喀拉昆侖南部熊彩崗日地區(qū)冰川細(xì)菌多樣性研究

張淑紅， 包格日樂(lè)， 李治國(guó)， 陳紅歌

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2. 商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 商丘 476000； 3. 商丘師范學(xué)院環(huán)境與規(guī)劃學(xué)院，河南 商丘 476000)

喀拉昆侖南部熊彩崗日地區(qū)冰川細(xì)菌多樣性研究

張淑紅1, 2， 包格日樂(lè)1， 李治國(guó)3， 陳紅歌1

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2. 商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 商丘 476000； 3. 商丘師范學(xué)院環(huán)境與規(guī)劃學(xué)院，河南 商丘 476000)

通過(guò)純培養(yǎng)和高通量測(cè)序，對(duì)喀拉昆侖南部熊彩崗日地區(qū)冰川雪樣和水樣細(xì)菌多樣性進(jìn)行了研究。純培養(yǎng)結(jié)果表明，冰川細(xì)菌由Bacteroidetes、Actinobacteria、Deinococcus-Thermus、Proteobacteria4個(gè)門(mén)組成,屬水平由Pseudomonas、Janthinobacterium、Flavobacterium、Devosia、Duganella、Deinococcus、Cryobacterium、Rugamonas、Arthrobacter、Mycetocola、Massilia、Salinibacterium組成；高通量測(cè)序結(jié)果表明，冰川細(xì)菌主要由Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes3個(gè)門(mén)組成，由Acidovorax、Bacillus、Bacteroides、Brevundimonas、Herbaspirillum、Massilia、Pedobacter、Phenylobacterium、Polaromonas、Pseudorhodobacter、Variovorax等屬組成。2種方法綜合起來(lái)更能全面地分析細(xì)菌群落信息。雪環(huán)境和水環(huán)境的細(xì)菌多樣性差異不大。細(xì)菌群落組成既有重復(fù)的，也有各自環(huán)境所特有的。同時(shí)也檢測(cè)到了熊彩崗日地區(qū)冰川所特有的細(xì)菌類(lèi)群。

細(xì)菌；多樣性；冰川；熊彩崗日地區(qū)

冰川,由于其獨(dú)特的地理環(huán)境特征，蘊(yùn)藏著大量具有獨(dú)特遺傳學(xué)和適應(yīng)環(huán)境變化機(jī)制的微生物，是一個(gè)天然的微生物“儲(chǔ)存庫(kù)”，記錄著不同時(shí)期大氣環(huán)流向冰川輸送的微生物菌群數(shù)量和結(jié)構(gòu)等信息，是包含生物進(jìn)化以及地球上生物生存環(huán)境變化信息的優(yōu)良介質(zhì)[1]。以冰芯和雪樣中微生物為研究對(duì)象的工作諸多，而且，隨著近年來(lái)冰川退縮的不斷加劇，關(guān)于冰川退縮前沿裸露地微生物群落演替特點(diǎn)受到了諸多關(guān)注。而對(duì)于退縮過(guò)程中形成的不同生境之間微生物群落差異的研究較少，僅見(jiàn)到了老虎溝12號(hào)冰川的報(bào)道[2,3]，而且運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)研究冰川微生物的工作才剛剛開(kāi)始。本研究通過(guò)對(duì)尚未開(kāi)展過(guò)冰川微生物研究工作的熊彩崗日地區(qū)的細(xì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)及高通量測(cè)序分析，采集了不同海拔處的高位點(diǎn)雪、消融區(qū)雪、冰川融水及冰川末端河水樣品。一方面分析不同冰川環(huán)境細(xì)菌群落的差異，另一方面將熊彩崗日地區(qū)冰川的菌群結(jié)構(gòu)與其它冰川位點(diǎn)進(jìn)行比較，分析熊彩崗日地區(qū)冰川細(xì)菌群落所獨(dú)有的特征。

1 材料與方法

1.1樣品的采集

喀拉昆侖山位于青藏高原西北側(cè)，其主體部分在新疆維吾爾自治區(qū)與克什米爾的交界線上。獅泉河氣象站(32°30′N(xiāo)，80°08′E，2 924 m)在1961—2013年的觀測(cè)結(jié)果是，年均溫度為0.71 ℃，年均沉積物厚度為70.60 mm。本試驗(yàn)采樣地點(diǎn)為喀喇昆侖南部的熊彩崗日地區(qū)，1968—2013年該地區(qū)冰川總面積減少了2.63 km2，退縮面積占1968年此地區(qū)冰川總面積的1.45%[4]。

2013年7月，在喀拉昆侖南部熊彩崗日地區(qū)共采集4個(gè)樣品：高位點(diǎn)雪樣(34°15′11.70″N，80°17′19.40″E，5 881 m)、消融區(qū)雪(34°15′11.36″N，80°17′32.89″E，5 731.21 m)、冰川融水(34°15′11.28″N，80°17′32.89″E，5 730.45 m)、河水(34°15′14.10″N，80°17′33.60″E，5 704.79 m)。每種樣品3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)樣品低溫轉(zhuǎn)運(yùn)，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2可培養(yǎng)細(xì)菌的純培養(yǎng)

1.2.1 培養(yǎng)基 R2A培養(yǎng)基： 蛋白胨0.5 g·L-1，酵母粉0.5 g·L-1，胰蛋白胨0.5 g·L-1，酸水解酪蛋白0.5 g·L-1，葡萄糖0.5 g·L-1，可溶性淀粉0.5 g·L-1，磷酸氫二鉀0.3 g·L-1，丙酮酸鈉0.3 g·L-1，七水硫酸鎂0.05 g·L-1，瓊脂15 g·L-1，pH值為7.2～7.4。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，瓊脂15 g·L-1，pH值為7.0～7.2。

TSA培養(yǎng)基：胰蛋白胨15 g·L-1，大豆胨5 g·L-1，氯化鈉5 g·L-1，瓊脂15 g·L-1，pH值為7.0～7.4。

1.2.2 分離與純化 用R2A、0.25R2A、0.2LB、0.5TSA 4種培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)。在無(wú)菌條件下，每種樣品分別吸取100 μL，涂布于4種培養(yǎng)基上。每種培養(yǎng)基涂6個(gè)平板，3個(gè)置于4 ℃培養(yǎng)15 d，另外3個(gè)置于15 ℃培養(yǎng)7 d。形成肉眼可見(jiàn)的菌落后，依據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征進(jìn)行分離與純化，統(tǒng)計(jì)同一形態(tài)菌落數(shù)及總菌落數(shù)。純化后的細(xì)菌于4 ℃斜面保存及30%甘油-20 ℃保藏備用。

1.2.3 恢復(fù)培養(yǎng)的菌株DNA提取 參照Z(yǔ)HOU等[5]方法提取細(xì)菌DNA并做了一些改動(dòng)。具體過(guò)程如下：(1)吸取菌液于2 mL離心管中，4 000 r·min-1離心10 min收集菌體。(2)菌體中加入1 mL 磷酸緩沖液PBS(KCl 0.2 g·L-1，KH2PO40.24 g·L-1，NaCl 8 g·L-1，Na2HPO41.44 g·L-1)混勻，12 000 r·min-1離心4 min，此過(guò)程為洗菌。(3)棄上清液，加入650 μL 提取液(100 mmol Tris-Cl，100 mmol Na2-EDTA，100 mmol Na2HPO4，1.5 mmol NaCl，1% CTAB)，10 g·L-1蛋白酶K和10 g·L-1溶菌酶各10 μL，氣浴振蕩器37 ℃振蕩30 min。(4)加入60 μL 20% SDS，65 ℃水浴2 h，水浴過(guò)程中每20 min輕輕上下顛倒幾次。(5)6 000 r·min-1離心10 min，取上清液，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，上下顛倒幾次，8 000 r·min-1離心10 min，取上清液。(6)加入10 g·L-1RNA酶10 μL，37 ℃水浴30 min。(7)再次加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)進(jìn)行抽提，8 000 r·min-1離心10 min。(8)取上清液加入0.6倍體積異丙醇沉淀1 h，離心30 min。(9)棄上清液，加入預(yù)冷的70%乙醇，12 000 r·min-1離心10 min，該步驟重復(fù)1次。(10)室溫下風(fēng)干后，加入約20 μL ddH2O，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 16S rDNA擴(kuò)增 以提取的DNA為模板，使用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1 492R(5’-CGGTTACCTTGTTACGAC TT-3’)擴(kuò)增16S rDNA[6]，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度大約1 500 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(50 μL)：1×PCR緩沖液(Takara)，0.2 mmol dNTP，2.5 mmol MgCl2，正反向引物各0.2 μmol，rTaq DNA聚合酶(Takara)1.25 U，DNA模板1 μL。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 序列提交 將所有序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，注冊(cè)號(hào)為KP114466-KP114524。

1.3高通量測(cè)序分析細(xì)菌遺傳多樣性

1.3.1 樣品總DNA的提取 樣品用0.22 μm孔徑濾膜過(guò)濾，過(guò)濾后把濾膜剪碎，用PBS緩沖液將菌體清洗下來(lái)，DNA提取方法同上述1.2.3。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的基因組DNA。

表1 5’ 端反向引物標(biāo)簽Table 1 5’ tagged PCR reversed primers

PCR反應(yīng)體系為：1×FastPfu Buffer，0.25 mmol dNTP 2 μL，0.1 μmol引物，TransStart FastPfu高保真酶(TransGen AP221-02)2.5 U，DNA 模板10 ng，總體積20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸5 min。保存于10 ℃。PCR儀為ABI GeneAmp?9700型。將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將符合目的片段長(zhǎng)度的平行擴(kuò)增產(chǎn)物合并，使用Tiangen Gel Purification Kit試劑盒進(jìn)行純化回收，利用NanoDrop超微量分光光度計(jì)測(cè)定純化后產(chǎn)物濃度，將所有位點(diǎn)樣品等濃度混合后上機(jī)測(cè)序。

1.3.3數(shù)據(jù)的分析方法

1.3.3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及數(shù)據(jù)優(yōu)化 根據(jù)barcode序列區(qū)分各個(gè)樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)，按照barcode標(biāo)簽完全匹配方式提取有效序列。使用Qiime[7]找出barcode標(biāo)簽序列前引物序列并去掉。再去掉小于200 bp的堿基、模糊堿基及單堿基重復(fù)區(qū)，同時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增中產(chǎn)生的嵌合體序列并去除。

1.3.3.2 OTU聚類(lèi) 使用Uparse[8]方法進(jìn)行OTU聚類(lèi)，OTU中序列相似性設(shè)為97%，得到OTU的代表序列，使用usearch_global方法將優(yōu)化序列map比對(duì)回OTU代表序列，得到各樣品OTU豐度統(tǒng)計(jì)表。

1.3.3.3 分類(lèi)學(xué)分析 采用RDP classifier貝葉斯[9]算法對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，并在各個(gè)水平統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成。使用Silva[10]數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

1.3.3.4 Alpha豐富程度分析方法 采用非參數(shù)法(Nonparametric estimators Good)估算樣品代表群落的蓋度指數(shù)(Community coverage)，利用mothur軟件計(jì)算比較每個(gè)樣品的 Shannon、Simpson、Chao1和ACE多樣性指數(shù)。

1.3.3.5 稀釋性曲線 對(duì)序列采用隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線[11]。利用Mothur[12]做稀疏分析，利用R語(yǔ)言工具制作曲線圖。

1.3.3.6 群落結(jié)構(gòu)組分圖 使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，觀測(cè)樣品在不同分類(lèi)水平上的群落結(jié)構(gòu)。通常使用較直觀的餅圖或柱狀圖等形式呈現(xiàn)[13]?；趖axa_summary文件夾中的數(shù)據(jù)表，利用R語(yǔ)言工具作圖或在Excel中編輯作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌純培養(yǎng)結(jié)果

根據(jù)恢復(fù)出的菌株菌落特征，篩選出58個(gè)菌株，用于16S rDNA基因序列分析。

2.1.1 門(mén)水平的群落構(gòu)成 此冰川細(xì)菌由Actinobacteria、Proteobacteria、Bacteroidetes、Deinococcus-Thermus4個(gè)門(mén)組成，各自在不同樣品中的相對(duì)豐度如表2所示。4個(gè)門(mén)以Proteobacteria所占比例最高，其次為Actinobacteria，Bacteroidetes所占比例次之，Deinococcus-Thermus位居最后。

表2 不同樣品門(mén)水平的細(xì)菌類(lèi)群相對(duì)豐度Table 2 Relative abundance of bacterial community at phylum level in different samples

2.1.2 屬水平的群落構(gòu)成 在屬水平上，此冰川細(xì)菌由Pseudomonas、Janthinobacterium、Flavobacterium、Devosia、Duganella、Deinococcus、Cryobacterium、Rugamonas、Arthrobacter、Mycetocola、Massilia、Salinibacterium組成(表3)。

表3 不同樣品屬水平上主要細(xì)菌類(lèi)群的相對(duì)豐度Table 3 Relative abundance of bacterial community at genus level in different snow and water samples

2.2高通量測(cè)序結(jié)果

2.2.1 有效序列提取 各樣品有效序列和優(yōu)化序

列統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表4。2個(gè)樣品經(jīng)454高通量測(cè)序共得到20 280條有效序列，序列平均長(zhǎng)度為449.4 bp。對(duì)結(jié)果進(jìn)行去雜，共得到11 444條優(yōu)質(zhì)序列，序列平均長(zhǎng)度為402 bp。表4同時(shí)顯示，平均優(yōu)化效率為56.16%。優(yōu)化序列用于樣品間細(xì)菌豐富度和多樣性的評(píng)估。

表4 各樣品序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistics of sample sequence

2.2.2 樣品取樣深度 本研究在0.97的相似度水平上繪制樣品的稀釋曲線，結(jié)果如圖1。當(dāng)序列較少時(shí)，隨著樣本中測(cè)序數(shù)量的增加，OTU數(shù)目劇增．隨著測(cè)序量的不斷增大，OTU數(shù)目增加幅度趨于平緩，說(shuō)明本次試驗(yàn)的測(cè)序量基本能夠反映樣品中細(xì)菌群落的多樣性組成。

圖1 樣品稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction cures of different samples

2.2.3 多樣性指數(shù)分析 消融區(qū)雪和融水樣得到的reads、OTU豐度、ACE、Chao指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、Simpson指數(shù)如表5所示。圖1的稀釋性曲線以及表5的多個(gè)指標(biāo)的結(jié)果都說(shuō)明消融區(qū)雪的細(xì)菌多樣性大于冰川融水的多樣性。

表5 不同樣品物種多樣性和豐富度估計(jì)Table 5 Species diversity and abundance estimation

2.2.4 Venn圖 如圖2所示，消融區(qū)雪所特有的OTU為39，冰川融水所特有的OUT為28。二者共有的OTU為67，占消融區(qū)雪總OTU的62%，冰川融水總OTU的70.5%。共有OTU數(shù)在各自樣品中所占比例較大，說(shuō)明2種樣品組成較相似。

圖2 消融區(qū)雪和冰川融水OTU分布Venn圖Fig.2 Number of unique and shared OTU between snow of ablation zone and glacial meltwater

2.2.5 門(mén)水平的群落構(gòu)成 經(jīng)454高通量測(cè)序分析，2個(gè)樣品共檢測(cè)到細(xì)菌的11個(gè)門(mén)：Acidobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Candidate division TM7、Chloroflexi、Cyanobacteria、Firmicutes、Gemmatimonadetes、Planctomycetes、Proteobacteria、Verrucomicrobia，主要由Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes這3種組成(表6)。其中Proteobacteria為2種樣品的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，在消融區(qū)雪所占比例為88.13%，而在冰川融水中為93.47%。Bacteroidetes在消融區(qū)雪和冰川融水所占比例分別為8.75%和4.87%，F(xiàn)irmicutetes在消融區(qū)雪和冰川融水所占比例分別為1.19%和1.31%，其他類(lèi)群在2個(gè)樣品中所占比例均小于1%。

表6 各樣品在主要門(mén)分類(lèi)水平上的菌群組成及其相對(duì)豐度Table 6 Taxonomy information of dominant bacteria at phylum level and their relative abundance

2.2.6 屬水平的群落構(gòu)成 在屬的分布上(圖3)，2個(gè)樣品中至少1個(gè)樣品所占比例為1%以上的有Acidovorax、Bacillus、Bacteroides、Brevundimonas、Herbaspirillum、Massilia、Pedobacter、Phenylobacterium、Polaromonas、Pseudorhodobacter、Variovorax11個(gè)屬。

圖3 基于高通量測(cè)序的細(xì)菌屬水平的群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacterial community distribution at genus levels based on high-throughput sequencing

3 討論

在本研究中，高通量測(cè)序的結(jié)果是Massilia在雪樣中的比例比在冰川融水中的低，而在老虎溝12號(hào)冰川，通過(guò)培養(yǎng)方法得到的結(jié)果是Massilia在雪樣中的比例比在土樣中的高[2]。存在這種差異的原因,一方面可能是由于研究方法的差異，另一方面也可能是研究位點(diǎn)的差異。如在天山1號(hào)冰川，也用了高通量測(cè)序，但未檢測(cè)到該屬[14]。而在玉珠峰，Shen等不僅檢測(cè)到了該屬，而且還對(duì)該屬進(jìn)行了新種的鑒定[15]。

在門(mén)水平上，純培養(yǎng)和高通量測(cè)序同時(shí)檢測(cè)到了大量的Proteobacteria和Bacteroidetes。但每種方法都檢測(cè)到了另一種方法所未檢測(cè)的細(xì)菌群落。如純培養(yǎng)檢測(cè)到了大量的Deinococcus-Thermus，而高通量測(cè)序則檢測(cè)到了大量的Firmicutes。在屬水平上，除了Massilia、Cryobacterium、Devosia、Flavobacterium、Pseudomonas5種屬被2種方法同時(shí)檢測(cè)到以外，其它的屬僅被1種方法所分析到。HUANG等[16]使用標(biāo)記編碼FLX擴(kuò)增子焦磷酸測(cè)序(Bacterial Tag Encoded FLX Amplicon Pyrosequencing，bTEFAP)、克隆文庫(kù)構(gòu)建、純培養(yǎng)3種方法對(duì)南極Tawani(P)湖的細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明使用多種方法研究比任何一種單一的方法能獲得更全面的細(xì)菌群落信息。這一結(jié)果與本研究的結(jié)果相一致。因此本研究將2種方法所得到的結(jié)果綜合起來(lái)，用于分析熊彩崗日冰川的細(xì)菌群落多樣性。

2種方法獲得的所有屬水平的細(xì)菌與其他多個(gè)位點(diǎn)的冰川進(jìn)行比較，如通過(guò)高通量測(cè)序分析的天山1號(hào)冰川[14]、High Arctic[17]、南極的Tawani湖[16]、老虎溝12號(hào)冰川[3]，通過(guò)純培養(yǎng)以及克隆文庫(kù)構(gòu)建等方法研究的東絨布冰川[18-19]、馬蘭冰川[20-21]、Palong[18]、 Kafni冰川土樣[22]、老虎溝雪坑樣品[23]、GISP 2[24]、南極Terra Nova海灣的水柱[25]、敦德冰芯及慕士塔格冰芯[1]。仍有上述這些研究中尚未見(jiàn)到的細(xì)菌資源，如：高通量測(cè)序檢測(cè)到的Arcobacter、Arcticibacter、Blastocatella、Blautia、Paraprevotella、Phascolarctobacterium、Pseudofulvimonas、Subdoligranulum，培養(yǎng)方法獲得的Mycetocola、Rugamonas。因此，增加研究位點(diǎn)，對(duì)于更好的了解地球上冰川細(xì)菌的多樣性很有必要[17]。

通過(guò)純培養(yǎng)與高通量測(cè)序相結(jié)合的方法，對(duì)熊彩崗日地區(qū)冰川不同海拔形成的雪樣和水樣中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析。純培養(yǎng)結(jié)果表明，Massilia只在雪樣中存在，Salinibacterium只在水樣中存在，其他屬在雪樣和水樣中都存在，說(shuō)明雪樣和水樣組成是比較相似的。圖2中，消融區(qū)雪和冰川融水共有OTU數(shù)占各自樣品的比例較大，Shannon指數(shù)也相近，也說(shuō)明雪樣和水樣的組成是相似的。LAROSE等[26]對(duì)極地雪和融水的細(xì)菌的研究表明，雪和融水中群落組成具有很大差異。劉勇勤等[27]對(duì)Yala冰川雪、冰磧湖、冰川溪流3種生境細(xì)菌多樣性的研究表明，冰川雪和水是高度多樣化的系統(tǒng)。本研究結(jié)果與以上結(jié)果并不一致。上述2種研究使用克隆文庫(kù)的方法，與本研究使用方法不同，同時(shí)研究位點(diǎn)也有差異，這些可能都是與本研究結(jié)果不一致的原因。

4 結(jié)論

本研究利用培養(yǎng)及高通量測(cè)序的方法對(duì)熊彩崗日地區(qū)冰川細(xì)菌多樣性及分布特征進(jìn)行了研究，培養(yǎng)結(jié)果表明，冰川細(xì)菌由Bacteroidetes、Actinobacteria、Deinococcus-Thermus、Proteobacteria 4個(gè)門(mén)組成,屬水平由Pseudomonas、Janthinobacterium、Flavobacterium、Devosia、Duganella、Deinococcus、Cryobacterium、Rugamonas、Arthrobacter、Mycetocola、Massilia、Salinibacterium組成。高通量測(cè)序結(jié)果表明冰川細(xì)菌主要由Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes 3個(gè)門(mén)組成，由Acidovorax、Bacillus、Bacteroides、Brevundimonas、Herbaspirillum、Massilia、Pedobacter、Phenylobacterium、Polaromonas、Pseudorhodobacter、Variovorax等屬組成。雪樣和水樣組成較相似。2種方法均檢測(cè)到了熊彩崗日地區(qū)冰川所特有的細(xì)菌類(lèi)群。

[1] 陳勇. 青藏高原冰雪微生物多樣性及其與氣候環(huán)境關(guān)系的研究[D]. 蘭州: 蘭州大學(xué), 2009.

[2] 張淑紅, 侯書(shū)貴, 秦翔, 等. 祁連山老虎溝12號(hào)冰川退縮對(duì)細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群影響的初步研究[J]. 冰川凍土, 2013, 35(3): 751-760.

[3] ZHANG S, HOU S, QIN X, et al. Preliminary study on effects of glacial retreat on the dominant glacial snow bacteria in Laohugou Glacier No. 12[J]. Geomicrobiology Journal, 2015, 32(2): 113-118.

[4] LI Z, FANG H, TIAN L, et al. Changes in the glacier extent and surface elevation in Xiongcaigangri region, Southern Karakoram Mountains, China[J]. Quaternary International, 2015, 371(12): 67-75.

[5] ZHOU J, BRUNS M A, TIEDJE J M. DNA recovery from soils of diverse composition [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(2): 461-468.

[6] CHAKRAVORTY S, HELB D, BURDAY M, et al. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria[J]. Journal of Microbiological Methods, 2007, 69(2): 330-339.

[7] CAPORASO J G, KUCZYNSKI J, STOMBAUGH J, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nature Methods, 2010, 7(5): 335-336.

[8] EDGAR R C, HASS B J, CLEMENTE J C, et al. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection[J]. Bioinformatics, 2011, 27(16): 2194-2200.

[9] WANG Q, GARRITY G M, TIEDJEi J M, et al. Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(16): 5261-5267.

[10] QUAST C, PRUESSE E, YILMAZ P, et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools[J]. Nucleic Acids Research, 2013, 41 (D1): D590-D596.

[11] AMATO K R, YEOMAN C J, KENT A, et al. Habitat degradation impacts black howler monkey (Alouattapigra) gastrointestinal microbiomes[J]. The ISME Journal, 2013, 7(7): 1344-1353.

[12] SCHLOSS P D, GEVERS D, WEATCOTT S L. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies[J]. PLoS One, 2011, 6(12): e27310.

[13] OBERAUNER L, ZACHOW C, LACKNER S, et al. The ignored diversity: complex bacterial communities in intensive care units revealed by 16S pyrosequencing[J]. Scientific Reports, 2013, 3(5-6): 413-1424.

[14] WU X, ZHANG W, LIU G, et al. Bacterial diversity in the foreland of the Tianshan Glacier No. 1, China[J]. Environmental Research Letters, 2012, 7(1): 1-9.

[15] SHEN L, LIU Y, WANG N, et al.Massiliayuzhufengensis, isolated from an ice core[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2012, 64(4): 1285-1290.

[16] HUANG J P, SWAIN A K, THACKER R W, et al. Bacterial diversity of the rock-water interface in an East Antarctic freshwater ecosystem, Lake Tawani(P)+[J]. Aquatic Biosystems, 2013, 9: 4. doi:10.1186/2046-9063-9-4.

[17] SCHüTTE U M, ABDO Z, FOSTER J, et al. Bacterial diversity in a glacier foreland of the high Arctic[J]. Molecular Ecology, 2010, 19 (Suppl. 1): 54-66.

[18] LIU Y, YAO T, JIAO N, et al. Bacterial diversity in the snow over Tibetan Plateau Glaciers[J]. Extremophiles, 2009, 13(3): 411-423.

[19] ZHANG S, HOU S, MA X, et al. Culturable bacteria in Himalayan glacial ice in response to atmospheric circulation[J]. Biogeosciences, 2007, 4: 1-9.

[20] XIANG S, YAO T, AN L, et al. Change of bacterial community in the Malan ice core and its relation to climate and environment[J]. Chinese Science Bulletin, 2004, 49(17): 1869-1875.

[21] XIANG S, YAO T, AN L, et al. Bacterial diversity in Malan ice core from the Tibetan Plateau[J]. Folia Microbiologica, 2004, 49(3): 269-275.

[22] SRINIVAS T N, SINGH S M, PRADHAN S, et al. Comparison of bacterial diversity in proglacial soil from Kafni Glacier, Himalayan Mountain ranges, India, with the bacterial diversity of other glaciers in the world[J]. Extremophiles, 2011, 15(6): 673-690.

[23] ZHANG S, YANG G, WANG Y, et al. Abundance and community of snow bacteria from three glaciers in the Tibetan Plateau[J]. Journal of Environmental Sciences, 2010, 22(9): 1418-1424.

[24] MITEVA V I, SHERIDAN P P, BRENCHLEY J E. Phylogenetic and physiological diversity of microorganisms isolated from a deep Greenland glacier ice core[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(1): 202-213.

[25] GIUDICE A L, CARUSO C, MANGANO S, et al. Marine bacterioplankton diversity and community composition in an Antarctic coastal environment[J]. Microbial Ecology, 2012, 63(1): 210-223.

[26] LAROSE C, BERGER S, FERRARI C, et al. Microbial sequences retrieved from environmental samples from seasonal Arctic snow and meltwater from Svalbard, Norway[J]. Extremophiles, 2010, 14(2): 205-212.

[27] LIU Y, YAO T, JIAO N, et al. Microbial diversity in the snow, a moraine lake and a stream in Himalayan glacier[J]. Extremophiles, 2011, 15(3): 411-421.

(責(zé)任編輯：朱秀英)

StudyofbacterialdiversityinglaciersofXiongcaigangriregionofsouthKarakoram

ZHANG Shuhong1, 2, BAOGE Rile1, LI Zhiguo3, CHEN Hongge1

(1. College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2. College of Life Sciences, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China； 3. College of Environment and Planning, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China)

Using the methods of pure culture and high-throughput sequencing, bacteria diversity was investigated in glacial snow and glacial water from Xiongcaigangri region of south Karakoram. Pure culture results showed that glacial bacteria were composed of Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Deinococcus-Thermus at phylum level. They were composed ofPseudomonas,Janthinobacterium,Flavobacterium,Devosia,Duganella,Deinococcus,Cryobacterium,Rugamonas,Arthrobacter,Mycetocola,Massilia,Salinibacteriumat genus level. High-throughput sequencing results showed that glacial bacteria were mainly composed of Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes at phylum level. They were mainly composed ofAcidovorax,Bacillus,Bacteroides,Brevundimonas,Herbaspirillum,Massilia,Pedobacter,Phenylobacterium,Polaromonas,Pseudorhodobacter,Variovoraxat genus level. The results showed that the combination of culture-dependent method and high-throughput sequencing could obtain more comprehensive investigation of bacterial community. From the two methods, bacterial diversity was similar between glacial snow and glacial water, while with some unique community. In the meantime, some unique bacteria were detected in glacial environments of Xiongcaigangri region.

bacteria; diversity; glacier; Xiongcaigangri region

Q 938

：A

2015-04-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31100369，41101072，41330526)

張淑紅(1977-)，女，甘肅慶城人，副教授，博士，從事環(huán)境微生物研究。

陳紅歌(1967-)，女，河南許昌人，教授，博士。

1000-2340(2016)02-0275-07