組織培養(yǎng)條件下甘草種子休眠解除方法的優(yōu)化△

梁曉薇，梅凌鋒，張春榮*，唐曉敏，程軒軒，楊全

(1.廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點研究室，廣東 廣州 510006；3.道地藥材國家重點實驗室培訓(xùn)基地 中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700)

組織培養(yǎng)條件下甘草種子休眠解除方法的優(yōu)化△

梁曉薇1,2，梅凌鋒1,2，張春榮1,2*，唐曉敏1,2，程軒軒1,2，楊全1，2，3*

(1.廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點研究室，廣東 廣州 510006；3.道地藥材國家重點實驗室培訓(xùn)基地 中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700)

目的：甘草種子硬實，表面蠟質(zhì)包被是影響組織培養(yǎng)條件下甘草種子萌發(fā)的主要因素。通過對甘草種子進(jìn)行處理，得到組織培養(yǎng)條件下提高甘草種子萌發(fā)率和消毒效果的方法。方法：將甘草種子用98%硫酸處理、滅菌熱水處理、各濃度次氯酸鈉溶液處理后在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，考察種子萌發(fā)及消毒效果。結(jié)果：組織培養(yǎng)條件下，常溫水浸泡24 h的甘草種子吸脹率為36.67%，發(fā)芽率為10%，經(jīng)過濃硫酸浸泡80 min、60 ℃熱水浸泡24 h(自然冷卻至室溫)和3%次氯酸鈉溶液浸泡15 min的甘草種子吸脹率分別達(dá)到100%、42.16%和46.7%；發(fā)芽率分別為77.79%、36.67%和24.44%。濃硫酸和次氯酸鈉溶液處理的甘草種子消毒效果較好。結(jié)論98%硫酸浸泡80 min或者60 ℃熱水浸泡24 h(自然冷卻)后再用3%次氯酸鈉溶液浸泡15 min，均能使甘草種子達(dá)到良好的消毒效果和較高的萌發(fā)率。

甘草；種子萌發(fā)；組織培養(yǎng)

甘草GlycyrrhizauralensisFisch.為豆科多年生草本植物，其根和根莖為常用中藥，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效[1]，是我國大宗藥材和食品甜味劑。野生甘草資源少且禁止采挖，人工栽培資源成為藥材的主要商品來源，但是產(chǎn)量和質(zhì)量參次不齊。植物組織培養(yǎng)是實現(xiàn)甘草快速繁殖、優(yōu)良品種培育和有效成分生物技術(shù)生產(chǎn)的主要途徑。甘草的組織培養(yǎng)一般以種子萌發(fā)獲得的無菌苗為外植體[2-3]，但甘草種子硬實度高、表面有蠟質(zhì)包裹，導(dǎo)致自然萌發(fā)率低，活力弱[4]。濃硫酸處理[5]、熱水燙種[6]、機(jī)械摩擦破壞種皮等方法均可促進(jìn)硬實種子的萌發(fā)[7]。機(jī)械摩擦不利于種子的表面滅菌。因此，本文采用濃硫酸處理和熱水浸泡結(jié)合消毒液處理，研究組織培養(yǎng)條件下提高甘草種子萌發(fā)和消毒效果的方法。

1 材料

甘草種子采自內(nèi)蒙古杭錦旗人工栽培基地4年生甘草，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院魏勝利副教授鑒定為甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的種子。

2 方法

2.1 硬實種子的處理

2.1.1 對照將甘草種子在常溫下用水浸泡24 h，置于濕潤的濾紙上，25 ℃恒溫培養(yǎng)。

2.1.2 濃硫酸處理用98%濃硫酸分別浸泡甘草種子20、40、60、80、100、120 min，取出后用水沖洗至pH為中性，在水中24 h，置于濕潤的濾紙上，25 ℃恒溫培養(yǎng)。

2.1.3 熱水處理將種子分別置于100、80、60 ℃熱水中至自然冷卻并浸泡24 h，置于濕潤的濾紙上，25 ℃恒溫培養(yǎng)。

2.2 組織培養(yǎng)種子的無菌萌發(fā)試驗

2.2.1 對照無菌條件下，將甘草種子用無菌水浸泡24 h，置MS培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)。

2.2.2 濃硫酸處理無菌條件下，以2.1.2得到的濃硫酸處理最佳時間浸泡種子，用無菌水沖洗至pH為中性后，浸泡于無菌水中24 h，置MS培養(yǎng)基中25 ℃恒溫培養(yǎng)。

2.2.3 熱水處理無菌條件下，用2.1.3得到的最佳溫度的無菌水浸泡種子至自然冷卻并持續(xù)24 h。將種子置MS培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)。

2.2.4 次氯酸鈉溶液消毒無菌條件，將種子用75%乙醇浸泡30 s，常溫?zé)o菌水清洗3次后置3%或5%次氯酸鈉溶液中各浸泡10、15、25 min，無菌水沖洗3次后浸泡24 h。將種子置MS培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

種子萌發(fā)試驗的檢測指標(biāo)參照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》[8]和《International Rules for Seed Testing》[9]進(jìn)行。

2.3.1 發(fā)芽試驗種子浸泡24 h后，凡體積達(dá)到原體積2倍者記為吸脹種子。胚根突出種皮的長度為種子長度的一半時即為發(fā)芽的種子。甘草種子培養(yǎng)的第4天統(tǒng)計發(fā)芽勢，第10天統(tǒng)計發(fā)芽率。

發(fā)芽勢(GP)=(前4天正常發(fā)芽種子數(shù)/ 供試種子數(shù))×100%

發(fā)芽率(GR)=(規(guī)定時間內(nèi)種子發(fā)芽數(shù)/ 供試種子數(shù))×100%

萌發(fā)指數(shù)(GI)=Σ(Gt/Dt)，Gt：時間t內(nèi)發(fā)芽數(shù)；Dt：相應(yīng)發(fā)芽天數(shù)。

2.3.2 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)利用SPSS20.0統(tǒng)計進(jìn)行統(tǒng)計和單因素方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 硬實種子的處理

3.1.1 濃硫酸處理對種子萌發(fā)的影響如圖1所示，甘草種子經(jīng)濃硫酸浸泡不同時間處理后培養(yǎng)至第4 d發(fā)芽率都趨于穩(wěn)定，培養(yǎng)10 d時發(fā)芽率都達(dá)到最高。其中，經(jīng)過濃硫酸浸泡80 min的種子發(fā)芽率最高，達(dá)到77.78%。其次為浸泡60 min的種子，發(fā)芽率達(dá)到70%，浸泡120 min的種子發(fā)芽率低至50%，而未經(jīng)濃硫酸浸泡的對照種子發(fā)芽率最高僅為10%。此外，與對照相比，硫酸浸泡80 min種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均有顯著提高。

圖1 甘草種子的發(fā)芽率曲線及濃硫酸處理時間的影響

3.1.2 熱水浸泡對種子萌發(fā)的影響將甘草種子置初始溫度分別為室溫(25 ℃)和60 ℃、80 ℃、100 ℃的水(均自然冷卻至室溫)浸泡24 h后培養(yǎng)，吸脹率、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、萌發(fā)指數(shù)存在差異顯著。水的溫度與種子吸脹率呈正相關(guān)，用100 ℃熱水處理的甘草種子吸脹率最高，達(dá)到87.78%。但是，水溫較高時，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)呈下降的趨勢。水溫為60 ℃時，甘草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢及萌發(fā)指數(shù)最高。因此，用60 ℃熱水浸泡種子的萌發(fā)效果最佳。

3.2 組織培養(yǎng)種子的萌發(fā)

3.2.1 組織培養(yǎng)種子的預(yù)處理以2.1.2、2.1.3得到的最佳萌發(fā)條件進(jìn)行無菌苗的培養(yǎng)(表3)。與無菌水浸泡的對照種子相比，濃硫酸處理80 min、60 ℃無菌水處理的甘草種子的吸脹率、發(fā)芽勢、發(fā)芽率，均有顯著提高，且以濃硫酸處理80 min的甘草種子萌發(fā)情況最佳，得到的苗無污染。60 ℃無菌水處理的種子和對照種子萌發(fā)的苗均存在染菌情況。

3.2.2 次氯酸鈉溶液處理將組織培養(yǎng)種子用不同濃度的次氯酸鈉溶液浸泡不同時間，以無菌水浸泡種子作為對照。如表4所示，3%和5%次氯酸鈉溶液浸泡處理對甘草的吸脹率、發(fā)芽勢的影響與對照組相比沒有顯著性差異，都能獲得無菌苗。其中3%次氯酸鈉溶液浸泡15 min的種子發(fā)芽率顯著高于對照組，因此可選取3%次氯酸鈉溶液浸泡15 min達(dá)到消毒滅菌的效果。

表1 濃硫酸處理時間對甘草種子萌發(fā)的影響

注：表中小寫英文字母表示5%顯著水平，大寫英文字母表示1%顯著水平。

表2 水溫對甘草種子萌發(fā)的影響

注：表中小寫英文字母表示5%顯著水平，大寫英文字母表示1%顯著水平。

表3 濃硫酸和熱水處理對組織培養(yǎng)甘草種子萌發(fā)情況的影響

注：表中小寫英文字母表示5%顯著水平，大寫英文字母表示1%顯著水平。

表4 不同濃度、處理時間次氯酸鈉對組織培養(yǎng)甘草種子萌發(fā)情況的影響

注：表中小寫英文字母表示5%顯著水平，大寫英文字母表示1%顯著水平。

4 結(jié)論與討論

種子硬實是許多豆科植物的特征[10]。甘草種子的種皮堅硬，屬于硬實種子，需要經(jīng)物理和化學(xué)方法處理才能改善種皮的通透性、促進(jìn)水分進(jìn)入，從而促進(jìn)萌發(fā)。本文采用濃硫酸浸蝕、熱水浸泡等方法處理烏拉爾甘草種子，目的在于破除種子的硬實、對種子進(jìn)行消毒滅菌、提高發(fā)芽率和縮短萌發(fā)時間。濃硫酸處理和熱水浸泡甘草種子都有非常明顯的效果，濃硫酸處理甘草種子80 min后，種子的吸脹率、發(fā)芽勢、發(fā)芽率均比對照組和其他處理組有顯著性提高，而且幼苗子葉無灼傷，這與王秀英等[11]研究表明濃硫酸浸泡種子70 min后幼苗葉子出現(xiàn)灼傷的結(jié)果有所差別。濃硫酸處理可以腐蝕局部種皮、打破柵欄組織的屏障，使種殼變薄從而增大種皮的透水性，因此經(jīng)過濃硫酸處理的種子吸脹率極顯著提高。當(dāng)硬實種子種皮對胚生長的機(jī)械限制被打破后，種子就從休眠期轉(zhuǎn)變?yōu)槊劝l(fā)期。但濃硫酸浸泡120 min后的種子由于胚受到傷害，導(dǎo)致發(fā)芽率的降低。而且對于蟲害較嚴(yán)重但仍有萌發(fā)能力的種子，硫酸容易通過傷口進(jìn)入胚使這些種子喪失發(fā)芽能力。熱水處理的甘草種子吸脹率、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、萌發(fā)指數(shù)與對照組差異顯著，隨著水溫升高，種子吸脹率升高。然而，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、萌發(fā)指數(shù)均逐漸下降。高溫燙種可以軟化種皮，除去種皮表層的油脂和蠟質(zhì)，提高種皮的透性和浸出種子內(nèi)發(fā)芽抑制物。但是100 ℃水可能會損傷胚及植物細(xì)胞，導(dǎo)致種子失去活力、發(fā)芽率相對較低。采用60 ℃熱水浸泡種子雖然種皮軟化效果不及其他處理效果好，但是對種子的傷害少，因而發(fā)芽率、發(fā)芽勢顯著高于其他熱水處理組與對照組。這與王彥芹[12]等研究的溫湯甘草種子發(fā)芽率為零存在差異。

60 ℃熱水處理與濃硫酸處理80 min的種子萌發(fā)效果比較，后者在組織培養(yǎng)條件下解除甘草種子休眠并獲得無菌苗效果更好，濃硫酸處理不僅能促進(jìn)種子萌發(fā)，也能達(dá)到良好的消毒效果。但由于濃硫酸處理種子需嚴(yán)格把控時間、處理后沖洗不夠徹底易造成酸害且操作相對危險，因此也可選用60℃熱水浸泡配合3%次氯酸鈉溶液消毒15 min進(jìn)行組織培養(yǎng)種子的無菌萌發(fā)實驗。

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StudiesonSeedDormancyBreakingofGlycyrrhizauralensisinTissueCultureConditions

LIANG Xiaowei1,2，MeiLingfeng1,2，ZHANGChunrong1,2*，TANGXiaomin1,2，CHENGXuanxuan1,2，YANGQuan1，2，3*

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicines，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China；2.KeyLaboratoryofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicineforProduction&DevelopmentofCantoneseMedicinalMaterials,Guangzhou510006,China；3.StateKeyLaboratoryofDao-diHerbs，NationalResourceCenterofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Objective：TheGlycyrrhizauralensisseeds are difficult to germinate in tissue culture conditions for its hardness and waxiness.Many methods were used to improve the germination rate and disinfection effect ofG.uralensisseeds in tissue culture.Methods：TheG.uralensisseeds were treated by 98% H2SO4，hot sterile distilled water or sodium hypochlorite solutions，and then cultured on MS medium to investigate the germination rates and disinfection effects.Results：The water absorption rate was 40% and the germination rate was 10% when theG.uralensisseeds were soaked in water at room temperature before cultured on MS medium.However，the water absorption rates reached to 100%，42.16% and 46.7%，and the germination rate reached to 77.79%，36.67% and 24.44%，respectively，when theG.uralensisseeds were treated by 98% H2SO4for 80 min，60 ℃ water for 24 h(naturally cooled down to room temperature)and 3% sodium hypochlorite.TheG.uralensisseeds could be disinfected by 98% H2SO4and sodium hypochlorite solutions.Conclusion：To improve the germination ratesofG.uralensisseeds in tissue culture，the seeds could be treated by 98% H2SO4for 80 min or by 60 ℃ water for 24 h(naturally cooled down to room temperature)followed by 3% sodium hypochlorite surface-sterilization for 15 min.

GlycyrrhizauralensisFisch.；seed germination；tissue culture

2015-12-02)

國家自然科學(xué)基金項目(811173488)；中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201207002)；中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所項目(2011ZDXK-01)；中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心項目(KFKT20123005)；廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研項目(20142090)

*

張春榮，講師，研究方向：分子生藥學(xué)；Tel：(020)39352176，Email：zhangchunr@21cn.com； 楊全，教授，研究方向：中藥資源開發(fā)；Tel：(020)39352353，Email：yangquan7208@vip.163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.019