龍膽瀉肝片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張紅玉，胡松謀，劉劍，王繼陳

(云南云河藥業(yè)股份有限公司，云南 個(gè)舊 661000)

龍膽瀉肝片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張紅玉，胡松謀*，劉劍，王繼陳

(云南云河藥業(yè)股份有限公司，云南 個(gè)舊661000)

目的：建立龍膽瀉肝片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用顯微鑒別法對(duì)龍膽、黃芩進(jìn)行定性鑒別；采用薄層色譜法對(duì)龍膽、梔子進(jìn)行定性鑒別；采用HPLC測定龍膽中龍膽苦苷的含量。結(jié)果：顯微鑒別特征明顯；薄層色譜斑點(diǎn)清晰；龍膽苦苷在0.1048～0.6288μg呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r>0.999；加樣回收率為100.4%(n=6)。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠，可行性及重復(fù)性好，可用于龍膽瀉肝片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制。

龍膽瀉肝片；顯微鑒別；薄層色譜；高效液相色譜；龍膽苦苷；梔子苷

龍膽瀉肝片由龍膽、柴胡、黃芩、梔子(炒)、澤瀉、木通、車前子(鹽炒)、當(dāng)歸(酒炒)、地黃、甘草(蜜炙)10味中藥組成，清肝膽、利濕熱，用于肝膽濕熱、頭暈?zāi)砍唷⒍Q耳聾、耳腫疼痛、脅痛、口苦、尿赤澀痛、濕熱帶下等。該制劑中的龍膽清熱燥濕、瀉肝膽火，為方中君藥；梔子瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒，黃芩清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎，同為方中臣藥。為了更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量，保證臨床用藥安全，采用顯微鑒別法對(duì)龍膽、黃芩進(jìn)行定性鑒別；采用薄層色譜法對(duì)龍膽、梔子進(jìn)行定性鑒別；采用HPLC測定龍膽中龍膽苦苷的含量。

1 儀器和試藥

1.1儀器

Agilent1100型高效液相色譜儀；賽多利斯電子天平(BP211D)；XSP-44X.9三目生物顯微鏡(上海光學(xué)儀器一廠)。

1.2試藥

龍膽苦苷對(duì)照品、梔子苷對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110770-200712，110749-200309，含量測定用)；龍膽瀉肝片(云南云河藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為中試01、中試02、中試03)；甲醇(色譜純，J.T.Baker)。

2 方中龍膽、黃芩的顯微特征鑒別

龍膽外皮層細(xì)胞表面觀紡錘型，每個(gè)細(xì)胞由橫壁分隔成數(shù)個(gè)小細(xì)胞。黃芩韌皮纖維淡黃色，梭形，壁厚，孔溝細(xì)[1]。見圖1。

注：A.黃芩；B.龍膽。圖1 龍膽瀉肝片顯微特征圖

注：1.龍膽瀉肝片樣品(云河：中試01)；2.龍膽瀉肝片樣品(云河：中試02)；3.龍膽瀉肝片樣品(云河：中試03)；4.龍膽苦苷、梔子苷；5.陰性樣品(缺龍膽、梔子)。圖2 龍膽瀉肝片中龍膽、梔子薄層鑒別的二次展開色譜圖

3 薄層色譜鑒別

梔子、龍膽的薄層色譜鑒別[3]：取本品10片(薄膜衣片除去薄膜衣)，研細(xì)，加乙醇30mL，超聲(功率為250W，頻率為33kHz)處理30min，濾過，濾液濃縮成約1mL，加在中性氧化鋁柱(120目，2g，內(nèi)徑1.5cm)上，用乙醇洗脫至洗脫液無色，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使其溶解，作為供試品溶液。另取梔子苷、龍膽苦苷對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為4mg·mL-1的梔子苷對(duì)照品溶液和質(zhì)量濃度為1mg·mL-1的龍膽苦苷對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水(30∶10∶3)的下層溶液為展開劑，二次展開，取出，晾干，置紫外光燈(254nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。按處方中各味藥的比例取不含龍膽、梔子的群藥，按制備工藝制備陰性樣品后，按供試品溶液的制備方法制成陰性溶液。本法經(jīng)三批樣品試驗(yàn)觀察，陰性對(duì)照未見干擾。見圖2。

4 HPLC測定龍膽中龍膽苦苷的含量

4.1色譜條件

AgilentC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；以甲醇-水(22∶78)為流動(dòng)相[2-4]；檢測波長為270nm；流速為1mL·min-1；進(jìn)樣量為10μL；理論板數(shù)按龍膽苦苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

4.2對(duì)照品溶液的制備

取龍膽苦苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為50μg·mL-1的溶液，即得。

4.3供試品溶液的制備

取本品(薄膜衣片除去薄膜衣)研細(xì)，精密稱取0.5g，置50mL量瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定重量，超聲處理(功率為250W，頻率為33kHz)45min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

4.4陰性溶液的制備

按處方中各味藥的比例取不含龍膽的群藥，按制備工藝制備陰性樣品后，按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

4.5專屬性試驗(yàn)

取按龍膽瀉肝片生產(chǎn)工藝制成缺龍膽的陰性樣品0.5g，按4.3項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照液，按4.1項(xiàng)下方法測定，結(jié)果在與龍膽苦苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的保留時(shí)間處，供試品溶液色譜圖中有吸收峰，而陰性對(duì)照色譜圖中未顯吸收峰，可見溶劑對(duì)主成分無干擾，說明本法專屬性強(qiáng)。見圖3。

注：A.龍膽苦苷對(duì)照品；B.龍膽瀉肝片樣品；C.龍膽瀉肝片缺龍膽陰性樣品。圖3 龍膽瀉肝片液相色譜圖

4.6線性關(guān)系考察

取對(duì)照品溶液，在按4.1項(xiàng)下的色譜條件，分別精密量取2、4、6、8、10、12μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以進(jìn)樣量對(duì)峰面積進(jìn)行回歸。采用的HPLC法測定龍膽瀉肝片中龍膽苦苷在0.104 8～0.628 8μg呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.968 658 624+1 246.154 59X,相關(guān)系數(shù)r>0.999。

4.7精密度考察

取龍膽苦苷對(duì)照品溶液，按4.1項(xiàng)下的色譜條件測定，平行操作6次，記錄峰面積，結(jié)果龍膽苦苷的RSD為0.38%，表明精密度良好。

4.8重復(fù)性考察

取同一批樣品(批號(hào)為：中試01)分別制備6份供試品溶液，按4.1項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，測定結(jié)果龍膽苦苷的含量分別為1.728、1.730、1.729、1.729、1.727、1.732mg/片，RSD為0.01%，表明該方法重復(fù)性良好。

4.9穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品(批號(hào)為：中試01)供試液，分別于0、4、8、12、24h進(jìn)行測定，記錄峰面積，測定結(jié)果龍膽苦苷的含量分別為1.727、1.726、1.728、1.728、1.726，RSD為0.06%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

4.10加樣回收率試驗(yàn)

取同一批樣品(批號(hào)為：中試01，已知樣品中龍膽苦苷的含量為4.2216mg·g-1)，研細(xì)，取6份，每份約0.25g，精密稱定，分別置50mL量瓶中，分別加入龍膽苦苷對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為0.1264mg·mL-1)5mL，按供試品溶液制備方法制備后，精密吸取10μL，注入液相色譜儀，測定，計(jì)算回收率，即得，測定結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)

結(jié)果表明，龍膽苦苷的回收率均在99.84～102.42%，其他成分對(duì)測定無干擾，方法可行。

4.11樣品測定

取龍膽瀉肝片(批號(hào)為：中試01、中試02、中試03)，按4.3項(xiàng)下條件制備樣品溶液，按4.1項(xiàng)下色譜條件測定龍膽苦苷的含量，以外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果均為1.73mg/片。

5 討論

方中木通薄層色譜鑒別方法[5]，因其化學(xué)成分為莖枝含木通苷，木通苷極易水解得常春藤皂苷元、齊墩果酸、葡萄糖和鼠李糖，根據(jù)其化學(xué)成分，用齊墩果酸對(duì)照品、常春藤皂苷元對(duì)照品作對(duì)照，對(duì)其鑒別進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，龍膽瀉肝片由10味中藥組成，成分復(fù)雜，干擾成分多。在鑒別木通中齊墩果酸時(shí)，陰性有干擾，經(jīng)文獻(xiàn)查閱得知，車前子化學(xué)成分中含有熊果酸和齊墩果酸，同屬三萜酸同分異構(gòu)體，性質(zhì)與化學(xué)結(jié)構(gòu)較為相似，用TLC法鑒別時(shí)很難將其分開，二者相互干擾。按《中華人民共和國藥典》2010版一部木通藥材項(xiàng)下的方法鑒別常春藤皂苷元時(shí)，供試品背景顏色深，斑點(diǎn)層次模糊。采用過大孔樹脂柱、中性氧化鋁柱等洗脫處理，除去了背景顏色，但斑點(diǎn)模糊，陰性有干擾，專屬性差，因此未將其列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案正文。

最大吸收波長的選擇：取龍膽苦苷對(duì)照品，加甲醇使其溶解，制成龍膽苦苷對(duì)照品溶液，分別在200～400nm做紫外掃描，從紫外光譜圖可以看出，在270nm處龍膽苦苷有較大吸收值，故選擇檢測波長為270nm。

龍膽苦苷、梔子苷的薄層鑒別中，由于成份復(fù)雜，較難分離，經(jīng)過大量研究，最終確定用高效薄層板，以同一展開劑，展開2次的方法進(jìn)行分離，得到的結(jié)果較理想。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑：第十二冊[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1997.

[2] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S]北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[3] 劉穎，胡琴，陶志國.龍膽瀉肝顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中成藥，2013,35(12)：2661-2666.

[4] 許仲，葉勝體，張妥.高效液相色譜法測定龍膽瀉肝湯顆粒中龍膽苦苷含量[J].中國藥業(yè)，2012，4(21)：54-55.

[5] 劉衛(wèi)國.木通中齊墩果酸含量及其指紋圖譜研究[D].成都：四川工業(yè)大學(xué)，2005.

QualityStandardforLongdanXieganTablets

ZHANGHongyu,HUSongmou*,LIUJian,WANGJichen

(YunnanYunhePharmaceuticalCo.，Ltd，YunnanGejiu661000，China)

Objective：To establish a quality standard for Longdan Xiegan Tablets.Methods：Microscopic identification was used by qualitative identification ofGentianascabraBge andScutellariabaicalensisGeorgi; TLC was used for qualitative identification ofG.scabraandGardeniajasminoidesEllis; HPLC was used for the determination of gentiopicrin ofG.scabra.Results：Microscopic identification showed obvious characteristics，TLC spots were clear; the linear ranges of gentiopicrin was0.1048～0.6288μg (r>0.999).Rate of recovery was100.4%(n=6).Conclusion：The method is accurate reliable and reproducible and can be used for quality control of Longdan Xiegan Tablets.

Longdan Xiegan Tablets；microscopic identification；TLC；HPLC；gentiopicrin；geniposide

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.024

2015-08-05)

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胡松謀，主任藥師，研究方向：中成藥開發(fā)與研究；Tel：(0873)2122589，E-mail：393153902@qq.com