符合綠色化學要求的實驗策略，越來越受到人們的重視。用酶催化直接的Mannich反應更是最近幾年才發(fā)展起來的新領域。2009年，余孝其和王娜等報道了脂肪酶催化的直接Mannich反應，來源于米黑毛霉菌和假絲酵母菌的脂肪酶催化活性較高，分別得到了72%和48%的產率，作者還發(fā)現(xiàn)反應體系中的含水量對酶的活性影響很大（見圖7）[18]。2010年，他們又報道了來自皺褶念珠菌脂肪酶催化的直接Mannich反應，拓展了酶的多功能性和底物范圍[19]。同年，章鵬飛課題組也報道了豬胰蛋白酶催化的直接Mannich反應，同樣取得了很好的結果（見圖8）[20]。

圖7 脂肪酶催化的直接Mannich反應

圖8 豬胰蛋白酶催化的直接Mannich反應

4 酶多功能性催化的Michael反應

4.1 C-C鍵的形成

Berglund和同事報道了第一個脂肪酶催化的1, 3-二羰基化合物和α, β-不飽和羰基化合物Michael反應的例子。他們將來自假絲酵母菌的脂肪酶B活性位點一個氨基酸取代掉，經過人工改造過的酶對Michael反應的催化能力比天然的酶要強的多（見圖9）[21]。2009年，又報道了同樣的變異酶催化丙烯酸甲酯與乙酰丙酮之間發(fā)生的Michael反應[22]。林賢福發(fā)現(xiàn)Zn2+依賴的?；D移酶能催化1，3-二羰基化合物和甲基乙烯基酮的Michael反應[23，24]。Griengl和同事研究了有手型合成潛力的Michael反應（見圖10）[25]。直到前不久，何延紅課題組報道的固定化脂肪酶（Immobilized Lipase from Thermomyces Lanuginosu，Lipozyme TLIM）催化不對稱Michael反應，才真正實現(xiàn)了酶催化Michael反應的不對稱合成（見圖11）[26，27]。

圖9 CAL-B變體催化的1,3-二羰基化合物和α,β-不飽和羰基化合物Michae反應

圖10 具有手型合成潛力的Michael反應

圖11 固定化脂肪酶催化不對稱Michael反應

4.2 C-N鍵的形成

2003年底，林賢福和同事首次報道了蛋白酶催化的氮雜Michael反應，他們分別用咪唑衍生物和嘧啶衍生物做親核試劑進攻α, β-烯類化合物得到一系列的加成產物（見圖12）[28]。Gotor和同事報道了CAL-B催化仲氨和丙烯氰的Michael加成反應（見圖13）[29]。最近，Escalante和Castillo探究了溶劑對CAL-B催化的苯胺和巴豆酸甲酯發(fā)生Michael反應和氨解反應的影響，他們發(fā)現(xiàn)Michael加成更易在疏水性溶劑中進行，然而極性溶劑對酰胺的生成更有利（見圖14）[30]。

圖12 水解酶催化的咪唑，嘧啶，嘌呤參與的Michael反應

圖13 脂肪酶催化的仲氨和丙烯氰之間的Michael反應

圖14 CAL-B催化的苯胺和巴豆酸甲酯發(fā)生Michael反應

4.3 C-O，C-N鍵的形成

Kitazume等很早就把苯硫酚用作Michael加成的親核試劑。他們報道了豬肝酯酶催化的苯硫酚與2-（三氟甲基）丙烯酸在水中的Michael加成反應[31]。在另外一篇報道中，他們用修飾過的酶催化三氟甲基取代的丙烯酸酯與苯硫酚的Michael反應，得到了有較好光學純的產物（見圖15）[32]。

圖15 苯硫酚與三氟取代α, β-不飽和化合物的Michael加成反應

由于氧原子相對差的親核性，C-O鍵的形成較難，因此關于酶催化形成C-O鍵的Michael加成反應極少被報道。Whitman報道了細菌異構酶催化的3-E-氯和3-E-溴丙烯酸酯水合作用，生成的鹵化醇不穩(wěn)定，會分解為2-羰基丙酸鹽，繼續(xù)脫羧為乙醛（見圖16）[33]。

圖16 細菌異構酶催化的3-E-鹵丙烯酸酯水合作用

5 酶多功能性催化的多米諾反應

現(xiàn)代有機合成對化學工作者的要求不再只是拿到目標分子, 還要求化學家更加注重反應的效率和原子經濟性。高效、高選擇性、環(huán)境友好的綠色化學,已成為現(xiàn)代有機化學發(fā)展的趨勢。關于酶催化的多米諾反應（也可稱為串聯(lián)反應）的報道也越來越多。早先的報道都是多種酶的串聯(lián)反應，分別被應用于糖類衍生物[34]、頭孢菌素[35]和核黃素等天然產物的合成[36]。但是，在這樣的體系中每種酶要求的反應條件往往不一樣，甚至有些酶對前一步反應有抑制作用[37]。單一酶催化的串聯(lián)反應就能克服這些缺點。2004年，林賢福課題組報道了堿性蛋白酶（Alkaline Protease from Bacillus subtilis）催化的包含一個葡萄糖支鏈氮取代咪唑衍生物一鍋法合成的例子，酶在吡啶的環(huán)境中成功催化了酰基化/Michael加成兩步反應，得到了具有抗癌活性的產物（見圖17）[38]。近一兩年，關于單一酶催化的串聯(lián)反應的報道更加密集。2011年，章鵬飛課題組就分別報道了豬胰脂肪酶(Lipase from Porcine pancreas，PPL)催化的螺氧化吲哚衍生物的合成[39]和四氫苯并吡喃衍生物的合成（見圖18和圖19）[40]。同年，林賢福等報道了CAL-B催化的著名Hantzsch反應，獲得了一系列的1, 4-二氫吡啶衍生物[41]。何延紅課題組亦探究了堿性蛋白酶（Alkaline Protease from Bacillus licheniformis，BLAP）催化的香豆素衍生物的合成，控制反應條件能實現(xiàn)Knoevenagel/分子內酯交換串聯(lián)反應與Knoevenagel/半酮化串聯(lián)反應之間的轉化（見圖20）[42]。以上的例子都清晰地給出了一個啟示，未來酶多功能性催化反應的趨勢就是酶催化多米諾反應。

圖17 堿性蛋白酶催化的氮取代咪唑衍生物的合成

圖18 豬胰脂肪酶催化的Spirooxindole衍生物的一鍋法合成

圖19 豬胰脂肪酶催化的四氫可的索衍生物的一鍋法合成

圖20 堿性蛋白酶BLAP催化的香豆素衍生物的合成

6 結語

綜上所述，酶促反應具有方法學上的重要意義，為有機合成提供了一種新型、有效且經濟環(huán)保的途徑。未來酶多功能性催化研究的主要方向應是酶催化多米諾反應以及不對稱合成。

[1] Landwehr M, Hochrein L, Otey C R, et al. Enantioselective α-Hydroxylation of 2-Arylacetic Acid Derivatives and Buspirone Catalyzed by Engineered Cytochrome P450 BM-3[J] . J. Am. Chem .Soc, 2006, 128(18): 6058-6059.

[2] Hult K, Berglund P. Enzyme promiscuity: mechanism and applications[J]. Trends Biotechnol, 2007, 25(5): 231-238.

[3] Kazlauskas R J. Enhancing catalytic promiscuity for biocatalysis[J] . Curr. Opin. Chem. Biol, 2005, 9(2): 195-201.

[4] Nobeli I, Favia A D, Thornton J M. Protein promiscuity and its implications for biotechnology[J] . Nat. Biotechnol, 2009, 27(2): 157-167.

[5] Aharoni A, Gaidukov L, Khersonsky O, et al. The 'evolvability' of promiscuous protein functions[J] . Nat. Genet, 2005, 37(1): 73-76.

[6] Zaks A, Klibanov A M. Enzymatic catalysis in organic media at 100 degrees C[J] . Science, 1984, 224(4654): 1249-1253.

[7] Orrenius C, Norin T, Hult K, et al. The Candida antarctica lipase B catalysed kinetic resolution of seudenol in non-aqueous media of controlled water activity[J] . Tetrahedron Asymmetry, 1995, 6(12): 3023-3030.

[8] Trost B M, Fleming I, Heathcosk C H. Comprehensive Organic Synthesis[M] . Oxford: Pergamon, 1991(2): 409-439．

[9] Palomo C, Oiarbide M, Garcia J M. ChemInform Abstract: The Aldol Addition Reaction: An Old Transformation at Constant Rebirth[J] . Chemistry, 2002, 8(1): 36-44.

[10] Kimura T, Vassilev V P, Shen G H. Enzymatic Synthesis of β-Hydroxy-α-amino Acids Based on Recombinant d-and l-Threonine Aldolases[J] . J. Am. Chem. Soc, 1997, 119(49): 11734-11742.

[11] Branneby C, Carlqvist P, Magnusson A, et al. Carbon-Carbon Bonds by Hydrolytic Enzymes[J] . J. Am. Chem. Soc, 2003, 125(4): 874-875.

[12] List B, Lerner R A, Barbas C F. Proline-Catalyzed Direct Asymmetric Aldol Reactions. Proline-Catalyzed Direct Asymmetric Aldol Reactions[J] . J. Am. Chem. Soc, 2000, 122(10): 2395-2396.

[13] Li C, Feng X W, Wang N, et al. Biocatalytic promiscuity: the first lipase-catalysed asymmetric aldol reaction[J] . Green Chem, 2008, 6(10): 616-618.

[14] Li H H, He Y H, Guan Z. Protease-catalyzed direct aldol reaction[J] . Catal. Commun, 2011, 12(7): 580-582.

[15] Muller R, Goesmann H, Waldmann H. N, N-Phthaloylamino Acids as Chiral Auxiliaries in Asymmetric Mannich-Type Reactions[J] . Angew. Chem. Int. Ed, 1999, 38(1): 184-187.

[16] Bohme H, Haake M. Advances in Organic Chemistry[M] . New York: Interscience, 1976: 107-223.

[17] Trost B M, Terrell L R. A Direct Catalytic Asymmetric Mannich-type Reaction to syn-Amino Alcohols[J] . J. Am. Chem. Soc, 2003, 125(2): 338-339.

[18] Li K, He T, Li C, et al. Lipase-catalysed direct Mannich reaction in water: utilization of biocatalytic promiscuity for C-C bond formation in a “one-pot” synthesis[J] . Green Chem, 2009, 11(6): 777-779.

[19] He T, Li K, Wu M Y, et al. Utilization of biocatalytic promiscuity for direct Mannich reaction[J] . J. Mol. Catal. B: Enzym, 2010, 67(s3-4): 189-194.

[20] Chai S J, Lai Y F, Zheng H, et al. A Novel Trypsin-Catalyzed Three-Component Mannich Reaction[J] . Helv. Chim. Acta, 2010, 93(11): 2231-2236.

[21] Svedendahl M, Hult K, Berglund P. Fast Carbon-Carbon Bond Formation by a Promiscuous Lipase[J] . J. Am. Chem. Soc, 2005, 127(51): 17988-17989.

[22] Svedendahl M, Jovanovic B, Fransson L, et al. Suppressed Native Hydrolytic Activity of a Lipase to Reveal Promiscuous Michael Addition Activity in Water[J] . Chem. Cat. Chem, 2009, 1(2): 252-258.

[23] Xu J M, Zhang F, Wu Q, et al. Hydrolase-catalyzed Michael addition of 1,3-dicarbonyl compounds to α, β-unsaturated compounds in organic solvent[J] . J. Mol. Catal. B: Enzym, 2007, 49(1): 50-54.

[24] Xu J M, Zhang F, Liu B K, et al. Promiscuous zinc-dependent acylasemediated carbon-carbon bond formation in organic media[J] . Chem. Commun, 2007, 20(20): 2078-2080.

[25] Strohmeier G A, Sovic T, Steinkellner G, et al. Investigation of lipase-catalyzed Michael-type carbon-carbon bond formations[J] . Tetrahedron, 2009, 65(s39-30): 5663-5668.

[26] Cai J F, Guan Z, He Y H. The lipase-catalyzed asymmetric C-C Michael addition[J] . J. Mol. Catal. B: Enzym, 2011, 68(s3-4): 240-244.

[27] Xu K L, Guan Z, He Y H. Acidic proteinase from Aspergillus usamii catalyzed Michael addition of ketones to nitroolefins[J] . J. Mol. Catal. B: Enzym, 2011, 71(71): 108-112.

[28] Lin X F, Cai Y, Wu Q, et al. Lipase and protease as novel catalysts for Michael addition in non-aqueous media[A] . Singapore International Chemical Conference 3, 2003, 80.

[29] Torre O, Alfonso I, Gotor V. Lipase catalysed Michael addition of secondary amines to acrylonitrile[J] . Chem. Commun, 2004, 15(47): 1724-1725.

[30] Priego J, Ortiz-Nava C, Carrillo-Morales M, et al. Solvent engineering: an effective tool to direct chemoselectivity in a lipase-catalyzed Michael addition[J] . Tetrahedron, 2009, 65(2): 536-539.

[31] Kitazume T, Ikeya T, Murata K. Folded conformation of 5,15-diarylporphyrins with anthraquinonyl and dimethylaminophenyl groups attached via a sulphonyloxy group[J] . J. Chem. Soc. Chem. Commun, 1986, 75(17): 1331-1333.

[32] Kitazume T, Murata K, Kokusho Y, et al. Enzymes active in organic media: Synthesis of optically active trifluoromethylated compounds via asymmetric addition reactions[J] . J. Fluor. Chem, 1988, 39(1): 75-86.

[33] Wang S C, Johnson W H, Whitman C P. The 4-Oxalocrotonate Tautomerase and YwhB-Catalyzed Hydration of 3E-Haloacrylates: Implications for the Evolution of New Enzymatic Activities[J] . J. Am. Chem. Soc, 2003, 125(47): 14282-14283.

[34] Miyazaki T, Sato H, Sakakibara T, et al. An Approach to the Precise Chemoenzymatic Synthesis of 13C-Labeled Sialyloligosaccharide on an Intact Glycoprotein: A Novel One-Pot [3-13C] -Labeling Method for Sialic Acid Analogues by Control of the Reversible Aldolase Reaction, Enzymatic Synthesis of [3-13C] -NeuAc-α-(2→3)-[U-13C] -Gal-β-(1→4)-GlcNAc-β-Sequence onto Glycoprotein, and Its Conformational Analysis by Developed NMR Techniques[J] . J. Am. Chem. Soc, 2000, 122(24): 5678-5694.

[35] Wegman M A, Van Langen L M, F Van Rantwijk R, et al. A two-step, one-pot enzymatic synthesis of cephalexin from D-phenylglycine nitrile[J] . Biotechnol. Bioeng, 2002, 79(3): 356-361.

[36] Romisch W, Eisenreich W, Richter G, et al. Rapid One-Pot Synthesis of Riboflavin Isotopomers[J] . J. Org. Chem, 2002, 67(67): 8890-8894.

[37] Schoevaart R, Van Rantwijk F, Sheldon R A. A Four-Step Enzymatic Cascade for the One-Pot Synthesis of Non-natural Carbohydrates from Glycerol[J] . J. Org. Chem, 2000, 65(21): 6940-6943.

[38] Yao S P, Lu D S, Wu Q, et al. A single-enzyme, two-step, one-pot synthesis of N-substituted imidazole derivatives containing a glucose branch via combined acylation/Michael addition reaction[J] . Chem. Commun, 2004, 36(17): 2006-2007.

[39] Chai S J, Lai Y F, Xu J C, et al. One-Pot Synthesis of Spirooxindole Derivatives Catalyzed by Lipase in the Presence of Water[J] . Adv. Synth. Catal, 2011, 353(2-3): 371-375.

[40] X u J C, Li W M, Zheng H, et al. One-pot synthesis of tetrahydrochromene derivatives catalyzed by lipase[J] . Tetrahedron 2011, 67(67): 9582-9587.

[41] Wang J L, Liu B K, Yin C, et al. Candida antarctica lipase B-catalyzed the unprecedented three-component Hantzsch-type reaction of aldehyde with acetamide and 1,3-dicarbonyl compounds in nonaqueous solvent[J] . Tetrahedron, 2011, 67(14): 2689-2692.

[42] Wang C H, Guan Z, He Y H, et al. Biocatalytic domino reaction: synthesis of 2H-1-benzopyran-2-one derivatives using alkaline protease from Bacillus licheniformis[J] . Green Chem, 2011, 8(51): 2048-2054.

Research Progress in Enzymatic Promiscuity

Hu Ju-wu, Fu Jian-ping*, Han Xiao-dan, Xu Guo-liang, Wang Hui-bin, Xiong Wei
(Institute of Applied Chemistry, Jiangxi Academy of Sciences, Jiangxi Nanchang 330029)

Enzymatic method is efficient and green tool for modern organic synthesis due to its high selectivity, mild conditions and potential use of inexpensive regenerable resources. It is very significative to profile the novel unnatural activities of existing enzymes systematically since it might lead to improvements in existing catalytic methods and provide novel synthesis pathways which are currently not available. This ability is defined as enzymatic promiscuity and has attracted much attention and expanded rapidly in recent years. Some elegant works of enzymatic promiscuity including aldol condensation, Mannich reaction, Michael additions, Markovnikov additions and Henry reactions have been reported in the last decades, and the future research direction is suggested in the paper.

Enzymatic promiscuity; Synthesis; Reaction

Q814

A

2096-0387（2016）01-0059-06

國家自然科學基金項目（項目編號31260400）；江西省科技支撐計劃項目（項目編號20141BBF60044）。

胡居吾（1977-），男，在讀博士，副研究員，研究方向：天然產物化學。

付建平（1987-），男，碩士研究生，助理研究員，研究方向：天然產物化學。