紅鰭東方鲀抗苗勒氏管激素 （AMH）基因在不同發(fā)育時(shí)期的組織表達(dá)

紅鰭東方鲀抗苗勒氏管激素 （AMH）基因在不同發(fā)育時(shí)期的組織表達(dá)

為研究抗苗勒氏管激素 （AMH）基因在紅鰭東方鲀Takifugu rubripes各組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況以及在性別分化和性腺發(fā)育等過(guò)程中的作用，利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)紅鰭東方鲀成魚(yú)的腎臟、腦、心臟、脾臟、肝臟、精巢和卵巢等組織進(jìn)行了amh基因的表達(dá)分析以及不同發(fā)育時(shí)期（23、30、40、60、80日齡及2齡和3齡魚(yú)）紅鰭東方鲀個(gè)體水平上amh基因的表達(dá)分析。結(jié)果表明：紅鰭東方鲀3齡成魚(yú)脾臟、腎臟和肝臟中的amh基因表達(dá)量極顯著高于其他組織 （P＜0.01），在精巢和心臟中的表達(dá)量極顯著高于卵巢和腦 （P＜0.01），其中脾臟中表達(dá)量最高，腦中表達(dá)量最低；紅鰭東方鲀23日齡、30日齡、2齡和3齡魚(yú)中，雄魚(yú)amh基因的表達(dá)量極顯著高于同期雌魚(yú) （P＜0.01），而60日齡和80日齡時(shí)雌魚(yú)表達(dá)量顯著高于雄魚(yú) （P＜0.05），40日齡時(shí)雌、雄魚(yú)的表達(dá)量無(wú)顯著性差異 （P＞0.05），3齡時(shí)雌、雄個(gè)體性腺中amh基因的表達(dá)量均顯著高于2齡魚(yú) （P＜0.05）；雄性幼魚(yú)amh基因的表達(dá)量從23～30日齡呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，且在30日齡時(shí)達(dá)到最高，隨后逐漸降低，而雌魚(yú)整體amh基因的表達(dá)量也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，80日齡時(shí)雌魚(yú)amh基因表達(dá)量最高。研究表明，amh基因在紅鰭東方鲀的性腺發(fā)育和性別分化過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用。

紅鰭東方鲀；實(shí)時(shí)定量PCR；抗苗勒氏管激素；基因表達(dá)

紅鰭東方鲀Takifugu rubripes隸屬于鲀形目Tetraodontiformers、鲀科 Tetraodontidae、東方鲀屬Takifugu，俗稱(chēng)河豚、臘頭等，是具有海江洄游習(xí)性的近海底層魚(yú)類(lèi)，素有 “魚(yú)類(lèi)之王”的美譽(yù)。野生型紅鰭東方鲀精巢無(wú)毒，而且口感嫩滑，深受美食家的青睞，但是其內(nèi)臟、血液和卵巢中含有一種神經(jīng)毒素——河鲀毒素，誤食容易引起中毒，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡，因此，雄性紅鰭東方鲀具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和食用安全性。隨著對(duì)紅鰭東方鲀研究的不斷深入，2002年，研究人員首次成功完成了紅鰭東方鲀基因組的測(cè)序工作［1］。與人類(lèi)的基因組相比，紅鰭東方鲀?nèi)鄙僭S多非必需重復(fù)序列，但大體上含有相同數(shù)目的遺傳基因，而且一些位于基因編碼區(qū)重要的調(diào)控區(qū)以及內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)高度保守［2］，這為深入研究紅鰭東方鲀相關(guān)基因的功能特性提供了可靠的數(shù)據(jù)參考。

抗苗勒氏管激素 （Anti-Müllerian hormone，AMH），又名苗勒氏管抑制物質(zhì) （Müllerian inhibiting substance，MIS），是一種屬于β-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）超家族［3］的糖蛋白激素，具有調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞發(fā)育及分化的作用。AMH的羧基端與TGF-β超家族成員有著高度的同源性，此家族的大多數(shù)成員要求在其羧基端第110個(gè)氨基酸的位點(diǎn)由蛋白酶水解切割后釋放出具有活性的C端片段，從而被激活。在哺乳動(dòng)物雄性個(gè)體胚胎時(shí)期，睪丸能夠產(chǎn)生AMH誘導(dǎo)苗勒氏管退化，同時(shí)睪丸也分泌睪酮，誘導(dǎo)中腎管 （Wolffian ducts）的分化，發(fā)育成為附睪、射精管、前列腺等雄性生殖器官。在雌性胚胎，因?yàn)椴划a(chǎn)生這兩種激素，所以苗勒氏管繼續(xù)分化成為雌性生殖器官，如輸卵管、子宮、上陰道等，這種作用在高等脊椎動(dòng)物體內(nèi)是高度保守的［4］。哺乳動(dòng)物體內(nèi)，雄性個(gè)體中amh基因始終保持高表達(dá)，直到青春期生殖細(xì)胞減數(shù)分裂開(kāi)始時(shí)表達(dá)量降低；在雌性個(gè)體中，amh基因在新生兒個(gè)體的顆粒細(xì)胞中首次表達(dá)［5］。對(duì)于鳥(niǎo)類(lèi)而言，amh基因在兩性胚胎性腺中均有表達(dá)，只是通常在雄性胚胎中的表達(dá)量高；類(lèi)似于哺乳動(dòng)物，雄性鳥(niǎo)類(lèi)的AMH能引起一對(duì)苗勒管的退化；在雌性鳥(niǎo)類(lèi)中，只有左側(cè)的苗勒管成熟，而右側(cè)苗勒管會(huì)像雄性個(gè)體中的一樣發(fā)生退化，這與雌性雞胚胎性腺中amh基因表達(dá)形式相同［6］。兩棲類(lèi)和魚(yú)類(lèi)的amh基因擁有一個(gè)相同的表達(dá)模式：在性腺分化過(guò)程中，amh基因在精巢中的表達(dá)量高于卵巢，如美洲短吻鱷［7］、海龜［8］和魚(yú)（比目魚(yú)［9］、虹鱒［10］、斑馬魚(yú)［11］和羅非魚(yú)［12］）；但青鳉性腺分化過(guò)程中amh基因并沒(méi)有表現(xiàn)出二態(tài)型表達(dá)，只是在成年個(gè)體精巢中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于卵巢［13］。硬骨魚(yú)中除鱘魚(yú)外，盡管沒(méi)有苗勒氏管，但是性腺的體細(xì)胞仍然表達(dá)amh基因，這說(shuō)明amh基因可能與硬骨魚(yú)的性別分化和性腺發(fā)育過(guò)程相關(guān)。

實(shí)時(shí)定量 PCR（Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）是檢測(cè)基因表達(dá)最有效的方法之一，尤其是對(duì)于表達(dá)量較低的基因［14］。qRT-PCR可直接通過(guò)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增中的熒光信號(hào)變化獲得定量結(jié)果，精確性高，在此過(guò)程中，定量和擴(kuò)增同步進(jìn)行［15］。本研究中，通過(guò)qRT-PCR對(duì)紅鰭東方鲀3齡成魚(yú)不同組織以及不同發(fā)育時(shí)期（23、30、40、60、80日齡、2齡、3齡）紅鰭東方鲀個(gè)體進(jìn)行了amh基因表達(dá)分析，以期為進(jìn)一步研究紅鰭東方鲀amh基因的功能提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用2齡和3齡健康紅鰭東方鲀?nèi)∽源筮B富谷水產(chǎn)有限公司，雌、雄各3尾魚(yú)，分別取其腎臟、腦、心臟、脾臟、肝臟、精巢和卵巢組織，保存于RNAlater試劑中，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

試驗(yàn)用健康紅鰭東方鲀幼魚(yú)取自大連富谷水產(chǎn)有限公司，分別于23、30、40、60、80日齡時(shí)采集同一批卵孵化的幼魚(yú)個(gè)體各20尾，保存于RNA-later試劑中，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成 在NCBI上下載紅鰭東方鲀amh mRNA序列，以其為模板，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡkit（Tli RNaseH Plus）引物設(shè)計(jì)原則，用Primer Premier 5軟件［16］設(shè)計(jì)amh基因的qRT-PCR引物。將設(shè)計(jì)好的引物利用NCBI上的Primer-BLAST，在Takifugu rubripes的基因組和轉(zhuǎn)錄組下進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，amh基因引物的特異性好［17］。內(nèi)參基因選用紅鰭東方鲀?chǔ)?actin基因的引物［18］。引物序列由寶生物工程 （大連）有限公司合成，引物信息見(jiàn)表1。

表1　試驗(yàn)所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.2.2總RNA的提取 用Trizol（寶生物工程大連有限公司）法提取2齡和3齡紅鰭東方鲀腎臟、腦、心臟、脾臟、肝臟、精巢、卵巢和各發(fā)育時(shí)期幼魚(yú)的總RNA，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確定總RNA的完整性。

1.2.3cDNA第一鏈的合成和目的基因的測(cè)序鑒定 利用 OD260 nm/OD280 nm值為1.8～2.0的 RNA，按照PrimeScriptRTreagent Kit（寶生物工程大連有限公司）說(shuō)明書(shū)的要求，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA第一鏈。以合成的cDNA第一鏈為模板，利用合成的amh基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得amh基因片段。將PCR產(chǎn)物做切膠回收處理后得到的目的基因純化產(chǎn)物與pUCm-T vector19載體 （生工生物工程上海股份有限公司）連接，導(dǎo)入到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，于37℃下過(guò)夜培養(yǎng)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白斑，擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后的完整質(zhì)粒送寶生物工程大連有限公司進(jìn)行測(cè)序，以此來(lái)鑒定所用引物的可用性。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制定 目的基因和內(nèi)參基因分別設(shè)置5組標(biāo)準(zhǔn)品，并以水為模板作為陰性對(duì)照，每組設(shè)置3個(gè)平行。β-actin的模板是將上述cDNA原液按照100、101、102、103、104倍進(jìn)行稀釋。amh基因的模板是將上述cDNA原液按照50、51、52、53、54倍進(jìn)行稀釋。實(shí)時(shí)定量設(shè)備為ABI公司的Stepone plus熒光定量PCR儀，使用TransStart Top Green Qpcr SuperMix試劑盒 （北京全式金生物技術(shù)有限公司）。反應(yīng)體系 （共20 μL）：2×Trans-Start?Top Green qPCR SuperMix 10 μL，Passive Ref-erence DyeⅠ（50×）0.4 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA模板1.0 μL，DEPC水8.2 μL。采用三步法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃下預(yù)變性30 s；95℃下變性5 s，61℃下退火15 s，72℃下延伸10 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.2.5相對(duì)表達(dá)熒光定量PCR β-actin和amh兩個(gè)基因分別以上述獲得的cDNA為模板，進(jìn)行相對(duì)表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR，3齡魚(yú)腎臟、腦、心臟、脾臟、肝臟、精巢、卵巢組織，2齡魚(yú)以及各發(fā)育時(shí)期幼魚(yú)的基因表達(dá)分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3數(shù)據(jù)處理

對(duì)于Stepone plus熒光定量PCR儀輸出的相對(duì)表達(dá)實(shí)時(shí)定量結(jié)果，以相同模板β-actin的表達(dá)進(jìn)行歸一化處理， 進(jìn)行 2-ΔΔCT數(shù)據(jù)處理［19-20］， 并將amh基因在各個(gè)組織、不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量進(jìn)行比較。利用SPSS 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)單因素方差分析［21］，并通過(guò)Duncan法進(jìn)行組間多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1總RNA提取

利用分光光度計(jì)測(cè)定，可明顯觀測(cè)到28 S、18 S和5 S三條帶總RNA的OD260 nm/OD280 nm值，以此來(lái)確定RNA的濃度及純度，OD值為1.8～2.0的總RNA可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2目的基因序列的測(cè)序鑒定

利用BioEdit軟件在測(cè)序結(jié)果中查找amh基因引物序列所在的位置，各自查找到引物序列后，再用MegAlign軟件將amh基因的測(cè)序結(jié)果分別與其mRNA序列進(jìn)行比對(duì)，序列完全吻合，證明引物可用。

2.3amh和β-actin基因引物特異性的驗(yàn)證

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，amh和β-actin基因的溶解曲線(xiàn)分別在86.2、88.0℃處有單一峰，且無(wú)雜峰，說(shuō)明此次設(shè)計(jì)的amh基因引物特異性良好，符合實(shí)時(shí)定量PCR的要求，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.4amh和β-actin基因引物擴(kuò)增效率的鑒定

用實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其縱坐標(biāo)代表熒光信號(hào)到達(dá)閥值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，橫坐標(biāo)代表模板的相對(duì)濃度 （設(shè)原模板的濃度為1時(shí)，根據(jù)稀釋倍數(shù)，濃度依次遞減）。amh基因和 β-actin基因引物的擴(kuò)增效率分別為93.945%和103.877%，在90% ～105%范圍內(nèi)，線(xiàn)性程度在99%以上，說(shuō)明兩對(duì)引物可以用于2-ΔΔCT相對(duì)定量表達(dá)分析。

2.5紅鰭東方鲀amh基因的組織表達(dá)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中目的基因各個(gè)濃度CT值的大小，選擇cDNA原液作為模板進(jìn)行amh基因相對(duì)表達(dá) （2-ΔΔCT法）實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)。分別提取性腺發(fā)育成熟的紅鰭東方鲀腎臟、腦、心臟、脾臟、肝臟、精巢和卵巢組織的RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，雌、雄魚(yú)各3尾。將模板cDNA與實(shí)時(shí)定量試劑按要求混合后，用ABI公司的Stepone plus實(shí)時(shí)定量?jī)x進(jìn)行PCR反應(yīng)，將獲得的結(jié)果進(jìn)行整理，結(jié)果表明，每個(gè)組織3個(gè)復(fù)孔之間的標(biāo)準(zhǔn)差均小于0.5。紅鰭東方鲀amh基因的組織表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可見(jiàn)：紅鰭東方鲀成魚(yú)脾臟、腎臟和肝臟中的amh基因表達(dá)量較多且極顯著高于其他組織 （P＜0.01）；脾臟和腎臟中的表達(dá)量極顯著高于肝臟 （P＜0.01），脾臟中的表達(dá)量顯著高于腎臟（P＜0.05）；精巢和心臟中的表達(dá)量極顯著高于卵巢和腦 （P＜0.01）；在精巢和心臟，卵巢和腦之間的amh基因表達(dá)量無(wú)顯著性差異 （P＞0.05）；其中amh基因在脾臟中的表達(dá)量最高，在腦中的表達(dá)量最低，精巢中的表達(dá)量大約是卵巢中的2倍。各組織的表達(dá)量依次為脾臟＞腎臟＞肝臟＞精巢＞心臟＞卵巢＞腦。

圖1　紅鰭東方鲀amh基因的表達(dá)譜Fig.1 The amh gene expression profile of redfin puffer Takifugu rubripes

2.6 紅鰭東方鲀amh基因不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

紅鰭東方鲀amh基因不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況如圖2所示。雌性紅鰭東方鲀amh基因在各個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況為：80日齡和30日齡幼魚(yú)amh基因的表達(dá)量最多，與其他時(shí)期相比存在顯著性差異 （P＜0.05）；2齡魚(yú)中amh基因的表達(dá)量最低，且顯著低于3齡成魚(yú) （P＜0.05）；80日齡和30日齡幼魚(yú)，40日齡和60日齡幼魚(yú)間的表達(dá)量均無(wú)顯著性差異 （P＞0.05）；在不同發(fā)育時(shí)期中，23～30日齡amh基因的表達(dá)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，40日齡時(shí)表達(dá)量降低，80日齡時(shí)有所升高，2齡時(shí)表達(dá)量最低，3齡時(shí)又有所升高。

圖2　紅鰭東方鲀amh基因在發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)Fig.2 Ontogeny expression of amh gene in redfin puffer Takifugu rubripes

雄性個(gè)體amh基因在各個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況為：除amh基因在40日齡和3齡時(shí)的表達(dá)量無(wú)顯著性差異 （P＞0.05）外，其他各個(gè)發(fā)育時(shí)期間amh基因的表達(dá)量都存在顯著性差異 （P＜0.05）；30日齡幼魚(yú)的表達(dá)量最高，2齡魚(yú)的表達(dá)量最低，23～30日齡時(shí)amh基因的表達(dá)量升高并達(dá)到最大值，到2齡期間呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)并達(dá)到最低值，3齡時(shí)又有所回升。23日齡、30日齡、2齡和3齡雄魚(yú)amh基因的表達(dá)量極顯著高于同期雌魚(yú) （P＜0.01），而60、80日齡時(shí)，amh基因在雌魚(yú)中的表達(dá)量則極顯著或顯著高于雄魚(yú) （P＜0.01或P＜ 0.05），40日齡時(shí)雌、雄魚(yú)的表達(dá)量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

3　討論

3.1amh基因的組織表達(dá)

自1953年Jost用胚胎學(xué)方法發(fā)現(xiàn)AMH的存在開(kāi)始，人們就一直在探索研究各個(gè)物種中AMH的結(jié)構(gòu)和作用，關(guān)于amh基因的表達(dá)研究也在同步進(jìn)行。Wang等［22］利用RT-PCR技術(shù)在斑馬魚(yú)成魚(yú)的腦、精巢、卵巢、腎臟、肝臟和心臟中，均能檢測(cè)到amh基因的表達(dá)。Halm等［23］用Southern blot對(duì)歐洲鱸魚(yú)幼苗和成體的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在腦、垂體、精巢、卵巢和心臟中amh基因也有表達(dá)。李蒙［24］通過(guò)qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，amh基因在彭澤鯽成魚(yú)的腦、腎臟、肝臟、肌肉、脾臟和卵巢中同樣都有表達(dá)。本試驗(yàn)中，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究了amh基因在紅鰭東方鲀成魚(yú)的腎臟、腦、心臟、脾臟、肝臟、精巢和卵巢等組織中的表達(dá)模式，得到了與上述相類(lèi)似的結(jié)果，即amh基因在不同組織中均有不同程度的表達(dá)。

豆曉飛［25］通過(guò)RT-PCR技術(shù)對(duì)泥鰍和大鱗副泥鰍的心、肝臟、腦、腎臟、精巢和卵巢6個(gè)組織進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：amh基因在兩種泥鰍的各個(gè)組織中均有不同程度的表達(dá)，泥鰍中以卵巢中表達(dá)量最高，腦、心和精巢中也有著較多的表達(dá)，肝、腎中的表達(dá)較弱；而在大鱗副泥鰍各個(gè)組織中，心臟中的表達(dá)量最高，精巢、卵巢和肝臟中表達(dá)較多，腦中的表達(dá)較弱。劉姍姍等［26］研究發(fā)現(xiàn)，amh基因在半滑舌鰨雄魚(yú)和偽雄魚(yú)性腺中的表達(dá)量最高，卵巢、血液、皮膚和腦中次之，而在脾臟、心臟、腎臟、肝臟和垂體中表達(dá)量非常低。唐永凱等［27］研究發(fā)現(xiàn)，amh基因在奧利羅非魚(yú)腦、肝臟、肌肉和心臟中未表達(dá)，只在精巢和卵巢中表達(dá)，并表現(xiàn)出性腺特異性表達(dá)。沈北岸［28］通過(guò)RT-PCR方法研究了amh基因在黃鱔腦、垂體、精巢、卵巢、肌肉、脾臟、心臟、肝臟、脾臟等組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)黃鱔也同樣有性腺特異性表達(dá)，即只在精巢和卵巢中表達(dá)。而本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，amh基因在紅鰭東方鲀脾臟中表達(dá)量最高，腎臟、肝臟、精巢和心臟中表達(dá)量也較多，但是卵巢和腦中表達(dá)量較少。由此可知，amh基因在不同物種中的組織表達(dá)模式存在差異，這可能與amh基因在不同物種中所起的作用不同有關(guān)。

哺乳動(dòng)物雄性個(gè)體胚胎期睪丸產(chǎn)生的AMH能引起苗勒氏管退化，而雌性胚胎因?yàn)椴划a(chǎn)生AMH，苗勒氏管能夠繼續(xù)分化成為雌性生殖器官。對(duì)于硬骨魚(yú) （除鱘魚(yú)外）而言，體內(nèi)雖然沒(méi)有苗勒氏管，但是在性腺和其他組織的體細(xì)胞中仍然能檢測(cè)到amh基因的表達(dá)，這說(shuō)明amh基因可能與硬骨魚(yú)的器官發(fā)育和性別分化等過(guò)程相關(guān)。通過(guò)qRTPCR技術(shù)研究紅鰭東方鲀中amh基因的組織表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)amh基因不存在性腺特異性表達(dá)，而是在各組織中廣泛性表達(dá)，可能參與不同組織的發(fā)育調(diào)控。

3.2amh基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

Rashid等［29］、周賀等［30］、范文濤［31］等利用組織切片技術(shù)對(duì)紅鰭東方鲀幼魚(yú)的性腺觀察發(fā)現(xiàn)：出生后35～40日齡時(shí)雌性幼魚(yú)處于卵巢腔形成階段，該階段是卵巢分化的關(guān)鍵時(shí)期；出生后55～70日齡時(shí)雄性幼魚(yú)處于精巢分化的關(guān)鍵時(shí)期——輸精管原基形成階段。以此為參照，本試驗(yàn)中分別取孵化后23、30、40、60、80日齡的紅鰭東方鲀幼魚(yú)作為研究對(duì)象。Kamiya等［32］研究發(fā)現(xiàn)，紅鰭東方鲀AMHRⅡ激酶結(jié)構(gòu)域中存在一對(duì)錯(cuò)義突變形成的等位基因，雌性個(gè)體中該等位基因是純合子 （C/C），而雄性個(gè)體中的則是雜合子 （C/G）。本試驗(yàn)中，根據(jù)AMHRⅡ這個(gè)特異的多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增片段包含此錯(cuò)義突變位點(diǎn)，將擴(kuò)增得到的基因片段進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)該錯(cuò)義突變位點(diǎn)的多樣性確定各個(gè)幼魚(yú)的遺傳性別。

應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)紅鰭東方鲀幼魚(yú)個(gè)體不同發(fā)育時(shí)期 （23、30、40、60、80日齡、2齡和3齡）amh基因的表達(dá)情況，根據(jù)各時(shí)期雌、雄魚(yú)amh基因的表達(dá)量對(duì)比發(fā)現(xiàn)：雄魚(yú)23日齡、30日齡、2齡和3齡魚(yú)amh基因的表達(dá)量極顯著高于同時(shí)期雌魚(yú)；而在60和80日齡時(shí)雌魚(yú)表達(dá)量卻顯著高于雄魚(yú)；40日齡時(shí)雌、雄魚(yú)的表達(dá)量無(wú)顯著性差異。雄性個(gè)體amh的表達(dá)量從23～30日齡呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，30日齡達(dá)到峰值，隨后表達(dá)量逐漸降低；而雌魚(yú)整體也呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)，80日齡時(shí)雌魚(yú)amh基因表達(dá)量最高。這與劉姍姍等［26］發(fā)現(xiàn)的半滑舌鰨胚胎后不同發(fā)育時(shí)期amh基因的表達(dá)模式相類(lèi)似，由于紅鰭東方鲀和半滑舌鰨的發(fā)育周期不同，造成其最高表達(dá)量的出現(xiàn)時(shí)間也不一致。amh基因在30日齡雄性紅鰭東方鲀幼魚(yú)中表達(dá)量最高，而此時(shí)的雌性個(gè)體中表達(dá)量相對(duì)較低；60日齡時(shí)雌性幼魚(yú)的表達(dá)量極顯著高于雄魚(yú)，這兩個(gè)時(shí)期與Rashid等［29］發(fā)現(xiàn)的紅鰭東方鲀性別分化時(shí)期正好吻合。在紅鰭東方鲀性別分化的關(guān)鍵時(shí)期，amh基因在精巢和卵巢中的表達(dá)量具有顯著性差異，這表明amh基因參與了紅鰭東方鲀的性別分化過(guò)程。

在對(duì)哺乳動(dòng)物的研究中，amh基因缺失的小鼠表現(xiàn)為假兩性癥狀，XY型小鼠擁有正常生殖系統(tǒng)的同時(shí)還擁有子宮和輸卵管；精巢能夠正常發(fā)育且能產(chǎn)生正常精子，但后代卻是不育的，可能是這些雄性個(gè)體發(fā)育過(guò)程中雌性生殖器官對(duì)正常受精過(guò)程產(chǎn)生干擾。因此，amh基因?qū)ΡＷC雄性個(gè)體的可育及雌性個(gè)體正常生殖器官的形成是非常重要的，AMH可以通過(guò)自分泌或旁分泌的方式來(lái)調(diào)節(jié)精巢中生殖細(xì)胞的增殖［33］。另有研究發(fā)現(xiàn)，銀漢魚(yú)Odontesthes hatcheri中一個(gè)位于雄性特有的Y染色體上的復(fù)制體 （amhy）可能是性別決定的關(guān)鍵因素，敲除amhy基因?qū)?huì)造成遺傳性雄性個(gè)體卵巢的發(fā)育［34］。Rodríguez-Marí等［11］利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)斑馬魚(yú)的amh基因研究發(fā)現(xiàn)，在未分化的性腺中就有微弱的表達(dá)了，在性腺已經(jīng)分化的雌、雄幼魚(yú)中其表達(dá)情況不同，顯示出了兩性表達(dá)模式，只在精巢中表達(dá)，可見(jiàn)amh基因參與了斑馬魚(yú)精巢的發(fā)育和生殖細(xì)胞的增殖過(guò)程。趙靜［35］利用RNA反義探針原位雜交技術(shù)，發(fā)現(xiàn)amh基因在黃鱔卵巢濾泡細(xì)胞的顆粒細(xì)胞中和成熟精巢的支持細(xì)胞中表達(dá)，這表明amh基因在黃鱔性腺發(fā)育過(guò)程中起到一定的作用。Miura等［36］和 Yoshinaga等［9］通過(guò)原位雜交技術(shù)分別在日本鰻鱺和日本比目魚(yú)的睪丸支持細(xì)胞中檢測(cè)到amh基因的表達(dá)，但是在卵巢中卻未檢測(cè)到。amh基因通過(guò)在日本鰻鱺未成熟精巢的睪丸支持細(xì)胞中表達(dá)，來(lái)阻止精子發(fā)生的啟動(dòng)。但是，Shiraishi等［37］利用相同的方法研究卻發(fā)現(xiàn)，青鳉amh基因在兩性性腺生殖細(xì)胞周?chē)捏w細(xì)胞中均有表達(dá)，沒(méi)有表現(xiàn)出性別二態(tài)型。通過(guò)使用5-溴-2′-脫氧尿嘧啶標(biāo)簽分析生殖細(xì)胞的增殖情況發(fā)現(xiàn)，在早期性腺分化過(guò)程中，生殖細(xì)胞的增殖需要AMH的參與，AMH功能的缺失能使生殖細(xì)胞的增殖受到抑制［37］。

不同物種amh基因的表達(dá)模式存在很大差別，說(shuō)明amh基因在魚(yú)類(lèi)中的表達(dá)及其功能存在差異性。與青鳉類(lèi)似，紅鰭東方鲀中amh基因在不同發(fā)育時(shí)期并沒(méi)有表現(xiàn)出二態(tài)型表達(dá)，從23～40日齡期間精巢中表達(dá)量高，80日齡時(shí)卵巢中的表達(dá)量高于精巢，成魚(yú)時(shí)精巢中的表達(dá)量再次升高，性腺發(fā)育成熟的雌、雄3齡魚(yú)中amh基因的表達(dá)量均極顯著高于2齡魚(yú)，并且這兩個(gè)時(shí)期雄魚(yú)中amh基因的表達(dá)量均顯著高于雌性。因此，amh基因在紅鰭東方鲀的性腺發(fā)育和生殖細(xì)胞增殖過(guò)程中也可能發(fā)揮著一定的作用。當(dāng)然這只是基于一種推測(cè)，其真正的機(jī)理還有待進(jìn)一步探究，例如可以研究AMH的受體基因 amhrⅡ。Rashid等［29］就發(fā)現(xiàn)，amh基因在青鳉性腺生殖細(xì)胞周?chē)捏w細(xì)胞中表達(dá)后，能通過(guò)amhrⅡ基因間接地刺激生殖細(xì)胞增殖。紅鰭東方鲀中是否也會(huì)存在相似的功能機(jī)理，將在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)一步探究。

4　結(jié)論

本研究中，利用qRT-PCR對(duì)amh基因在紅鰭東方鲀成魚(yú)不同組織中和幼魚(yú)不同發(fā)育階段的表達(dá)進(jìn)行了初步分析，結(jié)果表明：紅鰭東方鲀amh基因在脾臟中的表達(dá)量最高，其次是腎臟、肝臟、精巢和心臟，在卵巢和腦中的表達(dá)量較低，且精巢中的表達(dá)量大約是卵巢的2倍；23日齡、30日齡、2齡和3齡紅鰭東方鲀雄魚(yú)amh基因的表達(dá)量極顯著高于同期雌魚(yú) （P＜0.01），60日齡和80日齡時(shí)雌魚(yú)表達(dá)量則極顯著和顯著高于雄魚(yú) （P＜0.01和P＜0.05），40日齡時(shí)雌、雄魚(yú)的表達(dá)量無(wú)顯著性差異 （P＞0.05）；在雄性紅鰭東方鲀不同發(fā)育時(shí)期中，23～30日齡時(shí)amh基因的表達(dá)量升高并達(dá)到最大值，80日齡～2齡期間呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)并達(dá)到最低值，3齡時(shí)又有所回升；雌魚(yú)整體呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)，80日齡時(shí)雌魚(yú)amh基因表達(dá)量最高。

由此可以推測(cè)，amh基因在紅鰭東方鲀性別分化和性腺發(fā)育以及生殖細(xì)胞的增殖過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用。

［1］ 池田大介，渡步終五.紅鰭東方鲀基因組組成分析［J］.蛋白質(zhì)、核酸及酶，2004，49：2235-2241.

［2］ 周巍，楊煥明，劉國(guó)仰.河豚魚(yú)與人類(lèi)基因組計(jì)劃［J］.遺傳，1997，19（6）：37-40.

［3］ De Santa Barbara P，Bonneand N，Boizet B，et al.Direct interaction of SRY-related protein SOX9 and steroidogenic factor 1 regulates transcription of the human anti-Müllerian hormone gene［J］.Molecular and Cellular Biology，1998，18（11）：6653-6665.

［4］ Guioli S，Sekido R，Lovell-Badge R.The origin of the Müllerian duct in chick and mouse［J］.Dev Biol，2007，302（2）：389-398.

［5］ Hirobe S，He W W，Lee M M，et al.Müllerian inhibiting substance messenger ribonucleic acid expression in granulosa and Sertoli cells coincides with their mitotic activity［J］.Endocrinology，1992，131 （2）：854-862.

［6］ Oreal E，Pieau C，Mattei M G，et al.Early expression of AMH in chicken embryonic gonads precedes testicular SOX9 expression ［J］.Dev Dyn，1998，212（4）：522-532.

［7］ Western P S，Harry J L，Graves J A M，et al.Temperature-dependent sex determination in the American alligator：AMH precedes SOX9 expression［J］.Dev Dyn，1999，216（4-5）：411-419.

［8］ Shoemaker C，Ramsey M，Queen J，et al.Expression of SOX9，Mis，and Dmrt1 in the gonad of a species with temperature-dependent sex determination［J］.Dev Dyn，2007，236（4）：1055-1063.

［9］ Yoshinaga N，Shiraishi E，Yamamoto T，et al.Sexually dimorphic expression of a teleost homologue of Müllerian inhibiting substance during gonadal sex differentiation in Japanese flounder，Paralichthys olivaceus［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2004，322（2）：508-513.

［10］ Baron D，Houlgatte R，F(xiàn)ostier A，et al.Large-scale temporal gene expression profiling during gonadal differentiation and early gametogenesis in rainbow trout［J］.Biol Reprod，2005，73（5）：959-966.

［11］ Rodríguez-Marí A，Yan Yilin，BreMiller R A，et al.Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone （amh）relative to sox9a，sox9b，and cyp19a1a，during gonad development［J］.Gene Expression Patterns，2005，5（5）：655-667. ［12］ Ijiri S，Kaneko H，Kobayashi T，et al.Sexual dimorphic expression of genes in gonads during early differentiation of a teleost fish，the Nile tilapia Oreochromis niloticus［J］.Biol Reprod，2008，78（2）：333-341.

［13］ Klüver N，Pfennig F，Pala I，et al.Differential expression of anti-Müllerian hormone（amh）and anti-Müllerian hormone receptor type II（amhrII）in the teleost medaka［J］.Dev Dyn，2007，236 （1）：271-281.

［14］ Di Marco E，Cangemi G，F(xiàn)ilippetti M，et al.Development and clinical validation of a real-time PCR using a uni-molecular Scorpion-based probe for the detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical isolates［J］.New Microbiol，2007，30（4）：415-421.

［15］ 陳旭，齊鳳坤，康立功，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究進(jìn)展及其應(yīng)用［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41（8）：148-155.

［16］ 黃韌，薛成.生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)資源與應(yīng)用［M］.廣州：中山大學(xué)出版社，2003.

［17］ 尤超，趙大球，梁乘榜，等.PCR引物設(shè)計(jì)方法綜述［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（17）：48-51.

［18］ 陳孝紅，仇雪梅，郝薇薇，等.斑馬魚(yú)CYP11a1基因在不同性腺發(fā)育時(shí)期的表達(dá)［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，30（1）：13-17.

［19］ Schmittgen T D，Livak K J.Analyzing real-time PCR data by the comparative CTmethod［J］.Nature Protocols，2008，3（6）：1101-1108.

［20］ Teng Xiaolu，Zhang Zan，He Guiling，et al.Validation of reference genes for quantitative expression analysis by real-time RT-PCR in four lepidopteran insects［J］.Journal of Insect Science，2012，12：60.

［21］ 王濟(jì)平.SPSS簡(jiǎn)明操作教程：以案例分析為導(dǎo)向［M］.武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2012：125-167.

［22］ Wang Deshou，Kobayashi T，Zhou Linyan，et al.Foxl2 up-regu-lates aromatase gene transcription in a female-specific manner by binding to the promoter as well as interacting with Ad4 binding protein/steroidogenic factor 1［J］.Molecular Endocrinology，2007，21（3）：712-725.

［23］ Halm S，Rocha A，Miura T，et al.Anti-Müllerian hormone （AMH/AMH）in the European sea bass：its gene structure，regulatory elements，and the expression of alternatively-spliced isoforms［J］.Gene，2007，388（1-2）：148-158.

［24］ 李蒙.amh、cyp19a1a和dax1的克隆及甲基睪丸酮對(duì)其在幼魚(yú)中的影響表達(dá)［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

［25］ 豆曉飛.黃河鯉和兩種泥鰍中AMH基因的克隆及其表達(dá)分析［D］.新鄉(xiāng)：河南師范大學(xué)，2013.

［26］ 劉姍姍，孫冰，梁卓，等.半滑舌鰨抗繆勒氏管激素（AMH）基因的克隆及組織表達(dá)分析［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2013，20（1）：35-43.

［27］ 唐永凱，李建林，俞菊華.奧利亞羅非魚(yú)AMH基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2009，33（3）：379-388.

［28］ 沈北岸.黃鱔抗苗勒氏管激素（amh）及其二型受體（amhr II）基因表達(dá)研究［D］.廣州：中山大學(xué)，2010.

［29］ Rashid H，Kitano H，Hoon Lee K，et al.Fugu（Takifugu rubripes）sexual differentiation：CYP19 regulation and aromatase inhibitor induced testicular development［J］.Sexual Development，2007，1 （5）：311-322.

［30］ 周賀，李佳奇，馬海艷，等.低溫誘導(dǎo)紅鰭東方鲀雄性化及性腺分化的組織學(xué)觀察［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，30（1）：41-47.

［31］ 范文濤.雜交東方鲀?cè)缙谛螒B(tài)特征、生長(zhǎng)速度和性腺分化的研究［D］.上海：上海海洋大學(xué)，2011.

［32］ Kamiya T，Kai W，Tasumi S，et al.A trans-species missense SNP in amhr2 is associated with sex determination in the tiger pufferfish，Takifugu rubripes（fugu）［J］.PLoS Genet，2012，8（7）：e1002798.

［33］ Behringer R R，F(xiàn)inegold M J，Cate R.Müllerian-inhibiting substance function during mammalian sexual development［J］.Cell，1994，79（3）：415-425.

［34］ Hattori R S，Murai Y，Oura M，et al.A Y-linked anti-Müllerian hormone duplication takes over a critical role in sex determination ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2012，109（8）：2955-2959.

［35］ 趙靜.黃鱔抗苗勒氏管激素（AMH）cDNA克隆及其表達(dá)分析［D］.廣州：中山大學(xué)，2007：10-14.

［36］ Miura T，Miura C，Konda Y，et al.Spermatogenesis-preventing substance in Japanese eel［J］.Development，2002，129（11）：2689-2697.

［37］ Shiraishi E，Yoshinaga N，Miura T，et al.Müllerian inhibiting substance is required for germ cell proliferation during early gonadal differentiation in medaka（Oryzias latipes）［J］.Endocrinology，2008，149（4）：1813-1819.

高長(zhǎng)富1，郝薇薇1，仇雪梅1，孔德榮1，孟雪松2，包玉龍2，王秀利1
（1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023；2.大連天正實(shí)業(yè)有限公司，遼寧大連116011）

Expression of anti-Müllerian hormone（AMH）gene in different tissues and developmental phases in redfin puffer Takifugu rubripes

GAO Chang-fu1，HAO Wei-wei1，QIU Xue-mei1，KONG De-rong1，MENG Xue-song2，BAO Yu-long2，WANG Xiu-li1
（1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；2.Dalian Tianzheng Industrial Corporation Limited，Dalian 116011，China）

In this study，expressions of anti-Müllerian hormone（AMH）in kidney，brain，heart，spleen，liver，testis and ovary were investigated in different developmental stages in redfin puffer Takifugu rubripes including 23，30，40，60，and 80 days old，and 2，and 3 years old individuals by fluorescence quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction（qRT-PCR）.The results showed that there was very significantly higher expression of amh gene in spleen，kidney and liver than that in other organs（P＜0.01），very significantly higher in testis than that in ovary and brain，the maximal in spleen，and the minimal in brain（P＜0.01）.There was very significantly higher expression level of amh gene in male redfin puffer with 23 and 30 days old，and 2 and 3 years old than that in female individuals（P＜0.01）.In the 60 days and 80 days old individuals，however，the female had significantly higher expression level of amh gene than the male did（P＜0.05）.No significant difference in expression level of amh gene was observed between males and females in 40 days old individuals（P＞0.05）.The 3 years old redfin puffer showed significantly higher expression of amh gene than the 2 years old one did（P＜0.05）.The amh gene expression level in males was increased from 23 days old to 30 days old，the maximal in the 30 days old indivduals，and then decreased in later stages，while the amh gene gene expression level in females was increased from 23 days old to 80 days old and subsequently was decreased in later stages.The findings indicate that amh gene may play an important role in gonadal development and sex differentiation in redfin puffer.

Takifugu rubripes；quantitative Real-Time PCR；AMH；gene expression

Q45

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.04.008

2095-1388（2016）04-0390-07

2015-10-26

大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目 （2014B11NC091）；大連海洋大學(xué)科研項(xiàng)目 （2012HYDX07）；國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)（201405003）

高長(zhǎng)富 （1990—），男，碩士研究生。E-mail：gaochf0227@163.com

仇雪梅 （1964—），女，博士，教授。E-mail：xmqiu@dlou.edu.cn