低濃度過氧化氫預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用

梁東蘭 黃 宏 荊 昭 徐 祥, 劉曉萍

（1.青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266021；2.第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所，創(chuàng)傷燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042）

創(chuàng)面修復(fù)基礎(chǔ)與臨床·論著

低濃度過氧化氫預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用

梁東蘭1黃 宏2荊 昭1徐 祥1,2劉曉萍1

（1.青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266021；2.第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所，創(chuàng)傷燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042）

目的：觀察低濃度過氧化氫(H2O2)預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）移植到大鼠組織缺損創(chuàng)面后BMSCs在創(chuàng)面的存活情況及其對(duì)創(chuàng)面的促愈合作用。方法: 75只SD大鼠,于背部中線靠頸側(cè)制備直徑1 cm的圓形全層皮膚缺損。按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組（每組25只）：生理鹽水組、單純BMSCs組和H2O2預(yù)處理BMSCs組。在傷后即刻，分別經(jīng)尾靜脈注射等體積（0.5 ml）的生理鹽水、CM-Dil標(biāo)記的BMSCs懸液或50 μmol/L H2O2預(yù)處理12 h并經(jīng)CM-Dil標(biāo)記的BMSCs。傷后0～15 d創(chuàng)面拍照，用Image Proplus 5.0 圖像分析軟件分析圖像，計(jì)算創(chuàng)面愈合率；傷后1、2、5 d熒光顯微鏡下觀察兩BMSCs組創(chuàng)面BMSCs的數(shù)量；CD31免疫組化染色觀察創(chuàng)面微血管密度的變化。結(jié)果：①創(chuàng)面干細(xì)胞數(shù)量：移植H2O2預(yù)處理的BMSCs后，創(chuàng)面干細(xì)胞數(shù)量明顯多于單純BMSCs移植組（P＜0.05和P＜0.01）。與傷后第1天比較，單純BMSCs組傷后第2天和第5天創(chuàng)面干細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；而預(yù)處理組創(chuàng)面干細(xì)胞數(shù)量雖然也呈進(jìn)行性減少，但3個(gè)時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面的干細(xì)胞數(shù)量差異沒有顯著性（P＞0.05）。②創(chuàng)面愈合率：創(chuàng)傷后5～15 d，單純BMSCs組和H2O2預(yù)處理BMSCs組創(chuàng)面愈合率均明顯高于生理鹽水組（P＜0.05或P＜0.01）；創(chuàng)傷后5～10 d，H2O2預(yù)處理組創(chuàng)面愈合率明顯高于單純BMSCs組（P＜0.05）。③創(chuàng)面微血管數(shù)量：CD31免疫組化結(jié)果顯示，傷后3 d，兩BMSCs治療組之間血管數(shù)量差異無顯著性；傷后5、7、10 d，H2O2預(yù)處理組創(chuàng)面微血管數(shù)量顯著多于單純BMSCs組（P＜0.05）。結(jié)論：BMSCs經(jīng)低濃度H2O2預(yù)處理再移植到創(chuàng)面，可以延長移植干細(xì)胞在創(chuàng)面的存活時(shí)間，并具有更好的促進(jìn)創(chuàng)面愈合和血管生成的修復(fù)潛能。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 過氧化氫 預(yù)處理 移植 創(chuàng)面愈合

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 H2O2購自成都科龍化工試劑廠，DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國 HyClone公司，胎牛血清、胰酶替代物購自美國GIBCO 公司，CM-Dil染料購自美國Molecular Probes公司，CD31抗體（bs-0468R）購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；β-actin購于北京四正柏生物科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 電泳儀（美國，BIO-RAD），ELISA試劑盒（購于武漢博士德生物工程有限公司，EK0366），紫外分光光度儀（購于SHIMADZV,UVmini-1240）；半干轉(zhuǎn)膜儀（購于BIO-RAD，221BR48134），酶標(biāo)儀（購于美國伯騰儀器有限公司，SN253724），外用人重組rhGM-CSF 凝膠，由長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，規(guī)格為每支10 g，每支含100μg rhGMCSF。

1.2 方 法

1.2.1 小鼠BMSCs的分離培養(yǎng) 4～6周清潔級(jí)昆明小鼠，體重20～25 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按常規(guī)方法分離培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）。將處死后的小鼠浸泡于75%乙醇5～10 min后，取出雙側(cè)股骨、脛骨，放入盛有PBS（含有抗生素）培養(yǎng)皿中，用鑷子和組織剪將骨頭上的肌肉組織清除干凈，用1 ml無菌注射器吸入1 ml培養(yǎng)基后針尖穿透股骨、脛骨骨骺兩端，將骨髓沖到無菌培養(yǎng)皿，反復(fù)沖洗，直至骨髓全部沖洗出來，制成細(xì)胞懸液。將其轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后去掉懸浮細(xì)胞及組織碎片，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長至近80%融合時(shí)，去除培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加入胰酶消化傳代。3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 BMSCs的CM-Dil標(biāo)記 經(jīng)H2O2（50 μmol/L）預(yù)處理12 h的BMSCs[4-5]和未經(jīng)預(yù)處理的BMSCs （1×107個(gè)/ml）通過CM-Dil標(biāo)記后移植給全層皮膚缺損傷的SD大鼠（0.5 ml/只）。首先，用二甲基亞砜將CM-Dil配制成1 mg/ml，用PBS將其稀釋為0.1 mg/ml。BMSCs懸液中加入0.1 mg/ml CM-Dil，使其終濃度為2 μg/ml。37 ℃孵育10 min，4 ℃孵育15 min。加入DMEM/F12無血清培養(yǎng)基重懸，臺(tái)盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞活力，將其最終細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個(gè)/ml。

1.2.3 皮膚創(chuàng)傷模型建立與分組 7～8周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠75只，體重220～240 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有大鼠剔除背部毛發(fā)，采用速眠新II(主要成分為佛呱啶醇、保定寧、雙氫埃托啡等) 肌肉注射麻醉(1 ml/ kg)。背部脫毛皮膚處常規(guī)消毒，尺子量取耳沿到背部中心4.5 cm處，用眼科剪剪除皮膚組織至筋膜層,形成直徑1 cm圓形全層皮膚缺損，用無菌紗布擦去創(chuàng)面出血。

按隨機(jī)數(shù)字表法將皮膚創(chuàng)傷大鼠隨機(jī)分為3組：生理鹽水對(duì)照組（NS組）、單純BMSCs組和H2O2預(yù)處理BMSCs組，每組25只動(dòng)物。分別將0.5 ml 的生理鹽水、CM-Dil標(biāo)記的未經(jīng)或經(jīng)過H2O2預(yù)處理的BMSCs細(xì)胞懸液注射入大鼠尾靜脈。觀察傷后0～15 d創(chuàng)面大小，于傷后1、2、3、5、7和10 d 處死動(dòng)物獲取創(chuàng)面組織，部分標(biāo)本于40 g/L多聚甲醛固定12 h后，200 g/L蔗糖溶液4 ℃避光保存，用于組織學(xué)觀察。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 創(chuàng)面CM-Dil標(biāo)記的BMSCs數(shù)量 固定的創(chuàng)面組織行冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察、拍照，CM-Dil標(biāo)記的BMSCs在熒光顯微鏡TRITC模式下呈現(xiàn)紅色熒光。傷后1、2、5 d各選一張組織標(biāo)本切片，每張切片選取5個(gè)高倍視野（×200），利用Image Proplus5.0圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算CM-Dil標(biāo)記細(xì)胞（紅色）總數(shù)，由此計(jì)算出每張切片每高倍視野的平均BMSCs數(shù)量。

1.3.2 創(chuàng)面愈合率 用Image Proplus 5.0圖像分析軟件分析傷后0～15 d創(chuàng)面拍攝照片，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。計(jì)算公式為：創(chuàng)面愈合率=(創(chuàng)面初始面積一各時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面實(shí)際面積)/創(chuàng)面初始面積×100%。

1.3.3 CD31免疫組化染色 通過CD31免疫組化染色計(jì)數(shù)血管。創(chuàng)面組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)病理脫水、包埋、切片（厚度5 μm）。切片再經(jīng)脫蠟、水化和微波抗原修復(fù)， 0.3%過氧化氫孵育30 min；以10%正常山羊血清封閉后；滴加一抗CD31(1∶100) 4 ℃過夜；次日，加入生物素化二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素，分別經(jīng)37 ℃孵育30 min,DAB 顯色；蘇木精染核；中性樹膠封片。顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞為胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒。計(jì)數(shù)由陽性細(xì)胞構(gòu)成的微血管數(shù)。觀察5個(gè)400倍視野，計(jì)數(shù)微血管，取其平均值作為微血管密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，經(jīng)SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析及組間兩兩比較SNK檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 H2O2預(yù)處理對(duì)移植BMSCs在創(chuàng)面存活的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與單純BMSCs移植組比較，經(jīng)H2O2預(yù)處理后的BMSCs移植到創(chuàng)面后，傷后各時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面的干細(xì)胞數(shù)量明顯增多（P＜0.05）。各組內(nèi)比較，單純BMSCs組傷后第2天和第5天創(chuàng)面干細(xì)胞數(shù)量呈進(jìn)行性下降，均顯著少于第1天（P＜0.05和P＜0.01），而第5天較第2天更為減少（P＜0.05）；H2O2預(yù)處理組干細(xì)胞數(shù)量雖然也呈進(jìn)行性減少，但3個(gè)時(shí)相點(diǎn)間差異無顯著性（P＞0.05）。見圖1（封二）和圖2。

圖2 移植經(jīng)過或未經(jīng)過低濃度H2O2預(yù)處理的BMSCs后創(chuàng)面組織中CM-Dil標(biāo)記的BMSCs數(shù)量

2.2 創(chuàng)面愈合率 干細(xì)胞移植后前3 d，3組創(chuàng)面愈合率差異無顯著性（P＞0.05）。創(chuàng)傷5 d以后，單純BMSCs移植組和H2O2預(yù)處理組兩組創(chuàng)面愈合率明顯高于生理鹽水組（P＜0.05）；創(chuàng)傷后7～10 d，與單純BMSCs移植組比較，H2O2預(yù)處理組創(chuàng)面愈合率顯著增加（P＜0.05），于傷后10 d創(chuàng)面幾乎完全愈合，而單純BMSCs組于傷后15 d完全愈合。見圖3（封二）和圖4。

2.3 創(chuàng)面微血管密度 傷后3 d，兩組之間血管數(shù)量差異無顯著性；傷后5～10 d H2O2預(yù)處理組創(chuàng)面微血管密度顯著多于單純BMSCs組（P＜0.05）；傷后第7天，兩組微血管密度達(dá)峰值。提示低濃度H2O2預(yù)處理能夠增強(qiáng)創(chuàng)面血管生成，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。見圖5（封二）和圖6。

圖4 大鼠創(chuàng)面移植經(jīng)過或未經(jīng)低濃度H2O2預(yù)處理的BMSCs后不同時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面愈合率的變化

圖6 大鼠創(chuàng)面移植經(jīng)過或未經(jīng)低濃度H2O2預(yù)處理的BMSCs后不同時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面微血管密度的變化（免疫組化染色×200）

3 討 論

BMSCs具有易于分離培養(yǎng)獲得、低免疫源性、多向分化潛能及旁分泌功能等特性，已經(jīng)應(yīng)用于缺血性疾病和組織再生創(chuàng)傷修復(fù)治療[10]，BMSCs治療皮膚創(chuàng)傷的研究已開展十余年[1-3,11]。盡管如此，干細(xì)胞移植治療仍面臨很多問題，其中，最大的問題是移植后到達(dá)損傷部位的干細(xì)胞存活能力差，發(fā)生快速大量凋亡，導(dǎo)致了干細(xì)胞治療應(yīng)用受限和療效不盡人意[8-9]。干細(xì)胞要發(fā)揮生物學(xué)功能需要有足夠數(shù)量的存活細(xì)胞，這是干細(xì)胞治療的基礎(chǔ)。因此，增強(qiáng)移植干細(xì)胞生存活力和抗凋亡能力成為提高此技術(shù)療效的關(guān)鍵。

有研究顯示，移植入缺血心臟內(nèi)的干細(xì)胞生存能力很差[6-7]，通常移植后24～48 h有90%的移植細(xì)胞死亡；另有研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞移植入人體后成活率低于1%，其中99%的植入細(xì)胞進(jìn)入外周血或發(fā)生凋亡[12]，如此大大限制了干細(xì)胞的修復(fù)再生能力。生存環(huán)境惡劣是移植干細(xì)胞生存率下降的主要原因。創(chuàng)面區(qū)的缺血、缺氧、炎細(xì)胞浸潤等因素，可導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)，過量的活性氧（ROS）損害間充質(zhì)干細(xì)胞的活性，降低其在損傷區(qū)的存活率。有研究表明H2O2預(yù)處理具有細(xì)胞保護(hù)作用[5-6]。我們的前期體外實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)道都證實(shí)低濃度H2O2預(yù)處理能夠顯著增強(qiáng)BMSCs抵抗氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的能力，增強(qiáng)其生存活力[5-7]。為此，本研究通過建立大鼠全層皮膚缺損模型，移植經(jīng)50 μmol/L H2O2預(yù)處理12 h的BMSCs治療大鼠全層皮膚損傷，結(jié)果顯示，與單純生理鹽水組比較，BMSCs移植治療創(chuàng)面，其創(chuàng)面愈合率明顯增高，提示干細(xì)胞移植治療能促進(jìn)創(chuàng)面愈合；而經(jīng)過H2O2預(yù)處理的BMSCs移植治療創(chuàng)面，其創(chuàng)面關(guān)閉較單純BMSCs治療更加提前，傷后10 d創(chuàng)面已經(jīng)完成關(guān)閉，其促愈作用強(qiáng)于未經(jīng)H2O2預(yù)處理的BMSCs。提示低濃度H2O2預(yù)處理能夠顯著提高移植的BMSCs修復(fù)再生能力，從而增強(qiáng)其創(chuàng)面修復(fù)能力。

本研究通過CM-Dil干細(xì)胞示蹤技術(shù)觀察進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，低濃度H2O2預(yù)處理BMSCs能增強(qiáng)其移植后在創(chuàng)面存活的時(shí)間，表現(xiàn)為傷后1、2、5 d各時(shí)相點(diǎn)BMSCs的數(shù)量顯著多于單純BMSCs移植組，并且到傷后5 d其數(shù)量也沒有明顯下降。由此表明，H2O2預(yù)處理可能增強(qiáng)了移植BMSCs在創(chuàng)面的抗凋亡能力，細(xì)胞存活數(shù)量增加，在創(chuàng)面的存活時(shí)間延長，也因此提高了干細(xì)胞移植治療效率，即相對(duì)于單純的BMSCs移植治療創(chuàng)面關(guān)閉提前，創(chuàng)面愈合率提高。

新生血管生成是創(chuàng)面愈合的前提，大量研究證實(shí)BMSCs移植能夠促進(jìn)創(chuàng)面血管生成[2-3,11]，干細(xì)胞移植后一方面整合于受損的血管內(nèi)皮，直接分化成熟為新血管；另一方面以旁分泌細(xì)胞因子方式促進(jìn)局部缺血組織的血管新生，而后一種機(jī)制起著更主要的作用。BMSCs能夠分泌大量趨化、生長因子，包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、成血管生成素（Ang）、纖維細(xì)胞生長因子、肝細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1等，這些因子可以促進(jìn)新生血管生成。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明，經(jīng)低濃度H2O2預(yù)處理干細(xì)胞移植治療創(chuàng)面，能顯著促進(jìn)創(chuàng)面微血管密度增加，由此增強(qiáng)創(chuàng)面新生血管的生成。提示H2O2預(yù)處理可能增強(qiáng)創(chuàng)面BMSCs存活，增加創(chuàng)面BMSCs數(shù)量，從而增強(qiáng)其旁分泌促血管生成因子的量，以促進(jìn)創(chuàng)面血管新生，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

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Effect of bone mesenchymal stem cells pre-incubated with low-concentration hydrogen peroxide on promoting wound healing

Liang Donglan*, Huang Hong, Jing Zhao, Xu Xiang, Liu Xiaoping.
*School of Basic Medicine, Qingdao University, Qingdao 266021, Shangdong, China

Xu Xiang (E-mail:xiangxu@ymail.com) Liu Xiaoping (E-mail:xplyu2008@126.com)

Objective: To observe the survival of transplanted bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) preincubated with low-concentration hydrogen peroxide (H2O2) in skin wounds of rats with acute skin defect, and to evaluate its efficiency for promoting wound healing. Methods: Seventy-five SD rats with acute full-thickness skin defect (round, 1 cm in diameter) at the dorsal midline were randomly divided into three groups: normal saline (NS) group, BMSCs alone group and H2O2pre-incubated BMSCs group, with 25 animals in each group. After the excisional wounds were performed, rats in the three groups were immediately injected with normal saline, BMSCs (1×107), and BMSCs (1×107) pre-incubated by 50 μmol/L H2O2for 12 hours, respectively. In order to trace the transplanted BMSCs, BMSCs were labeled with CM-Dil before transplantation. The wounds were photographed on day 0 to 15, the image was analyzed by Image Proplus 5.0 software, and the healing rate of the wound was calculated. The abundance of transplanted cells at the wound sites was observed under fluorescence microscope on days 1, 2, and 5. Immunohistochemical staining of CD31 was used to evaluate the changes in microvessel density at the wound sites.Results: Compared to the BMSCs alone group, the abundance of transplanted cells at wound sites was significantly increased when BMSCs were pre-incubated by H2O2before transplantation (P＜0.05 or P＜0.01). The numbers of BMSCs at the wound sites were significantly decreased on days 2 and 5 after injection of BMSCs compared to day 1 (P＜0.05) in BMSCs alone group, while the decrease was not statistically significant in the H2O2-preincubated BMSCsgroup (P＞0.05). The healing rate of wound in BMSCs alone group and H2O2-preincubated BMSCs group were significant higher than that in the NS group on day 5 to day 15 post-injury (P＜0.05 or P＜0.01), and it was higher in the H2O2-preincubated BMSCs group than in the BMSCs alone group on day 5 to day 10 post-injury (P＜0.05). The density of microvessels at wound sites showed no significant difference between the two BMSCs groups on day 3 post-injury. However, the microvessel density was significantly increased in H2O2-preincubated BMSCs group compared with the BMSCs simple group on days 5, 7 and 10 post-injury (P＜0.05). Conclusions: A low-concentration H2O2pre-incubation could prolong the survival time of implanted BMSCs, and promote angiogenesis and wound healing, thus providing a novel strategy to improve the efficacy of mesenchymal stem cells-based therapy for cutaneous wound.

Bone marrow mesenchymal stem cells; Hydrogen peroxide; Pre-incubation; Transplantation; Wound healing干細(xì)胞移植是嚴(yán)重、難愈創(chuàng)面治療的希望策略[1-2]。目前，已有應(yīng)用干細(xì)胞移植治療糖尿病難愈創(chuàng)面和嚴(yán)重組織毀損創(chuàng)面的報(bào)道[1-3]。然而，臨床實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)表明，移植干細(xì)胞在創(chuàng)面發(fā)生大量快速凋亡導(dǎo)致移植治療療效不佳，制約了此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用，故增強(qiáng)移植后干細(xì)胞存活和抗凋亡能力是解決這一難題的關(guān)鍵[4-5]。干細(xì)胞預(yù)處理是增強(qiáng)干細(xì)胞存活抵抗凋亡的重要手段[4-7]，通過應(yīng)用趨化因子、生長因子、藥物、缺氧和過氧化氫（H2O2）等手段預(yù)處理干細(xì)胞可以明顯改善干細(xì)胞的存活能力，激發(fā)出細(xì)胞自我保護(hù)效應(yīng)。研究證實(shí)體外低濃度H2O2預(yù)處理干細(xì)胞能顯著增強(qiáng)細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡，增強(qiáng)其生存活力[8-9]。基于上述研究結(jié)果，本研究主要通過建立大鼠全層皮膚缺損傷模型，觀察創(chuàng)面移植經(jīng)低濃度H2O2預(yù)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）后BMSCs在創(chuàng)面的存活情況，同時(shí)觀察預(yù)處理BMSCs對(duì)創(chuàng)面的促愈作用以及對(duì)創(chuàng)面血管形成的改善作用。

2016-08-31)

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 03. 001

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81372059，81571912）；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目(2012CB518105)；重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃院士專項(xiàng)項(xiàng)目（cstc2014jcyjys10002）

徐祥，教授（E-mail:xiangxu@ymail.com）；劉曉萍，教授（E-mail:xplyu2008@126.com）