WNT3A基因在先天性巨結(jié)腸癥中的表達(dá)研究

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院小兒外科(西安710004)

魏　強(qiáng)△　 陳　東△　徐　泉▲

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WNT3A基因在先天性巨結(jié)腸癥中的表達(dá)研究

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院小兒外科(西安710004)

魏強(qiáng)△陳東△徐泉▲

目的：探討WNT3A 基因及其相關(guān)蛋白在先天性巨結(jié)腸癥(HD)中的表達(dá)及WNT3A與HD的發(fā)病關(guān)系。 方法：利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)60例HD患者狹窄段(無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)和正常段(有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)腸管組織WNT3A的表達(dá)情況，并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行定量分析與比較。 結(jié)果：WNT3A在HD狹窄段腸管中mRNA表達(dá)量是正常段腸管中的2.6倍(P< 0.05 )。Western blot結(jié)果顯示：WNT3A在HD狹窄段腸管中蛋白相對(duì)表達(dá)量為34.56 ± 3.21，在正常段腸管中蛋白相對(duì)含量為16.37 ± 2.46(P<0.05)。結(jié)論：WNT3A mRNA與蛋白在HD狹窄段腸管中高表達(dá)，提示W(wǎng)NT3A與HD 的發(fā)生有密切關(guān)系，可能在先天性消化道畸形的腸管發(fā)育中具有重要作用。

主題詞Hirschsprung病/病理學(xué)WNT3A基因/代謝

先天性巨結(jié)腸癥(Hirschsprung's disease, HD)是一種因腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常所致的先天性消化道畸形，其發(fā)病率僅次于先天性肛門直腸畸形，位居第2位[1]。作為一種多基因遺傳病，HD主要是由于胚胎期遺傳因素和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致腸道神經(jīng)嵴細(xì)胞異常發(fā)育所引起，遺傳方面目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)十余種基因與HSCR發(fā)病相關(guān)[2]。WNT3A是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中的一個(gè)配體，可以激活Wnt信號(hào)通路，有研究發(fā)現(xiàn)：WNT3A在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和腫瘤形成過程中起重要作用[3,4]。先天性巨結(jié)腸是在胚胎發(fā)育過程中腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常所致的疾病，為此，我們利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)、蛋白印跡(Western blot)檢測(cè)WNT3A在HD狹窄段(無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)和正常段(神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)中的表達(dá)水平，探討WNT3A與HD的發(fā)病關(guān)系。

資料與方法

1材料與試劑

1.1標(biāo)本來源：收集2009～2013年經(jīng)鋇灌腸、直腸肛管測(cè)壓和術(shù)后病理切片證實(shí)的散發(fā)性HD狹窄段 (無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段) 和正常段 (有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段) 腸管組織標(biāo)本60例，其中男41例，女19 例，年齡0.5～6.5 歲，平均1.8歲；所有對(duì)象均簽訂“知情同意書”。標(biāo)本的留取均無菌取HD狹窄腸段和正常腸段腸管組織，一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定，另一部分放入經(jīng)DEPC水處理后的無菌EP管中，立即放入液氮中速凍后置于 -80℃ 冰箱中保存。

1.2主要儀器及試劑：實(shí)時(shí)定量PCR儀(Roche Molecular Bioehemicals LightCycler Operator’s Manual Version 3.5 October 2000)、電泳儀(Bio-Rad Power/Pac3000)、 高速低溫離 心機(jī) (Heraus-Biofuge-PrimoR)、組織超聲勻漿器(UP200H )、轉(zhuǎn)印電泳槽(BIO-RA D)、顯微鏡(Nikon E800，分析軟件NIS-EEMENtS br.3.0)；總RNA提取試劑盒 (Promage公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒 SuperscriptTMⅡ Rnase H Reverse Transcriptase、SYBR Green I的PCR Master Mix (TaKaRa)、全蛋白提取試劑盒(南京凱基公司)、β- actin抗體(Sigma公司 )、WNT3A蛋白抗體(兔抗人，試劑編號(hào)：09-162，Millipore Co.)、DAB試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

2方法

2.1qRT-PCR檢測(cè)：①總RNA提取與定量：取各組織標(biāo)本100mg，剪碎研磨，參照TRIzolTMRNA Isolation Reagent使用說明提取總RN A；RNA濃度檢測(cè) (紫外分光光度法)，-80 ℃保存；②cDNA合成： 應(yīng)用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit將總RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄(RT)體系10 μl，包括5×PrimescriptTMBuffer (for real time) 2 μl，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix Ⅰ 0.5 μl，Oligo dT Prime (50 μM ) 0.5 μl，Random 6mer (100 μM ) 0.5 μl，總RNA (< 500 ng)，Rnase Free dH2O 加至10 μl。 反應(yīng)條件為 37℃ 15 min，85℃ 5 s；③qRT-PCR反應(yīng)：采用SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒，取cDNA樣品，分別作10倍倍比稀釋(105、104、103、102、101、100copies/μl)，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，判斷熒光定量PCR的擴(kuò)增效率。在 12.5 μl反應(yīng)體系中，倍比稀釋濃度的cDNA樣品和原液各加入 1 μl，加入SYBR熒光定量PCR混合試劑 6.25 μl及上、下游引物混合液 0.25 μl、滅菌超純水補(bǔ)足至12.5 μl。熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)(見表 1)；④qRT-PCR分析：分別測(cè)定每個(gè)樣品WNT3A和β-actin mRNA的Ct值，每個(gè)樣品均作三次重復(fù)管以減少操作誤差。Ct值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值則越小。采用相對(duì)定量方式表示各樣品WNT3A的△ Ct，△Ct = Ct目的基因 - Ct內(nèi)參基因。再依據(jù)△△Ct = △Ct目的基因 - △Ct參照基因，計(jì)算2-△△ct。 當(dāng)目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率接近時(shí)，2-△△ct表示所檢測(cè)樣品目的基因相對(duì)于參照基因的表達(dá)倍數(shù)。

表1　引物序列、產(chǎn)物大小及退火溫度

2.2Western blot 檢測(cè)： ①提取總蛋白：取各組織約50mg經(jīng)剪碎、勻漿后低溫離心，全蛋白提取試劑盒提取總蛋白(改良Lowry法測(cè)定蛋白)，-20℃保存?zhèn)溆?；②電泳：取總蛋?100 μl，加樣品緩沖液(Loading buffer，按 4∶1 加入)，蛋白變性機(jī) 100℃ 變性 5min。經(jīng) 5% SDS-PAGE積層膠、10% 分離膠 80v 電泳 120 min；③轉(zhuǎn)印：按照濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙順序轉(zhuǎn)印，100V90 min；④封閉：轉(zhuǎn)印完成后將 PVDF 膜放入 5% 脫脂奶粉液中封閉 1.0 h；⑤一抗雜交：PVDF膜在一抗溶液中 4℃ 過夜[兔抗人WNT3A (1∶1000稀釋，分子量45kDa)和GADPH 抗體(1∶5000，TBST 配制，36kDa)]；⑥洗膜 10 min×3 次，將 PVDF 膜轉(zhuǎn)加到辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(濃度1∶2000)二抗溶液中室溫?fù)嵊?1.5 h；⑦洗膜 10 min×3次，ECL 照相；⑧凝膠圖像分析系統(tǒng)(GIS-2020凝膠圖像掃描儀)掃描分析結(jié)果，以相對(duì)灰度值代表蛋白表達(dá)量，相對(duì)OD值 = WNT3A 的OD/β-actin OD。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 SPPS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

結(jié)　果

1 qRT-PCR結(jié)果WNT3A 在狹窄段腸管中 mRNA 的表達(dá)量是正常段腸管的 2.6 倍(見表 2)，由此可見，狹窄段WNT3A mRNA 表達(dá)顯著高于正常段腸管的表達(dá)水平(P<0.05)，見圖 1。

2Western blot 結(jié)果WNT3A 在 HD 狹窄段腸管中蛋白相對(duì)含量34.56 ± 3.21，在正常段腸管中蛋白相對(duì)含量為16.37 ± 2.46，二者相比有顯著性差異(P<0.05)。由此可見，狹窄段WNT3A 蛋白的表達(dá)顯著高于正常段腸管的表達(dá)水平，詳見圖 2。

圖1HD WNT3A qRT-PCR 結(jié)果(A和C：溶解曲線；B和D：擴(kuò)增曲線)

表2　WNT3A在mRNA水平上的相對(duì)表達(dá)量

圖2WNT3A在HD中的蛋白表達(dá)結(jié)果 (WNT3A在 HD 中 Western Blot 檢測(cè)結(jié)果：泳道1和3為HD 狹窄段；泳道2和4為 HD 正常段)

討　論

HD是小兒最常見的先天性消化道畸形，發(fā)病率占存活嬰兒的1/5000[1]，以病變腸管缺失神經(jīng)節(jié)細(xì)胞致使腸道蠕動(dòng)障礙為特點(diǎn)，臨床常表現(xiàn)為生后胎糞排出延遲，腹脹等低位性腸梗阻，稍大小孩可表現(xiàn)為頑固性便秘。HD的發(fā)生和腸管神經(jīng)系統(tǒng)的異常發(fā)育密切相關(guān)，并涉及一系列復(fù)雜的過程，包括神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在胚胎期不同階段的異常發(fā)育[5,6]。WNT3A是WNT3A是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中的一個(gè)配體，在經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中起重要作用。目前已有研究認(rèn)為WNT3A 與神經(jīng)形成和胚胎發(fā)育關(guān)系密切[3,7]。

在本研究中，我們選擇了60例散發(fā)性HD患者的狹窄段和正常段腸管組織，通過qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn):

WNT3A 在狹窄段腸管中 mRNA 的表達(dá)量是正常段腸管的 2.6 倍。之后又通過Western blot對(duì)其在蛋白水平上進(jìn)行了檢測(cè)，得到了類似的結(jié)果，即WNT3A 蛋白在狹窄段的表達(dá)明顯高于正常段的表達(dá)量。

WNT3A在胚胎發(fā)育過程中起重要作用，可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的形成和分化，先天性巨結(jié)腸患者由于某種原因使神經(jīng)細(xì)胞遷移、分化異常，導(dǎo)致腸管神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如。在機(jī)體存在多種反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，當(dāng)腸管出現(xiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如時(shí)，可能通過開放某種通路使WNT3A表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞的遷移異常。WNT3A是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵配體之一，主要通過經(jīng)典Wnt 信號(hào)途徑發(fā)揮生物學(xué)功能[7]。據(jù)此我們推測(cè):胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞遷移異常時(shí)，可能通過經(jīng)典Wnt信號(hào)通路促使WNT3A表達(dá)上調(diào)，試圖使腸管神經(jīng)節(jié)分布正常。

本研究證實(shí)：HD患者中WNT3A在 mRNA 和蛋白水平表達(dá)上調(diào)，說明WNT3A 可能參與HD的發(fā)生，是 HD 的病因之一，并在腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起一定作用。但 HD 的發(fā)生并不是任何一個(gè)單一因素和指標(biāo)所能完全解釋的，因此進(jìn)一步深入研究WNT3A 與 HD 發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制是十分必要的。

[1]Langer JC. Hirschsprung diseas [J]. Curr Opin Pediatr, 2013, 25(3): 368-374.

[2]Jiang Q, Ho YY, Hao L,etal. Copy number variants in candidate genes are genetic modifiers of Hirschsprung disease[J]. PLoS One, 2011, 6(6): e21219.

[3]Spence JR, Mayhew CN, Rankin SA,etal. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro[J]. Nature, 2011, 470(7332): 105-109.

[4]Qi L, Song W, Liu Z,etal. Wnt3a promotes the vasculogenic mimicry formation of colon cancer via Wnt/β-catenin signaling[J]. Int J Mol Sci, 2015,16(8): 18564-18579.

[5]Lake JI, Heuckeroth RO. Enteric nervous system development: migration, differentiation, and disease[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2013, 305(1): G1-24.

[6]Martucciello G. Hirschsprung's disease, one of the most difficult diagnoses in pediatric surgery: a review of the problems from clinical practice to the bench[J]. Eur J Pediatr Surg, 2008, 18(3):140-149.

[7]Lambert C, Cisternas P, Inestrosa NC. Role of wnt signaling in central nervous system injury[J]. Mol Neurobiol, 2016, 53(4):2297-2311.

(收稿：2016-03-20)

R725.7

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10.3969/j.issn.1000-7377.2016.09.005

△西安市兒童醫(yī)院普外二科