育苗階段蝦夷扇貝幼體中可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性

育苗階段蝦夷扇貝幼體中可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性

為了研究蝦夷扇貝Patinopecten yessoensis育苗過程中5個(gè)發(fā)育時(shí)期 （受精卵時(shí)期S1、擔(dān)輪幼蟲時(shí)期S2、D形幼蟲時(shí)期S3、殼頂幼蟲時(shí)期S4、稚貝時(shí)期S5）幼體所含可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性，采用2216E平板涂布法，從每個(gè)發(fā)育時(shí)期的幼體樣品中各分離出30株細(xì)菌，并對150株菌進(jìn)行16S rRNA基因測序分析。結(jié)果表明：150株細(xì)菌歸屬于2門3綱8目12科16屬39種；在門水平，5個(gè)時(shí)期幼體樣品中變形菌門均為優(yōu)勢門，其次為厚壁菌門；在屬水平，優(yōu)勢屬為弧菌屬 （51/150）、假交替單胞菌屬 （43/150）、芽孢桿菌屬 （16/150）、交替單胞菌屬 （9/150），占總數(shù)的79.3%；其中弧菌屬在S1（43.3%）、S2（36.7%）、S3（36.7%）時(shí)期均為優(yōu)勢屬，在S1時(shí)期，次優(yōu)勢屬依次為假交替單胞菌屬 （26.7%）、動(dòng)性球菌屬（10.0%）和枝芽孢桿菌屬 （6.7%），在S2時(shí)期，次優(yōu)勢屬依次為假交替單胞菌屬 （23.3%）、亞硫酸桿菌屬 （20.0%）和芽孢桿菌屬 （13.3%），在S3時(shí)期，次優(yōu)勢屬依次為假交替單胞菌 （16.7%）、動(dòng)性球菌屬 （13.3%）和交替單胞菌屬 （10.0%）；假交替單胞菌在S4（36.7%）和S5（40.0%）時(shí)期均為優(yōu)勢屬，在S4時(shí)期，次優(yōu)勢屬依次為弧菌屬 （30.0%）、芽孢桿菌屬 （16.7%）和交替單胞菌屬 （10.0%），在S5時(shí)期，次優(yōu)勢屬依次為弧菌屬 （23.3%）、芽孢桿菌屬（16.7%）和Pontibacillus（10.0%）。研究表明，蝦夷扇貝育苗過程中不同發(fā)育時(shí)期的幼體所含可培養(yǎng)細(xì)菌種類比較豐富，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在較大差異。

蝦夷扇貝幼體；16S rRNA基因；細(xì)菌多樣性

蝦夷扇貝Patinopecten yessoensis隸屬于軟體動(dòng)物門、瓣鰓綱、扇貝科，是一種大型冷水性貝類，具有生長快、個(gè)體肥大、味道鮮美、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)。該品種自然分布于日本北海道、本州北部，俄羅斯遠(yuǎn)東沿海，朝鮮半島北部。自從20世紀(jì)80年代被引入中國后，蝦夷扇貝就成為中國北方主要的貝類養(yǎng)殖品種之一［1］。由于大連獐子島海域得天獨(dú)厚的地理?xiàng)l件，獐子島集團(tuán)成為了中國最大的蝦夷扇貝養(yǎng)殖基地。然而，在蝦夷扇貝育苗過程中，由于條件致病菌的存在，經(jīng)常會(huì)發(fā)生苗種大量死亡的現(xiàn)象，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，這成為蝦夷扇貝養(yǎng)殖中的一個(gè)最主要的限制因素［2］。因此，只有解決這個(gè)問題，才能為蝦夷扇貝的商業(yè)化育苗提供安全可靠的生物技術(shù)支持。

蝦夷扇貝和其他雙殼貝類一樣都是濾食性種類，其進(jìn)食方式使扇貝幼體與大量的細(xì)菌接觸，這些細(xì)菌中很可能有一些是條件致病菌，在扇貝育苗過程中存在潛在威脅［2-4］。除了潛在的致病菌外，有些細(xì)菌在扇貝幼體的健康發(fā)育過程中也有著重要作用。Jorquera等［5］報(bào)道了細(xì)菌可以作為雙殼貝類的食物和維生素來源，并且在提高機(jī)體對細(xì)菌性疾病的抵抗力和生長發(fā)育速度方面起著重要作用。研究蝦夷扇貝幼體發(fā)育過程中的細(xì)菌群落是了解其潛在致病菌和益生菌的第一步，也可為調(diào)節(jié)育苗過程中的細(xì)菌群落提供參考。Godoy等［6］用培養(yǎng)方法研究了紫扇貝Argopecten purpuratus幼體發(fā)育階段可培養(yǎng)細(xì)菌的群落組成，發(fā)現(xiàn)幼體細(xì)菌群落與其生活的水體和進(jìn)食的藻類細(xì)菌群落有很大不同。細(xì)菌群落的相對穩(wěn)定對于育苗的成功很重要。Sandaa等［7］研究了大扇貝Pecten maximus幼體早期發(fā)育階段的細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)，發(fā)現(xiàn)在幼體發(fā)育的早期階段其細(xì)菌群落組成略有改變。

本研究中，結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和16S rRNA基因序列分析，研究了蝦夷扇貝幼體細(xì)菌多樣性，旨在為益生菌的篩選、餌料研發(fā)和病害防治提供依據(jù)，并為實(shí)現(xiàn)生態(tài)系統(tǒng)調(diào)控與管理、合理保護(hù)環(huán)境、實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

2014年3—4月從獐子島集團(tuán)蝦夷扇貝育苗池采集蝦夷扇貝5個(gè)發(fā)育時(shí)期 （受精卵時(shí)期S1、擔(dān)輪幼蟲時(shí)期S2、D形幼蟲時(shí)期S3、殼頂幼蟲時(shí)期S4和稚貝時(shí)期S5）的幼體樣品。

1.2方法

1.2.1樣品的處理 用300目無菌篩絹從育苗池收集各個(gè)發(fā)育時(shí)期的扇貝幼體樣品于無菌離心管中，用無菌海水沖洗3次，離心 （3000 r/min，10 min，4℃）后稱重，加入9倍無菌生理鹽水，用可調(diào)速勻漿器研磨均勻。

1.2.2異養(yǎng)細(xì)菌的分離、計(jì)數(shù)和純化 將勻漿液梯度稀釋，取稀釋液100 μL涂布于2216E平板上，于15℃下培養(yǎng)7 d，計(jì)數(shù)。在適當(dāng)稀釋度的平板上各隨機(jī)挑取30個(gè)菌落，在2216E平板上劃線純化，獲得純培養(yǎng)分別于4℃和-80℃下保存。

1.2.3細(xì)菌DNA的提取、PCR擴(kuò)增 將純菌株接種到2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，使用土壤基因組DNA快速提取試劑盒 ［生工生物工程 （上海）股份有限公司］提取細(xì)菌基因組DNA，提取方法參照試劑盒說明書。細(xì)菌16S rRNA基因片段的擴(kuò)增引物為F27/R1492，由生工生物工程 （上海）股份有限公司合成，引物序列參照文獻(xiàn) ［8］。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參考文獻(xiàn) ［2］。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物是否符合目標(biāo)條帶，并由生工生物工程 （上海）股份有限公司完成PCR產(chǎn)物的測序。

1.3數(shù)據(jù)處理

將獲得的各菌株序列在EzBioCloud（http：// www.ezbiocloud.net/eztaxon）公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列同源性比對，從結(jié)果中取第一個(gè)相似性最高的序列。將比對后相似性大于97%的菌株作為一個(gè)種［9］，反之則為兩個(gè)種。

為了比較不同發(fā)育時(shí)期幼體樣品間細(xì)菌群落的差異，計(jì)算Shannon多樣性指數(shù)［10］、Pielou均勻度指數(shù)［11］和S?rensen相似性指數(shù)［12］。

2　結(jié)果與分析

2.1扇貝幼體5個(gè)發(fā)育時(shí)期異養(yǎng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)

各個(gè)時(shí)期幼體異養(yǎng)細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果如表1所示，在S1時(shí)期的幼體所含異養(yǎng)細(xì)菌量最少，與其未開口攝食有關(guān)。隨著幼體的生長發(fā)育，其體內(nèi)異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量總體呈遞增趨勢。

表1　蝦夷扇貝幼體不同發(fā)育時(shí)期異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量Tab.1 Heterotrophic bacterial counts in Yesso scallop larvae across different developmental stages

2.2扇貝幼體5個(gè)發(fā)育時(shí)期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)過與16S rRNA基因序列比對，150株細(xì)菌歸屬于2門3綱8目12科16屬 （圖1）。以變形菌門Proteobacteria（121/150）為優(yōu)勢，其次是厚壁菌門Firmicutes（29/150）。優(yōu)勢綱為γ-變形菌綱γ-Proteobacteria（110/150），在S1～S5時(shí)期樣品中所占比例分別為 83.3%、63.3%、70.0%、76.7%和73.3%，其次為芽孢桿菌綱Bacilli，5個(gè)時(shí)期樣品中所占比例分別為 16.7%、16.7%、20.0%、16.7%和26.7%；S2、S3和S4時(shí)期含有α-變形菌綱α-Proteobacteria，3個(gè)時(shí)期樣品中所占比例分別為20.0%、10.0%和6.7%。

優(yōu)勢目為交替單胞菌目 Alteromonadales （54/150）、弧菌目Vibrionales（51/150）和芽孢桿菌目Bacillales（29/150），占總數(shù)的89.3%?；【吭赟1（43.3%）、S2（36.7%）和S3（36.7%）時(shí)期均為優(yōu)勢目，在S1和S3時(shí)期，次優(yōu)勢目依次為交替單胞菌目 （30.0%和30.0%）和芽孢桿菌目 （16.7%和20.0%），在S2時(shí)期，次優(yōu)勢目依次為交替單胞菌目（26.7%）、紅細(xì)菌目Rhodobacterales（20.0%）和 芽 孢 桿 菌 目（16.7%）；交替單胞菌目在 S4（46.7%）和 S5 （46.7%）時(shí)期均為優(yōu)勢目，在S4時(shí)期，次優(yōu)勢目依次為弧菌目 （30.0%）和芽孢桿菌目（16.7%），在S5時(shí)期，次優(yōu)勢目依次為芽孢桿菌目 （26.7%）和弧菌目 （23.3%）。

優(yōu)勢科為弧菌科Vibrionaceae（51/150）、假交替單胞菌科Pseudoalteromonadaceae（43/150）、芽孢桿菌科 Bacillaceae（22/150）、紅細(xì)菌科 Rhodobacteraceae（6/150）、交替單胞菌科Alteromonadaceae（9/150）、動(dòng)性球菌科Planococcaceae（7/150），占總數(shù)的 92.0%。弧菌科在 S1（43.3%）、S2 （36.7%）和S3（36.7%）時(shí)期均為優(yōu)勢科，在S1時(shí)期，次優(yōu)勢科依次為假交替單胞菌科（26.7%）、動(dòng)性球菌科 （10.0%）和芽孢桿菌科（6.7%），在S2時(shí)期，次優(yōu)勢科依次為假交替單胞菌科 （23.3%）、紅細(xì)菌科 （20.0%）和芽孢桿菌科 （16.7%），在S3時(shí)期，次優(yōu)勢科依次為假交替單胞菌科 （16.7%）、動(dòng)性球菌科 （13.3%）和交替單胞菌科 （10.0%）；假交替單胞菌科在S4 （36.7%）和S5（40.0%）時(shí)期均為優(yōu)勢科，在S4時(shí)期，次優(yōu)勢科依次為弧菌科 （30.0%）、芽孢桿菌科 （16.7%）和交替單胞菌科 （10.0%），在S5時(shí)期，次優(yōu)勢科依次為芽孢桿菌科 （26.7%）、弧菌科 （23.3%）和交替單胞菌科 （6.7%）。

優(yōu)勢屬為弧菌屬Vibrio（51/150）、假交替單胞菌屬 Pseudoalteromonas（43/150）、芽孢桿菌屬Bacillus（16/150）、交替單胞菌屬 Alteromonas （9/150），占總數(shù)的 79.3%?；【鷮僭赟1 （43.3%）、S2（36.7%）和S3（36.7%）時(shí)期均為優(yōu)勢屬，在S1時(shí)期，次優(yōu)勢屬依次為假交替單胞菌（26.7%）、動(dòng) 性 球 菌 屬Planococcus （10.0%）和枝芽孢桿菌屬Virgibacillus（6.7%），在S2時(shí)期，次優(yōu)勢屬依次是假交替單胞菌屬（23.3%）、亞硫酸桿菌屬 Sulfitobacter（20.0%）和芽孢桿菌屬 （13.3%），在S3時(shí)期，次優(yōu)勢屬依次為假交替單胞菌屬 （16.7%）、動(dòng)性球菌屬（13.3%）和交替單胞菌屬 （10.0%）；假交替單胞菌屬在S4（36.7%）和S5（40.0%）時(shí)期成為優(yōu)勢屬，在 S4時(shí)期，次優(yōu)勢屬依次為弧菌屬（30.0%）、芽孢桿菌屬 （16.7%）和交替單胞菌屬 （10.0%），在S5時(shí)期，次優(yōu)勢屬依次為弧菌屬 （23.3%）、芽孢桿菌屬 （16.7%）和Pontibacillus（10.0%）。

圖1　蝦夷扇貝幼體不同發(fā)育時(shí)期可培養(yǎng)細(xì)菌群落組成 （科、屬水平）Fig.1 Culturable bacterial community composition（at family and genus levels）in Yesso scallop larvae across different developmental stages

2.3扇貝幼體5個(gè)發(fā)育時(shí)期細(xì)菌群落多樣性及相似性分析

所有菌株與相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列相似性為99%。按16S rRNA基因序列相似性大于97%的菌株歸于同一種計(jì)［9］，150株細(xì)菌可以歸為39種。蝦夷扇貝幼體各個(gè)發(fā)育時(shí)期種水平細(xì)菌群落組成見表2。從Shannon指數(shù)和Pielou指數(shù)可以看出，不同發(fā)育時(shí)期細(xì)菌多樣性存在一定差異，細(xì)菌種類分布較為均勻 （表3）。S?rensen指數(shù)表明，幼體發(fā)育S1時(shí)期與其他4個(gè)時(shí)期，S2時(shí)期與S3和S4時(shí)期，以及S3時(shí)期與S5時(shí)期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有較大差異 （表4）。

表2　蝦夷扇貝幼體不同發(fā)育時(shí)期可培養(yǎng)細(xì)菌群落組成 （種水平）Tab.2 Culturable bacterial community composition（at species level）in Yesso scallop larvae across different developmentalstages

表3　蝦夷扇貝幼體不同發(fā)育時(shí)期可培養(yǎng)細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)和Pielou指數(shù)Tab.3 Shannon and Pielou indices of culturable bacterial communities in Yesso scallop larvae across differental developmental stages

表4　蝦夷扇貝幼體不同發(fā)育時(shí)期可培養(yǎng)細(xì)菌群落的S?rensen 相似性指數(shù)Tab. 4 S?rensen index of culturable bacterial communitiesin Yesso scallop larvae across different developmental stages

3　討論

3.1扇貝幼體5個(gè)發(fā)育時(shí)期異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量及群落

變化

本研究中，隨著生長發(fā)育，蝦夷扇貝幼體各個(gè)發(fā)育時(shí)期的異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量從受精卵時(shí)期的103CFU/g逐漸增加到稚貝時(shí)期的105CFU/g，而從紫扇貝幼體發(fā)育階段幼體中分離的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量在受精卵由0 d發(fā)育到3 d時(shí)增加不到一個(gè)數(shù)量級(jí)，3 d以后數(shù)量基本保持穩(wěn)定［6］，這一差異可能是由換水周期差異較大引起的。在受精卵時(shí)期，優(yōu)勢屬是弧菌屬 （43.3%），隨著蝦夷扇貝幼體的生長發(fā)育，優(yōu)勢屬發(fā)生了變化 （圖1）。這一結(jié)果與紫扇貝幼體發(fā)育階段幼體中分離的可培養(yǎng)細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)相似［6］。Sandaa等［7］的研究表明，大扇貝幼體早期生長階段相關(guān)細(xì)菌變性梯度凝膠電泳 （DGGE）圖譜中的條帶數(shù)目發(fā)生改變。

3.2扇貝幼體5個(gè)發(fā)育時(shí)期細(xì)菌群落組成

在蝦夷扇貝幼體5個(gè)發(fā)育階段，優(yōu)勢門為變形菌門，其次是厚壁菌門，在綱水平，優(yōu)勢綱為γ-變形菌綱，其次是芽孢桿菌綱。這與從紫扇貝幼體中分離的32株細(xì)菌結(jié)果一致［6］。變形菌門不僅在扇貝幼體中是優(yōu)勢門，在健康的蝦夷扇貝成體中通常也是優(yōu)勢門［13-14］。

在屬水平，共分離到16個(gè)屬 （圖1）。其中交替單胞菌屬、芽孢桿菌屬、弧菌屬在紫扇貝幼體中也是優(yōu)勢屬［6］。假交替單胞菌屬的種類可在大扇貝幼體中檢測出［7］。來源于紫扇貝幼體的L-07菌株與亞硫酸桿菌 IS1菌株相似性為95%［6］。假交替單胞菌屬和希瓦氏菌屬Shewanella也存在于健康蝦夷 扇 貝 中［13］。Idiomarina、鹽 單 胞 菌 屬Halomonas、希瓦氏菌屬、假交替單胞菌屬、芽孢桿菌屬、弧菌屬和枝芽孢桿菌屬在香港巨牡蠣Crassostrea hongkongensis成體相關(guān)可培養(yǎng)細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)［15］。動(dòng)性球菌屬可從雙殼類Modiolus dificilus成體中分離出［16］。

前人研究表明，弧菌是扇貝幼體主要的致病菌［2，4，17-19］。在育苗過程中，殼頂幼蟲（S4時(shí)期）出現(xiàn)較多死亡可能與弧菌有關(guān)。從蝦夷扇貝幼體中分離出的燦爛弧菌 Vibrio splendidus、V.neocaledonicus和 V.kanaloae可能存在潛在致病性。Liu等［2］從獐子島集團(tuán)育苗室患病蝦夷扇貝幼體中分離出燦爛弧菌，感染試驗(yàn)證實(shí)，此菌能使蝦夷扇貝幼體大量死亡。該菌也是商業(yè)育苗場紫扇貝幼體大量死亡的病原菌［4］。V.neocaledonicus在S2、S3和S4時(shí)期出現(xiàn)頻率較高 （20.0%～26.7%），該菌曾從弧菌病暴發(fā)的菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum幼體中分離出［20］。菱形蛤仔 Venerupis rhomboides成體容易被V.kanaloae菌和燦爛弧菌感染［21］。因此，在扇貝育苗過程中應(yīng)十分重視對水溫和水質(zhì)的監(jiān)測，保證營養(yǎng)供給，減少潛在致病菌感染的機(jī)會(huì)。

本研究中，從蝦夷扇貝幼體中分離出的若干假交替單胞菌、弧菌、芽孢桿菌和交替單胞菌可能對扇貝幼體產(chǎn)生有益的影響。假交替單胞菌D41菌株，可提高大扇貝幼體對燦爛弧菌感染的抵抗力［22］。實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果表明，添加弧菌OY15菌株可使2 d美洲牡蠣Crassostrea virginica幼體經(jīng)病原菌弧菌B183菌株攻毒后48 h的存活率提高［23］。商業(yè)規(guī)模試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)用或不用病原菌弧菌B183菌株攻毒時(shí)，添加候選益生菌弧菌OY15菌株能顯著提高美洲牡蠣在幼體變態(tài)過程中的存活率［24］?；旌暇?（弧菌C33菌株、假單胞菌11菌株和芽孢桿菌B2菌株）能夠提高紫扇貝幼體存活率，使其在不使用抗生素的情況下順利度過浮游幼體階段［25］。Douillet等［26］發(fā)現(xiàn)，添加交替單胞菌CA2菌株可提高太平洋牡蠣Crassostrea gigas幼體的存活率和生長。本試驗(yàn)中分離的若干假交替單胞菌、弧菌、交替單胞菌和芽孢桿菌是否可作為益生菌添加在蝦夷扇貝育苗池中有待進(jìn)一步研究。

［1］ 李文姬，譚克非.日本解決蝦夷扇貝大規(guī)模死亡的啟示［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2009，28（10）：609-612.

［2］ Liu Jichen，Sun Xueying，Li Ming，et al.Vibrio infections associated with Yesso scallop（Patinopecten yessoensis）larval culture［J］.Journal of Shellfish Research，2015，34（2）：213-216.

［3］ Paillard C，Le Roux F，Borreg J J.Bacterial disease in marine bivalves，a review of recent studies：trends and evolution［J］.A-quatic Living Resources，2004，17：477-498.

［4］ Rojas R，Miranda C D，Opazo R，et al.Characterization and pathogenicity of Vibrio splendidus strains associated with massive mortalities of commercial hatchery-reared larvae of scallop Argopecten purpuratus（Lamarck，1819）［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2015，124：61-69.

［5］ Jorquera M A，Silva F R，Riquelme C E.Bacteria in the culture of the scallop Argopecten purpuratus（Lamarck，1819）［J］.Aquaculture International，2001，9（4）：285-303.

［6］ Godoy F，Espinoza M，Wittwer G，et al.Characterization of culturable bacteria in larval cultures of the Chilean scallop Argopecten purpuratus［J］.Ciencias Marinas，2011，37（3）：339-348.

［7］ Sandaa R A，Magnesen T，Torkildsen L，et al.Characterisation of the bacterial community associated with early stages of great scallop （Pecten maximus），using denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）［J］.Systematic and Applied Microbiology，2003，26 （2）：302-311.

［8］ Stackebrandt E，Goodfellow M.Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics［M］.Chichester：John Wiley&Sons Press，1991：115-175.

［9］ Stackebrandt E，Goebel B M.Taxonomic note：a place for DNADNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，1994，44（4）：846-849.

［10］ Shannon C E.A mathematical theory of communication［J］.The Bell System Technical Journal，1948，27（3）：379-423.

［11］ Pielou E C.The measurement of diversity in different types of biological collections［J］.Journal of Theoretical Biology，1996，13：131-144.

［12］ S?rensen T.A method of establishing groups of equal amplitude in plant sociology based on similarity of species content and its application to analyses of the vegetation on Danish commons［J］. Kongelige Danske Videnskabernes Selskabs Biologiske Skrifter，1948，5（4）：1-34.

［13］ Schulze A D，Alabi A O，Tattersall-Sheldrake A R，et al.Bacterial diversity in a marine hatchery：balance between pathogenic and potentially probiotic bacterial strains［J］.Aquaculture，2006，256 （1-4）：50-73.

［14］ 丁君，竇妍，徐高蓉，等.基于454焦磷酸測序分析蝦夷扇貝外套膜菌群多樣性［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2014，25（11）：3344-3348.

［15］ 肖建青，朱泓溢，劉祝祥，等.硇洲島潮汐帶牡蠣相關(guān)可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2013，40（6）：939-950.

［16］ Beleneva I A，Zhukova N V.Seasonal dynamics of cell numbers and biodiversity of marine heterotrophic bacteria inhabiting invertebrates and water ecosystems of the Peter the Great Bay，Sea of Japan［J］.Microbiology，2009，78（3）：369-375.

［17］ Nicolas J L，Corre S，Gauthier G，et al.Bacterial problems associated with scallop Pecten maximus larval culture［J］.Diseases of Aquatic Organisms，1996，27（1）：67-76.

［18］ Torkildsen L，Lambert C，Nylund A，et al.Bacteria associated with early life stages of the great scallop，Pecten maximus：impact on larval survival［J］.Aquaculture International，2005，13（6）：575-592.

［19］ Sandlund N，Torkildsen L，Magnesen T，et al.Immunohistochemistry of great scallop Pecten maximus larvae experimentally challenged with pathogenic bacteria［J］.Diseases of Aquatic Organisms，2006，69（2-3）：163-173.

［20］ Dubert J，Osorio C R，Prado S，et al.Persistence of antibiotic resistant Vibrio spp.in shellfish hatchery environment［J］.Microbial Ecology，2015，doi：10.1007/s00248-015-0705-5

［21］ Guisande J A，Pérez Lago E，Prado S，et al.Genotypic diversity of culturable Vibrio species associated with the culture of oysters and clams in Galicia and screening of their pathogenic potential［J］. Journal of Shellfish Research，2008，27（4）：801-809.

［22］ Kesarcodi-Watson A，Miner P，Nicolas J L，et al.Protective effect of four potential probiotics against pathogen-challenge of the larvae of three bivalves：Pacific oyster（Crassostrea gigas），flat oyster （Ostrea edulis）and scallop（Pecten maximus）［J］.Aquaculture，2012，344-349：29-34.

［23］ Lim H J，Kapareiko D，Schott E J，et al.Isolation and evaluation of new，probiotic bacteria for use in shellfish hatcheries：I.isolation and screening for bioactivity［J］.Journal of Shellfish Research，2011，30（3）：609-615.

［24］ Kapareiko D，Lim H G，Schott E J，et al.Isolation and evaluation of new probiotic bacteria for use in shellfish hatcheries：II.effects of a Vibrio sp.probiotic candidate upon survival of oyster larvae （Crassostrea virginica）in pilot-scale trials［J］.Journal of Shellfish Research，2011，30（3）：617-625.

［25］ Riquelme C，Jorquera M，Rojas A，et al.Addition of inhibitorproducing bacteria to mass cultures of Argopecten purpuratus larvae（Lamarck，1819）［J］.Aquaculture，2001，192（2）：111-119. ［26］ Douillet P，Langdon C J.Effects of marine bacteria on the culture of axenic oyster Crassostrea gigas（Thunberg）larvae［J］.Biological Bulletin，1993，184：36-51.

李明1，劉繼晨2，孫雪瑩2，趙學(xué)偉1，梁峻1，孫丕海3，馬悅欣2
（1.獐子島集團(tuán)股份有限公司，遼寧大連116001；2.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023；3.大連海洋大學(xué)海珍品苗種培育基地，遼寧大連116023）

Culturable bacterial diversity in larval breeding in Yesso scallop Patinopecten yessoensis

LI Ming1，LIU Ji-chen2，SUN Xue-ying2，ZHAO Xue-wei1，LIANG Jun1，SUN Pi-hai3，MA Yue-xin2
（1.Zhangzidao Group Co.Ltd.，Dalian 116001，China；2.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；3.Seafood Seedling Breeding Base，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

The present study was aimed to examine the cultivable bacterial community associated with Yesso scallop Patinopecten yessoensis larval development stages（fertilized egg S1，trochophora S2，D-shaped larva S3，umbo larva S4，and juvenile scallop S5）.Thirty bacterial strains were isolated from samples in each larval stage by Zobell 2216E，and 150 bacterial strains were identified by polymerase chain reaction and partial 16S rRNA gene sequencing.Results showed that all isolates were found to be in 2 phyla，3 classes，8 orders，12 families，16 genera and 39 species，with the most abundant Proteobacteria，followed by Firmicutes across the five developmental stages.At genus level，the dominant genera were Vibrio（51/150），Pseudoalteromonas（43/150），Bacillus（16/150）and Alteromonas（9/150），accounting for 79.3%of the total.Vibrio was dominant genus in stages of S1（43.3%），S2 （36.7%），S3（36.7%），followed by Pseudoalteromonas（26.7%），Planococcus（10.0%）and Virgibacillus （6.7%）in stage S1，Pseudoalteromonas（23.3%），Sulfitobacter（20.0%）and Bacillus（13.3%）in stage S2，and Pseudoalteromonas（16.7%），Planococcus（13.3%）and Alteromonas（10.0%）in stage S3.However，Pseudoalteromonas became the dominant in stages of S4（36.7%）and S5（40.0%），followed by Vibrio（30.0%），Bacillus（16.7%）and Alteromonas（10.0%）in stage S4，and Vibrio（23.3%），Bacillus（16.7%）and Pontibacillus （10.0%）in stage S5.The findings showed that there were abundant bacterial diversities and different communities among various larval development stages.

Patinopecten yessoensis larva；16S rRNA gene；bacterial diversity

Q938.1

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.04.005

2095-1388（2016）04-0374-06

2015-11-03

獐子島集團(tuán)資助項(xiàng)目 （99801214）；遼寧省科技攻關(guān)重大項(xiàng)目 （2015203003）

李明 （1987—），男，工程師。E-mail：goudanliming@163.com

馬悅欣 （1963—），女，博士，教授。E-mail：mayuexin@dlou.edu.cn