尿激酶對(duì)大鼠肺成纖維細(xì)胞凋亡的影響*

邵景韞　劉 　安　杜旭升　郭　華　陳明偉

西安市中心醫(yī)院呼吸科(西安710003)

?

尿激酶對(duì)大鼠肺成纖維細(xì)胞凋亡的影響*

邵景韞劉 安杜旭升郭華陳明偉▲

西安市中心醫(yī)院呼吸科(西安710003)

目的：探討尿激酶(Urokinase，UK)對(duì)大鼠肺成纖維細(xì)胞凋亡的影響。方法：5只SD雄性大鼠氣管內(nèi)灌注博萊霉素造肺纖維化模型，將模型組肺成纖維細(xì)胞與不同濃度的尿激酶培養(yǎng)24～96h，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡。結(jié)果：尿激酶以時(shí)間和濃度依賴的方式抑制肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到凋亡小體。結(jié)論：尿激酶能抑制肺成纖維細(xì)胞增殖，與凋亡有關(guān)。

主題詞成纖維細(xì)胞/藥物作用肺細(xì)胞凋亡博萊霉素/化學(xué)誘導(dǎo)尿激酶/治療應(yīng)用模型，動(dòng)物大鼠

肺纖維化發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速、病死率高，近年來，發(fā)病呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量及預(yù)后的慢性肺部疾患[1]，其發(fā)病機(jī)制不明確，無有效治療手段。臨床上應(yīng)用尿激酶防治炎性胸膜炎形成的胸膜粘連、肥厚的治療，但肺纖維化方面的研究很少。本研究通過尿激酶對(duì)大鼠肺成纖維細(xì)胞凋亡的影響，探討肺纖維化的發(fā)生機(jī)制。

材料與方法

1材料與儀器注射用鹽酸博萊霉素粉劑購于日本化藥株式會(huì)社，用生理鹽水配成5g/ L；尿激酶粉針劑購于天津生物化學(xué)制藥有限公司；MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購于南京凱基生物；Vimentin(種屬：小鼠)購于武漢博士德生物工程有限公司；Cy3標(biāo)記羊抗小鼠IgG購于武漢博士德生物工程有限公司；Triton×100、DAPI購于碧云天生物技術(shù)公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購于美國B-D公司。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1制備大鼠肺纖維化模型：模型組取清潔級(jí)雄性SD大鼠5只購于第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，平均體重220.5±14.5g，采用Mitsuhashi H方法，氯胺酮按大鼠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，無菌下行頸正中切口，逐層分離暴露氣管，氣管插管注入0.3～0.5ml(5mg/kg)博萊霉素[2]，立即翻轉(zhuǎn)動(dòng)物藥物在肺內(nèi)均勻分布，繼續(xù)飼養(yǎng)。

2.2肺成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、純化與鑒定：取模型組大鼠5只，平均體重220.5±14.5g，處死大鼠，無菌剝離大鼠肺臟，培養(yǎng)大鼠肺成纖維細(xì)胞，對(duì)第四代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定，一抗為小鼠Vimentin，二抗為Cy3標(biāo)記羊抗小鼠IgG對(duì)大鼠肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，熒光顯微鏡下鑒定肺成纖維細(xì)胞。

2.3MTT法觀察尿激酶對(duì)肺成纖維細(xì)胞增生的作用：取3～5代大鼠肺成纖維細(xì)胞，以2.5g/L胰蛋白酶消化，分別收集計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為4×107/L，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，為200μl無菌PBS，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，加入5、10、20、30×106U/L含尿激酶的培養(yǎng)基，設(shè)10個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24，48，72，96h，每孔再加入含MTT的DMEM培養(yǎng)基100μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸出孔內(nèi)液體，加入150μlDMSO，酶標(biāo)儀OD568nm測(cè)定各孔吸光值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，以時(shí)間為橫軸，OD值為縱軸。

2.4觀察尿激酶對(duì)大鼠肺成纖維細(xì)胞的凋亡：流式細(xì)胞儀結(jié)合PI及Annexin V-FITC雙標(biāo)記染色測(cè)定細(xì)胞凋亡：取3～5代大鼠肺成纖維細(xì)胞，分別加入5、10、20、30×106U/LUK后培養(yǎng)24h，經(jīng)胰蛋白酶消化后移入離心管，洗滌、離心，棄上清，加入buffer溶液，吹打致密度為4×108/L，取100μl，暗處加入Annexin V和PI各5μl，振蕩混勻，室溫避光30min上樣，用流式細(xì)胞儀分析凋亡率。

結(jié)　果

1肺FB鑒定結(jié)果肺FB經(jīng)7～10d培養(yǎng)后鋪滿瓶底，細(xì)胞為梭形，呈放射狀或柵欄狀排列，加入Vimentin一抗及熒光二抗后，從加熒光二抗起，所有操作都在較暗處進(jìn)行。滴加DAPI避光孵育5min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，熒光染色細(xì)胞核DAPI染色藍(lán)色，細(xì)胞漿波形蛋白陽性表達(dá)，即紅色(見圖1)。

2UK對(duì)大鼠肺FB增殖抑制作用加入5、10、20、30×106U/L的UK24h后的OD 568nm較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，提示UK以時(shí)間和劑量依賴方式抑制大鼠成纖維細(xì)胞增殖(見圖2)。

圖1　大鼠肺成纖維細(xì)胞波形蛋白免疫熒光染色(×400)

圖2尿激酶對(duì)大鼠肺成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線[系列1～5：對(duì)照組、5×106U/L，10×106U/L，20×106U/L，30×106U/L尿激酶]

3UK對(duì)大鼠肺成纖維細(xì)胞凋亡的作用流式細(xì)胞儀結(jié)合PI及Annexin V-FITC雙標(biāo)記染色檢測(cè)示尿激酶作用大鼠肺成纖維細(xì)胞后，可見明顯凋亡小體或凋亡細(xì)胞。

討　論

肺纖維化是由多種病因引起的慢性肺泡間質(zhì)性炎癥，肺泡結(jié)構(gòu)進(jìn)行性損害，細(xì)胞外基質(zhì)及膠原沉積為特征的疾病。肺纖維化晚期為肺間質(zhì)纖維化和蜂窩肺[3]。肺成纖維細(xì)胞是肺纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞，肺纖維化發(fā)病可能與成纖維細(xì)胞過度增殖、不能及時(shí)凋亡有關(guān)[4]，成纖維細(xì)胞凋亡減少可能導(dǎo)致持續(xù)的修復(fù)過程失調(diào)引發(fā)纖維化[5]。

尿激酶在體外能抑制細(xì)胞外基質(zhì)中膠原合成，起到抗纖維化的作用。UPA參與血管新生，基質(zhì)重構(gòu)、ECM降解，與肺纖維化密切相關(guān)[6]。肺纖維化時(shí)UPA與PAI-1表達(dá)失衡，UPA下降，其抑制劑PAI-1增加，增加UPA可減降低肺纖維化程度。

本研究中鑒定成纖維細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞漿波形蛋白陽性表達(dá)(即紅色)，證實(shí)為成纖維細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)：MTT比色法觀察到UK對(duì)肺纖維化大鼠肺成纖維細(xì)胞作用24～96h，不同濃度尿激酶組OD568nm值均低于對(duì)照組，顯示UK以時(shí)間和劑量依賴方式抑制細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞儀結(jié)合PI及AnnexinV-FITC雙標(biāo)記染色檢測(cè)可見B2、B4區(qū)可見凋亡細(xì)胞，證明UK抑制大鼠肺成纖維細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)表明：尿激酶抑制大鼠肺成纖維細(xì)胞增殖通過誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡發(fā)生。促進(jìn)肺損傷過程中成纖維細(xì)胞的及時(shí)凋亡有望成為治療肺纖維化的有力措施。

[1]Jordan RC,Erin EM.Recent evidence for pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis[J].Annals of Pharmacotherapy，2014，48(12)：1611-1619.

[2]劉延梅,馬少君,苗 青,等.川穹嗪聯(lián)合胚胎干細(xì)胞治療大鼠肺纖維化的機(jī)制研究[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2014,43(1):10-14.

[3]Noble PW,Barkauskas CE,Jiang D.Pulmonary fibrosis ：patterns and perpetrators[J].J Clin Invest, 2012,122(8):2756-2762.

[4]Nho RS,Peterson M,Hergert P,etal.FoxO3a (Forkhead Box O3a) deficiency protects idiopathic pulmonary fibrosis(IPF) fibroblasts from type I polymerized collagen matrix-induced apoptosis via caveolin-1 (cav-1) and fas[J]. PLoS One，2013,8(4):e61017.

[5]張效云,李琦.細(xì)胞自噬與肺纖維化[J].生理科學(xué)進(jìn)展,2015,46(4):314-316.

[6]張紓難,賈明月,于 洋.近5年中醫(yī)呼吸病學(xué)術(shù)發(fā)展述評(píng)[J].世界中醫(yī)藥，2014，9(8)：969-973.

(收稿：2016-03-20)

Effect of urokinase on apoptosis of pulmonary fibroblasts in rats

Department of Respiratory Medicine,Xi’an Central Hospital (Xi’an710003)

Shao JingyunLiuAnDu Xushenget al

Objective: To study the effect of urokinase on apoptosis of pulmonary fibroblasts in rats.Methods:Five SD male rats were modeled pulmonary fibrosis modelling by endotracheal perfusion bleomycin.Pulmonary fibroblasts in the model group were cultured with urokinase of different concentrations for 24～96 hours. Cell apoptosis was examined by flow cytometry.Results:Urokinase inhibited pulmonary fibroblasts in time and concentration dependent manners.Apoptosis bodies were found by flow cytometry.Conclusion: Urokinase can inhibit the proliferation of fibroblast，which isrelated to cell apoptosis.

Fibroblasts/drug effectiveLungApoptosisBleomycin/ chemically inducedUrokinase/therapeutic useModel,animalRats

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科

R563

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.09.002

*陜西省科技研究發(fā)展計(jì)劃(2014KCT-23)

陜西省西安市科技計(jì)劃項(xiàng)目[SF1316(1)]