云南4處酸性熱泉中的變形菌門細菌多樣性

宋兆齊，王 莉，劉秀花，梁 峰

(商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南省高校生物質(zhì)降解與氣化工程技術(shù)研究中心，河南 商丘 476000)

云南4處酸性熱泉中的變形菌門細菌多樣性

宋兆齊，王 莉，劉秀花，梁 峰

(商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南省高校生物質(zhì)降解與氣化工程技術(shù)研究中心，河南 商丘 476000)

選擇云南騰沖和龍陵地區(qū)的4處酸性熱泉(pH：2.3～6.0，溫度：47～96 ℃)，通過Barcoded pyrosequencing技術(shù)及統(tǒng)計學(xué)分析，詳細闡述了這些樣點中變形菌門的物種和遺傳多樣性。本研究共獲得了2 489條變形菌門16S rRNA基因序列，可劃分為234個可操作分類單元(OTUs)。分類結(jié)果顯示，熱泉內(nèi)涵蓋了大量已知的目、科和屬。而41%的OTUs可能代表了變形菌門的未知物種。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，樣點中存在著若干全新遺傳類群，這些樣點和美國黃石地區(qū)的熱泉各自呈現(xiàn)不同的變形菌門遺傳多樣性。此外，本次調(diào)查的熱泉彼此間存在著變形菌門群落結(jié)構(gòu)的顯著差異。

變形菌門；多樣性；系統(tǒng)發(fā)育分析；酸性熱泉；云南

變形菌門(Proteobacteria)因其內(nèi)部細菌形態(tài)極為多樣而得名，該門成員均為革蘭氏陰性菌[1]，該門包括了 “Alpha”、“Beta”、“Delta”、“Gamma”、“Epsilon”以及近年剛確立的“Zeta”[2]共6個綱。變形菌門廣泛分布于各種自然或人工環(huán)境下，代表了整個細菌域中最為龐大的一個類群[3]，其物種和遺傳多樣性極為豐富，這決定了該類群涵蓋了極為廣泛的生理代謝類型。比如，該門中既有好氧菌也存在厭氧菌，既有自養(yǎng)型也有異養(yǎng)型，既存在光能型也存在化能型。因此，變形菌門內(nèi)的物種在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥、衛(wèi)生、環(huán)保等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值，廣泛用于氮肥促進利用[4]、植物病蟲害防治[5]、工農(nóng)業(yè)廢水處理[6]、土壤修復(fù)[7]和復(fù)雜污染物降解[8]等。目前有關(guān)變形桿菌門的多樣性的研究，更多是圍繞某一特定的種屬或功能類群展開，或者在描述整個細菌域物種多樣性的同時，提及變形菌門的群落構(gòu)成[9]，而專門針對變形菌門多樣性的研究還很少。陸地?zé)崛谌蚍植紡V泛，多集中于板塊間的碰撞處。這一生態(tài)系統(tǒng)具有迥異于普通環(huán)境的高溫，同時容納了來自地球內(nèi)部大量的無機礦物質(zhì)。不同熱泉間的物化背景存在較大差異，因此熱泉系統(tǒng)蘊含了豐富而獨特的微生物種質(zhì)和遺傳資源。 基于上述情況，本研究通過Barcoded pyrosequencing技術(shù)，選擇國內(nèi)最具代表性的云南地區(qū)溫泉，詳細闡述了4處酸性樣點中變形菌門的物種和遺傳多樣性，期望能為今后這一環(huán)境下微生物資源的開發(fā)和利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1樣品采集

云貴高原處在板塊碰撞處，地?zé)峄顒宇l繁。本研究以云南龍陵和騰沖地區(qū)4處代表性的酸性溫泉為研究對象。溫度和pH 值的測量通過美國哈希公司的pH探頭HachRpH-meter equipped 進行。利用事先滅菌的采樣勺取出熱泉沉積物樣品，立即置于50 mL無菌的離心管中，冰浴黑暗保存，回實驗室后-80 ℃保存。

1.2主要試劑與儀器

便攜式pH計(哈希，美國)；環(huán)境DNA提取試劑盒 (Omega Bio-Tek Inc.,美國)； Taq酶(寶生物，大連)，DNA膠回收試劑盒 (Omega Bio-Tek Inc.,美國); 溫度探頭 (PT-10,SARTORIUS,德國)； PCR儀 (ABI,美國)。

1.3環(huán)境基因組提取

稱取1.0～1.5 g的沉積物樣品，利用環(huán)境DNA提取試劑盒，按說明書進行環(huán)境基因組的提取。為了避免單次操作的誤差，每個樣點重復(fù)提取4次后將提取物混合，供后續(xù)試驗。

1.4細菌16SrRNA基因的Barcodedpyrosequencing

以細菌16S rRNA基因第4可變區(qū)的通用引物Bacteria V4F:AYTGGGYDTAAAGNG 和Bacteria V4R:TACNVGGGTATCTAATCC[10]作為本研究的PCR引物。在正向引物“Bacteria V4F:”一端連接不同的8堿基序列標(biāo)簽即“tag”，每一個標(biāo)簽單一對應(yīng)特定樣點。隨后進行PCR反應(yīng)，具體條件是： 95 ℃ 4 min； 94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10min。反應(yīng)體系為25 μL，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后，送生物公司進行焦磷酸測序。

1.5序列分析

采用特定的python語言腳本，參考文獻[11]的標(biāo)準(zhǔn)，去除不符合要求的低質(zhì)序列。隨后根據(jù)“tag”的序列信息分選出對應(yīng)樣點的序列。利用RDP(ribosomal database project)提供的軟件 RDP-Classifer-2.0分析所得序列的類群歸屬。選出屬于變形菌門的序列，然后對其進行可操作分類單元(OTU)的劃分，并得到每一個OTU在樣點中的豐度。利用BLAST程序，將每條變形菌門序列與NCBI 中GenBank數(shù)據(jù)庫內(nèi)的序列進行相似性比對。采用maximum composite likelihood 模型計算進化距離，通過鄰接法，運用MEGA5.0[12]軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6多樣性分析

基于OTU 的豐度，運用SPADE(species prediction and diversity estimation; A.Chao and T.-J.Shen http:∥chao.stat.nthu.edu.tw)軟件計算各文庫的豐富度(species richness )，覆蓋率(coverage)，香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)，辛普森指數(shù)(Simpson's index )。通過在線的Fast UniFrac[13](http:∥ bmf2． colorado． edu / fastunifrac) 計算樣點間群落結(jié)構(gòu)的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1熱泉環(huán)境參數(shù)

本研究的熱泉為珍珠泉、地?zé)狍w驗區(qū)4號泉、地?zé)狍w驗區(qū)14號泉和上硝1號泉，前3處位于云南騰沖縣熱海國家地質(zhì)公園，后1處位于龍陵縣境內(nèi)。兩地直線距離小于200 km。所有的4處熱泉均為酸性，其中熱海的3處pH值在3.2～4.5，屬于中度酸性熱泉；龍陵的上硝1號泉pH值為6.0，酸性較弱。4處熱泉的溫度差異明顯(47～96 ℃)，且存在規(guī)律性梯度變化。樣點的表觀特征主要為泥質(zhì)或砂質(zhì)沉積物，顏色為棕色和黑色，見表1。

表1 樣點特征Table 1 Samples investigated in this study

2.2變形菌門物種多樣性

運用RDP-Classifer-2.0軟件并結(jié)合自編的pythony語言腳本，對測得的序列進行歸類。4處樣點共得到2 489條變形菌門的16S rRNA 基因序列，可劃分為234個OTUs，其中，溫度最高的珍珠泉的數(shù)量最多，達到了112個；數(shù)量最少的是酸性最弱的上硝1號泉(表2)。生物統(tǒng)計學(xué)分析的結(jié)果顯示，樣點覆蓋率在0.91～0.96，這說明每個熱泉的序列已基本涵蓋了整個變形菌門的群落。各樣點的豐富度在95～194，香農(nóng)指數(shù)以及辛普森指數(shù)倒數(shù)的范圍分別在3.01～3.88和12.00～19.73。這些數(shù)據(jù)表明，本次研究的4處酸性樣點的變形菌門物種都較為豐富，其中珍珠泉的多樣性最高。

表2 各樣點變形菌門的物種多樣性Table 2 Ecological estimates of sequence diversity for Proteobacteia communities in investigated samples

2.3熱泉的群落結(jié)構(gòu)

為了獲得各熱泉詳細的變形菌門群落組成，通過RDP-Classifer-2.0軟件進一步對這2 489條16S rRNA 基因序列進行了綱、目、科、屬的劃分，見表3(群落比例大于1%的目、科、屬)。

“Alpha”變形菌綱存于全部樣點中，并且在珍珠泉、地?zé)狍w驗區(qū)4號和14號泉內(nèi)為變形菌門優(yōu)勢類群，其中在體驗區(qū)4號泉中的群落比例最高，達到了75%。該綱在弱酸性的上硝1號泉的比例僅為1%。紅螺菌目(Rhodospirillales)下的醋桿菌科(Acetobacteraceae)內(nèi)的Acidicaldu屬則為“Alpha”變形菌綱的優(yōu)勢類群，甚至在地?zé)狍w驗區(qū)4號和14號泉以及上硝1號泉中為該綱的唯一類群。Acidicaldu屬的菌株為中度嗜酸菌，不僅在鐵、硫元素的地球化學(xué)循環(huán)過程中發(fā)揮作用[14]，而且可作為新型的高溫脂肪酶的重要來源[15]。

“Beta”變形菌綱在上硝1號泉的豐度最高，達到了19%，但在其他熱泉中并非最主要的類群，尤其在熱海體驗區(qū)4號泉中，群落比例小于1%。所有樣點的“Beta”變形菌均由伯克氏菌目(Burkholderiales)構(gòu)成，其下主要包括了Massilia，納西桿菌屬(Naxibacter)，硫單胞菌屬(Thiomonas)和Thiobacter等屬。不同熱泉包含的屬，也不盡相同。Thiomonas和Thiobacter的物種具有氧化砷和硫的功能[16- 17]；Massilia屬具有反硝化作用[18]，又可作為聚羥基脂肪酸(PHA)的生產(chǎn)菌株，在污水處理及其資源化利用方面有重要價值[19]。

“Delta”變形菌綱為上硝1號泉的絕對優(yōu)勢類群(群落比例為73%)，為地?zé)狍w驗區(qū)14號和4號泉的主要類群(群落比例分別為39%和19%)。上硝1號泉中的“Delta”變形菌種類豐富，包含了互營桿菌目(Syntrophobacterales)，硫還原菌目(Desulfurellales)等5個目，其中Syntrophobacterales 占到了該樣點群落結(jié)構(gòu)的61%，主要的屬為Desulfomonile和Desulfobacca。對于其他3處熱泉而言，構(gòu)成“Delta”綱的唯一類群均為Desulfurellales下的硫還原菌屬(Desulfurella)。上述這些屬的菌株往往具有較強的還原硫酸鹽的功能[20]。

表3 研究樣點的變形菌門群落組成Table 3 Community composition of Proteobacteria in investigated samples

注:括號內(nèi)的數(shù)字代表了該分類單元在樣點中的豐度
Note:The percentages in the parentheses indicates the abundances of taxa in the investigated hot spring

“Gamma”變形菌綱在珍珠泉和熱海體驗區(qū)14號泉的豐度最高，占各自樣點群落結(jié)構(gòu)的50%和41%，在上硝1號泉的比例小于1%。該綱在各樣點中涵蓋的類群種類比較豐富，且熱泉間的優(yōu)勢類群存在差異。珍珠泉的優(yōu)勢類群為假單胞菌目(Pseudomonadale)下的纖維弧菌屬(Cellvibrio)和假單胞菌屬(Pseudomonas)；熱海體驗區(qū)4號泉為腸桿菌目(Enterobacteriales)下的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)以及黃色單胞菌目 (Xanthomonadales)下的Dyella屬；熱海體驗區(qū)14號的類群為酸硫桿狀菌目(Acidithiobacillales)下的酸硫桿狀菌屬(Acidithiobacillus)。這些類群功能廣泛，在生物肥料和秸稈高效降解(纖維弧菌屬)[21-22]、生物電池和芳香化合物降解(Dyella屬)[23-24]、生物浸礦(酸硫桿狀菌屬)[25]以及環(huán)境保護(假單胞菌屬)[26]等方面有很大的開發(fā)潛力。

此外，變形菌門的各綱、目、科中還存在大量不確定的類群(Unidentified)，這些類群可能由一些還未被發(fā)現(xiàn)的變形菌門物種組成。另外，本研究并未探測到“Epsilon”和 “Zeta”2個綱的物種。

2.4變形菌門遺傳多樣性

從各OTUs中選出1條代表序列，通過BLAST程序在GenBanks數(shù)據(jù)庫中與已知序列進行相似性比對。結(jié)果顯示，96個OTUs(代表了所有OTUs的41%)與目前已知的變形菌門序列相似性在97%以下，這些OTUs在上硝1號泉的豐度最高，為71%，在熱海體驗區(qū)4和14號泉的豐度分別為24%和27%，在珍珠泉的豐度最低，為7%。這些數(shù)據(jù)說明，本研究中的熱泉中存在大量較新穎的變形菌門物種。這也解釋了為何變形菌門的各綱、目、科中還存在大量不確定的類群。

圖1 形菌門16S rRNA基因片段的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic relationships of Proteobacteria 16S rRNA gene sequences

為了確定這些類群的具體進化地位，同時與著名的地?zé)峄顒訁^(qū)——美國黃石地質(zhì)公園的熱泉群進行比較，將本研究的部分代表序列與黃石熱泉的代表性變形菌門序列聯(lián)合進行了系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果如圖1所示。圖1中大部分的云南序列和黃石序列各自單獨聚集，同一分支上很少存在交錯分布的情況，這說明了云南和黃石的熱泉中的變形菌門存在明顯的遺傳學(xué)差異，即存在著各自獨立進化的變形菌遺傳類群。此外，部分云南序列在系統(tǒng)發(fā)育樹上形成了一些較大的獨立分支(Cluster I - V)(圖1)，這些分支和已知的變形菌門菌株存在較大的遺傳距離，有可能代表了一些還未被發(fā)現(xiàn)的科，甚至目一級的新分類單元。

2.5不同熱泉的群落差異

本研究所得的234個OTUs中，僅有55個(代表了所有OTUs的24%和所有序列的63%)存在于2個以上的熱泉中，其余的均只存在于單一熱泉內(nèi)。Fast UniFrac的在線分析結(jié)果表明，4處熱泉的群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異(P<0.05)，差異程度在80%以上。Jackknife 聚類樹顯示，中度酸性的珍珠泉、地?zé)狍w驗區(qū)4號和14號3處熱泉聚在一起，弱酸性的上硝1號泉處在最外圍(圖2)。表明本次研究樣點的pH值差異越大，其變形菌門的差異越顯著。

圖2 Jackknife 的聚類分析Fig 2 Jackknife Sample Clusters

3 結(jié)論與討論

(1)4處酸性熱泉內(nèi)涵蓋了大量已知的目、科和屬，這些類群具有多樣且重要的功能。熱泉環(huán)境又會給這些功能賦予某些特性，比如嗜高溫、耐強酸和高離子濃度等，這可大大提高這些類群的應(yīng)用價值。(2) BLAST分析結(jié)果表明了樣點中可能蘊含有許多變形菌門的新物種，后續(xù)的系統(tǒng)發(fā)育分析進一步顯示，樣點中存在著若干全新遺傳類群。這些類群的功能目前還不得而知。(3)Fast UniFrac分析表明，本次調(diào)查的熱泉彼此間存在著群落結(jié)構(gòu)的顯著差異，而且這些樣點和黃石公園的熱泉各自呈現(xiàn)不同的遺傳多樣性。這表明不同環(huán)境特征，不同地理分布的熱泉，其變形菌門多樣性也存在明顯不同。

綜上所述，本次調(diào)查的溫泉中蘊含了豐富和獨特的變形菌門類群，存在一定的開發(fā)潛力。那么，如何通過菌株純培養(yǎng)或是宏基因組技術(shù)獲取這些物種和遺傳資源，以及對這些資源如何開發(fā)利用，還有待進一步的探索。

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(責(zé)任編輯：朱秀英)

ThediversitiesofProteobacteriainfouracidichotspringsinYunnan

SONG Zhaoqi,WANG Li,LIU Xiuhua,LIANG Feng

(College of Life Science,Shangqiu Normal University,Engineering Technology Research Center of Biomass Degradation and Gasification,Higher Institutions of Henan Province,Shangqiu 476000,China)

The phylumProteobacteriawere very valuable bioresources.However,little was konwn about the diversity ofProteobacteriain hot springs.In this study,the species and genetic diversities ofProteobacteiawere investigated in four acidic hot springs (pH value：2.3～6.0; temperature：47～96℃) in Yunnan province by using a barcoded 16S rRNA gene-pyrosequencing approach.A total of 2 489 16S rRNA gene sequences were divided into 234 operation taxonomic units (OTUs).Classified analysis showed the investigated hot springs harbored much of known orders,families and genus.41% of OTUs represented some candidate new species.The phylogenetic analysis showed some new big clusters existed in the investigated samples.Yunnan and Yellowstone hot springs had different genetic diversities ofProteobacteria.Community structures of the investigated hot springs were significantly different.

Proteobacteria; diversity; phylogenetic analysis; Yunnan

S 435.72

：A

2015-08-14

國家自然科學(xué)基金項目(31300430)

宋兆齊(1979-)，男，河南新鄉(xiāng)人，副教授，博士，從事微生物資源與生態(tài)的研究工作。

梁 峰(1965-)，男，河南永城人，教授，碩士生導(dǎo)師.

1000-2340(2016)03-0376-07