糙枝金絲桃藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究△

郭炬亮，倪國柱，朱丹丹，熱娜·卡斯木

(新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054)

·基礎(chǔ)研究·

糙枝金絲桃藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究△

郭炬亮，倪國柱，朱丹丹，熱娜·卡斯木*

(新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054)

目的：建立糙枝金絲桃藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為該藥的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。方法：進(jìn)行生藥學(xué)研究，測(cè)定水分、灰分，薄層色譜鑒別，HPLC測(cè)定金絲桃苷的含量。結(jié)果：對(duì)糙枝金絲桃藥材的性狀、顯微特征進(jìn)行描述；供試品TLC色譜可顯出金絲桃苷和蘆丁的斑點(diǎn)，金絲桃苷的平均含量為0.424%。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果可作為糙枝金絲桃藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

糙枝金絲桃；顯微鑒別；薄層色譜；金絲桃苷；HPLC

糙枝金絲桃HypericumscabrumL.是藤黃科(Guttiferae)金絲桃屬(HypericumL.)植物，又名腺點(diǎn)金絲桃[1]，多年生草本或半灌木，全草入藥，為哈薩克族習(xí)用藥材；生于海拔1100 m左右的干旱多石山坡或礫質(zhì)坡地上，國內(nèi)僅分布于新疆阿爾泰；前蘇聯(lián)及中亞地區(qū)也有分布。糙枝金絲桃性辛、涼，具有清熱解毒、消腫散瘀、收斂止血等功效，用于風(fēng)濕性腰痛、癤腫、肝炎、蛇咬傷等[2]。其主要化學(xué)成分有二蒽酮類的金絲桃素(Hypericin) 和偽金絲桃素(Pseudo hypericin)、黃酮類的金絲桃苷(Hyperin)和蘆丁(Rutin)、間苯三酚類化合物hyperibone A～I(xiàn)、揮發(fā)油α-蒎烯(α-pinene)等[3-4]等。僅收載于《哈薩克藥志》(第一卷)，只對(duì)其來源、性狀及功能主治等進(jìn)行了簡要描述，沒有具體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，目前亦未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)糙枝金絲桃藥材的性狀、顯微特征進(jìn)行了分析，并建立了其指標(biāo)性成分金絲桃苷的薄層鑒別及HPLC含量測(cè)定的方法[5-10]，為建立糙枝金絲桃藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(日本島津，LC-20AB泵，SPD-20A紫外雙波長檢測(cè)器，Lcsolution色譜工作站)；LINOMAT5半自動(dòng)點(diǎn)樣儀(CAMAG)，REPROSTAR 3薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(CAMAG)，AG135 TOLEDO分析天平(METTLER d=0.1 mg)、SK2510HP超聲儀(上?？岂R)、DMEX30生物顯微鏡(寧波舜宇 )。

1.2 材料

金絲桃苷(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111521-200303)；蘆丁對(duì)照品(上海原生生物科技有限公司，批號(hào)：20120226)，糙枝金絲桃藥材共10批，收集于新疆，由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達(dá)·阿不力孜教授鑒定為藤黃科植物糙枝金絲桃HypericumscabrumL.。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

本品莖呈圓柱形，長20～40 cm，多分支，莖及分枝兩側(cè)各有一條縱棱，葉無柄或近無柄，披針形或長圓狀線形，全面散布單色腺點(diǎn)。莖上的葉卵狀長圓形或長圓形，長1.3～1.7 cm，寬0.3～0.5 cm。稠密的傘房花序，花黃色，花瓣、花萼各5片，卵狀長圓形。氣微，味微苦、澀。

2.2 顯微結(jié)構(gòu)

2.2.1 莖橫切面 木栓層為數(shù)列細(xì)胞，栓內(nèi)層窄；韌皮部細(xì)胞排列緊密；木質(zhì)部射線寬廣；導(dǎo)管單個(gè)散在或數(shù)個(gè)聚集，1～2列徑向排列成放射狀。見圖1。

2.2.2 粉末顯微鑒別 粉末為淡綠色或黃綠色[11]，具單細(xì)胞非腺毛，壁厚，長191.80～460.46 μm，直徑14.80～40.15 μm。纖維多單個(gè)散在，壁厚，胞腔狹窄，長32.51～396.68 μm，直徑7.76～34.64 μm。油細(xì)胞為棕黃色，多聚集，直徑36.94～245.33 μm。螺紋導(dǎo)管長45.06～211.09 μm，直徑10.21～52.31 μm?；ǚ哿６鄦蝹€(gè)存在，直徑31.20～48.16 μm。粉末氣孔多為單個(gè)，副衛(wèi)細(xì)胞破損。葉表皮觀察發(fā)現(xiàn)氣孔多為不定式，副衛(wèi)細(xì)胞多有3個(gè)，少有4個(gè)。見圖2。

注：1.葉表皮(氣孔)；2.螺紋導(dǎo)管；3.具緣紋孔導(dǎo)管；4.油室；5.纖維；6.花粉粒；7.花絲表皮細(xì)胞；8.木薄壁細(xì)胞。圖2 糙枝金絲桃藥材粉末顯微結(jié)構(gòu)

2.3 薄層色譜鑒別

稱取藥材1 g置于圓底燒瓶，加甲醇100 mL，超聲回流10 min(20 ℃、50 Hz)提取，過濾后，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1～2 mL，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，于水浴鍋上蒸干(40 ℃)，晾干后加甲醇10 mL溶解即得甲醇供試液。分別精密稱取金絲桃苷對(duì)照品、蘆丁對(duì)照品各適量，加甲醇溶解并定容，制成0.5 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。分別吸取3 μL甲醇供試品溶液、5 μL對(duì)照品溶液，點(diǎn)于同一張薄層板上[12]，乙酸乙酯-丙酮-甲醇-水(5∶2∶0.5∶0.5)展開，取出，晾干，噴以5%AlCl3無水乙醇溶液顯色劑，于紫外燈366 nm下檢視，結(jié)果見圖3。

注：A.蘆丁；B.金絲桃苷。圖3 10批糙枝金絲桃藥材中蘆丁和金絲桃苷的薄層鑒別圖

2.4 金絲桃苷的HPLC含量測(cè)定

2.4.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取金絲桃苷對(duì)照品約20 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液，其濃度為2.0 mg·mL-1，備用。

2.4.2 供試品溶液的制備 精密稱定糙枝金絲桃藥材0.2 g，粉碎，過60目篩，置錐形瓶中，精密加入10 mL 70%乙醇，稱定重量，水浴中(95 ℃)回流30 min，取出，放冷，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4.3 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 Sunfire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(15∶85)洗脫；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長：360 nm；進(jìn)樣量：10 μL。取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入HPLC色譜儀，記錄色譜圖(見圖4)，結(jié)果表明在此色譜條件下[13-16]，金絲桃苷對(duì)照品、糙枝金絲桃樣品分離度都大于1.5，理論塔板數(shù)都大于4000，拖尾因子小于2.0。

注：A.供試品，B.金絲桃苷。圖4 糙枝金絲桃藥材和對(duì)照品的HPLC圖

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品貯備液適量，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液0.010 085、0.020 17、0.040 34、0.060 51、0.080 68、0.100 85 mg·mL-1，精密吸取上述6種溶液各10 μL，分別進(jìn)樣，以對(duì)照品質(zhì)量濃度X(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=20 871 000X+2 510.6(r=0.999 9)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明金絲桃苷對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度在0.010 085～0.100 85 mg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得金絲桃苷含量的日內(nèi)RSD;再連續(xù)進(jìn)樣5 d，測(cè)得金絲桃苷含量的日間RSD。結(jié)果日內(nèi)RSD=1.4%，日間RSD=1.5%。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一供試品溶液在0、2、4、6、8、12、24、48 h分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果48 h內(nèi)金絲桃苷色譜峰面積無明顯變化，RSD=1.6%，表明被測(cè)樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品0.2 g，6份，按供試品溶液的制備法制備并進(jìn)樣測(cè)定，糙枝金絲桃藥材中金絲桃苷的平均含量為0.33%，RSD=1.5%。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品(批號(hào)：20120325)約0.3 g，共9份，分為3組，按低、中、高濃度分別加入金絲桃苷對(duì)照品儲(chǔ)備液(2.017 mg·mL-1)0.1、0.15、0.2 mL，按2.4.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 糙枝金絲桃藥材中金絲桃苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.4.9 樣品測(cè)定 取收集的10批不同產(chǎn)地的樣品，每批樣品取2份進(jìn)行測(cè)定，按供試品溶液制備法進(jìn)行樣品處理并測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 10批糙枝金絲桃樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中考察薄層鑒別時(shí)，分別以3種展開系統(tǒng)展開，①乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)，②乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(5∶5∶1∶1)，③乙酸乙酯-丙酮-甲醇-水(5∶2∶0.5∶0.5)。結(jié)果表明以乙酸乙酯-丙酮-甲醇-水(5∶2∶0.5∶0.5)為展開系統(tǒng)，金絲絲桃苷、蘆丁斑點(diǎn)清晰，分離效果較好。

綜上所述，通過對(duì)糙枝金絲桃藥材性狀、顯微、薄層色譜和指標(biāo)性成分的定性和定量分析，能較好地控制藥材的質(zhì)量。建議糙枝金絲桃藥材各項(xiàng)指標(biāo)可控制在如下范圍內(nèi):薄層層析應(yīng)檢出金絲桃苷和蘆丁；本品按干燥品計(jì)算，含金絲桃苷(C21H20O12)量不低于0.10%。

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StudyonQualitySpecificationofHypericumscabrumL.

GUOJuliang，NIGuozhu，ZUDandan，RENAKasimu*

(PharmacyCollegeofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830054，China)

Objective：To provide scientific basis for the utilization and development ofHypericumscabrumL.by setting up the quality specification ofH.scabrum.Methods：The pharmacognositical methods were applied.Moisture and ash were determined，and the constituents were analyzed by thin layer chromatography (TLC).The content of hyperin was determined by HPLC.Results：The morphological，histological characters ofH.scabrumwere observed.The developed TLC spots were quite clear.And spots obtained with the given samples all corresponded in position and color to the spot obtained with the reference hyperin and rutin in the chromatogram.The average content of hyperin was 0.424%.Conclusion：All these data mentioned above can be used as the standards for evaluating quality ofH.scabrum.

HypericumscabrumL.；microscopical identification；TLC；hyperin；HPLC

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.11.017

2016-01-15)

新疆維吾爾自治區(qū)科技重大專項(xiàng)(201130105-2)

*

熱娜·卡斯木，博士，教授，研究方向：天然藥物化學(xué)；E-mail：renakasimu@vip.sina.com