半夏曲發(fā)酵過程化學(xué)成分的HPLC特征指紋圖譜分析△

張超，盧一，范潤勇，蘭澤倫，黃勤挽*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 611137；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術(shù)重點實驗室，成都 611731)

半夏曲發(fā)酵過程化學(xué)成分的HPLC特征指紋圖譜分析△

張超1，盧一1，范潤勇1，蘭澤倫2，黃勤挽1*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都611137；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術(shù)重點實驗室，成都611731)

目的：對半夏曲自然發(fā)酵過程化學(xué)成分的HPLC特征指紋圖譜進行研究，為半夏曲的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。方法：采用HPLC梯度洗脫，建立半夏曲不同發(fā)酵過程的特征指紋圖譜，運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004(A版)”進行分析。結(jié)果：HPLC指紋圖譜方法學(xué)考察中RSD均<3.0%，符合相關(guān)規(guī)定；指認(rèn)了鳥苷、肌苷和腺苷3個特征峰。在發(fā)酵過程中，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，19號色譜峰所代表的化合物均存在；11，12，13，14，16，17，18號色譜峰所代表的化合物則是因為發(fā)酵而新產(chǎn)生的7個化合物，且11,12,13,14號色譜峰的相對峰面積非常明顯，反應(yīng)其成分含量較高。結(jié)論：半夏曲發(fā)酵過程特征指紋圖譜的研究可在一定程度上揭示其物質(zhì)基礎(chǔ)的變化，為進一步研究半夏曲的物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

半夏曲；HPLC；指紋圖譜；發(fā)酵

半夏曲由天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.) Breit.的炮制品清半夏與姜汁、白礬等經(jīng)過發(fā)酵而成，具有降逆止嘔，止咳化痰的功效，臨床用于惡心嘔吐，食欲不振，咳嗽痰壅[1]。目前，以清半夏與姜汁、白礬等為發(fā)酵處方的半夏曲有關(guān)其發(fā)酵過程物質(zhì)基礎(chǔ)變化方面的研究未見報道。本實驗擬采用HPLC特征指紋圖譜技術(shù)[2-4]對半夏曲發(fā)酵過程物質(zhì)基礎(chǔ)變化進行研究，為進一步對半夏曲發(fā)酵過程及物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供借鑒。

1 材料

1.1儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜儀；AgilentZorbaxSB-AqC18(5μm，4.6mm×250mm，美國Agilent公司)；FW135型中草藥粉碎機(上海隆拓儀器設(shè)備有限公司)；DL-720D數(shù)控超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；RJ-TGL-16C型高速離心機(無錫瑞江分析儀器有限公司)；UPH-II-10T型優(yōu)普超純水器(成都超純科技有限公司)；RE2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；BS200S電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)。乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2樣品來源及制備

清半夏(四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號：D1310106)、白礬(四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號：1408090)、六神曲(四川輔正藥業(yè)股份有限公司，批號：150410)、面粉和生姜采購于附近農(nóng)貿(mào)市場；肌苷對照品(Lot：141013)、鳥苷對照品(Lot：140607)、腺苷對照品(Lot：140521)均購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司。在四川輔正藥業(yè)股份有限公司代為加工，按照前期預(yù)實驗結(jié)果，分5個時間節(jié)點(0%，25%，50%，75%，100%)取樣；其處方為清半夏160g，白礬10g，六神曲5g，生姜汁20g，面粉32g；加工工藝為取清半夏、白礬、六神曲粉碎成細(xì)粉；生姜榨汁加適量水，與面粉及上述細(xì)粉攪勻，制成軟硬適宜的小塊或顆粒，發(fā)酵至產(chǎn)生“黃衣”時[5]，取出，干燥，即得；發(fā)酵過程樣品詳細(xì)信息見表1。

表1 半夏曲發(fā)酵過程樣品

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：AgilentZorbaxSB-AqC18(5μm，4.6mm×250mm)；流動相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫，見表2；流速：1mL·min-1；檢測波長：270nm；進樣量：15μl；柱溫：30℃。

表2 流動相梯度洗脫條件表

2.2對照品溶液的制備

精密稱取肌苷、鳥苷和腺苷對照品適量，加50%甲醇定容至100mL量瓶中，配成0.02mg/mL的混合對照品溶液?；旌蠈φ掌飞V圖見圖1。

2.肌苷；3.鳥苷；4.腺苷圖1 核苷類混合對照品HPLC色譜圖

2.3供試品溶液的制備

取不同發(fā)酵時間節(jié)點的半夏曲樣品粉末(過40目篩)約2.5g，精密稱定，置100mL錐形瓶中，加甲醇25mL，稱定重量，超聲處理45min，放冷后，補足重量，濾過，揮干，殘渣用甲醇溶解，并定容至5mL容量瓶中，經(jīng)微孔濾膜(0.45μm)濾過，即得。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1空白實驗 精密吸取甲醇溶液15μL作為空白溶液，注入高效液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進行測定。結(jié)果表明，空白溶液對測定結(jié)果無干擾。

2.4.2 分析時間的確定 精密吸取供試品溶液15μL，注入高效液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進行分析，85min后繼續(xù)保持體積分?jǐn)?shù)45%乙腈洗脫60min，色譜圖顯示，保留時間85min后無色譜峰，因此確定每次進樣分析時間為85min。樣品色譜分析結(jié)果見圖2。

圖2 半夏曲發(fā)酵樣品HPLC色譜(S1)

2.4.3 精密度考察 精密吸取同一供試品溶液15μL，連續(xù)進樣6次，檢測指紋圖譜，結(jié)果表明各色譜峰的相對保留時間的RSD在0.11%～1.43%，各色譜峰的相對峰面積RSD在0.68%～1.97%，說明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品溶液15μL，分別在0h、2h、4h、8h、16h、24h不同時間點進樣，檢測指紋圖譜，結(jié)果表明各色譜峰的相對保留時間的RSD在0.93%～1.78%，各色譜峰的相對峰面積RSD在0.75%～2.24%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.4.5 重復(fù)性實驗 取同一樣品，照2.2實驗方法，平行制備6份供試品溶液，同時按照2.1色譜條件進行分析，檢測指紋圖譜，結(jié)果表明各色譜峰的相對保留時間的RSD在0.53%～1.65%，各色譜峰的相對峰面積RSD在1.05%～2.38%，表明該實驗方法重復(fù)性較好。

2.5HPLC特征指紋圖譜的分析

采用衛(wèi)生部藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004(A版)”對半夏曲發(fā)酵過程的樣品的色譜圖進行特征指紋圖譜分析，結(jié)果見表3和圖3。

表3 半夏曲發(fā)酵過程中各色譜峰情況

注：“√”表示檢出；“—”表示未檢出

2-肌苷；3-鳥苷；4-腺苷圖3 半夏曲發(fā)酵過程HPLC特征指紋圖譜(A)及對照圖譜(B)

由表3和圖3可知，半夏曲發(fā)酵過程樣品均含有肌苷(峰2)、鳥苷(峰3)、腺苷(峰4)3種核苷類成分的共有峰，從色譜峰的分離度和峰形來看，選擇鳥苷色譜峰(相對保留時間約為16.967 min)作為參照峰。以S5樣品(即發(fā)酵終點100%)為參照，進行特征指紋圖譜分析。實驗結(jié)果表明：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，19號色譜峰所代表的化合物在半夏曲發(fā)酵過程中均存在；11，12，13，14，16，17，18色譜峰均是在S4～S5(75%～100%)之間產(chǎn)生，且11，12，13，14號色譜峰的相對峰面積非常明顯，反映其成分含量較高。

3 討論

3.1提取溶劑、色譜條件的考察

本研究對提取溶劑、色譜柱、流動相和檢測波長進行了考察，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同色譜條件下，不同提取溶劑：水、甲醇、乙醇，以甲醇提取的樣品色譜峰數(shù)目較多，且分離度較好；AgilentZorbaxSB-AqC18柱分離色譜峰能力優(yōu)于GlobalC18柱；分別考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水3種流動相體系，結(jié)果表明乙腈-水洗脫系統(tǒng)所得的色譜峰較多且分離效果好；查閱有關(guān)半夏的文獻資料[3，4]，發(fā)現(xiàn)半夏炮制品中主要含強極性化合物，結(jié)合實驗分析，最終確定有機相流動相(乙腈)的變化范圍為0%～45%；通過DAD檢測器對樣品在200～400nm進行紫外波段掃描，從3D圖譜中發(fā)現(xiàn)在270nm色譜峰數(shù)目多，且其強度及分離效果較好。在本研究所建立的色譜條件下，半夏曲發(fā)酵過程不同時間節(jié)點樣品的化學(xué)成分分離效果良好，圖譜清晰，方法重復(fù)性良好、精密度較高，可用于反映半夏曲發(fā)酵過程的化學(xué)成分變化。

3.2半夏曲發(fā)酵過程HPLC特征指紋圖譜分析

本研究通過對半夏曲發(fā)酵過程特征指紋圖譜分析，在半夏曲發(fā)酵過程中1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，19號色譜峰所代表的化合物為半夏曲原料本身中所含有的化學(xué)成分，其中峰2，峰3和峰4所代表的核苷類化合物既是微生物生長與繁殖所必需的原料，也是其代謝產(chǎn)物，對于這3種核苷類化合物在自然發(fā)酵過程中的變化規(guī)律還有待進一步研究；而11，12，13，14，16，17，18色譜峰均是在S4～S5(75%～100%)之間產(chǎn)生，且11，12，13，14號色譜峰的峰面積非常明顯，反映其成分含量較高，這可能是在接近發(fā)酵終點(“黃衣”上遍)微生物代謝產(chǎn)物急劇增加，后期可通過LC-MS或其他分析手段對11，12，13，14號色譜峰(新產(chǎn)生的化合物)進行分離與結(jié)構(gòu)鑒定；可將其作為從化學(xué)成分方面對半夏曲發(fā)酵與否進行鑒別。

本實驗對半夏曲發(fā)酵過程的指紋圖譜研究的目的是為了揭示半夏曲在發(fā)酵過程中物質(zhì)基礎(chǔ)的變化，通過對發(fā)酵過程樣品的特征指紋圖譜分析，在一定程度上揭示了發(fā)酵對半夏曲物質(zhì)基礎(chǔ)變化規(guī)律，對進一步研究半夏曲的物質(zhì)基礎(chǔ)具有一定的參考意義。

[1] 衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑(第十冊)[S].北京：衛(wèi)生部出版，1995：49.

[2] 何曉燕，劉玉杰，黃永亮，等.檳榔炒制過程中不同炮制品的指紋圖譜分析[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19(17)：44-46.

[3] 楊冰月，李敏，施佳，等.半夏及其炮制品姜半夏HPLC特征指紋圖譜系統(tǒng)性研究[J].中草藥，2014，45(5)：652-658.

[4] 楊冰月，李敏，盧道會，等.半夏不同炮制品HPLC特征指紋圖譜的研究[J].中國藥學(xué)雜志，2014，49(11)：955-962.

[5] 王世宇，任振麗，傅超美，等.半夏曲發(fā)酵處方的篩選[J].華西藥學(xué)雜志，2009，24(4)：367-369.

HPLCCharacteristicFingerprintAnalysisofPinelliaeRhizomaFermentatainFermentingProcess

ZHANGChao1，LUYi1，F(xiàn)ANRunyong1，LANZelun2，HUANGQinwan1*

(1.ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，Chengdu611137，China2.KeyLaboratoryTCMprocessingofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine，Chengdu611731，China)

Objective：To establish HPLC characteristic fingerprint for different fermented products of Pinelliae Rhizoma Fermentata and provide reference for the research on material foundations.Methods：The HPLC fingerprints of different fermented products of Pinelliae Rhizoma Fermentata were established and analyzed with Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM (Version2004A).Results：RSD of methodological study in HPLC fingerprint were less than3.0%，which was correspond to related regulations；Three specific peaks were recognized as guanosine inosine and adenosine.12chemicals (peak1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，19) were always be detected during the fermentation，the more important，there were7new ingredients (peak11，12，13，14，16，17，18) in fermented processing，these seven new peaks increased rapidly，and there were4peaks(peak11,12,13,14),which relative peak areas were very obvious,and reflecting its high ingredients.Conclusion：The change of characteristic fingerprint could reveal that material foundation of Pinelliae Rhizoma Fermentata to a certain extent，which could provide a reference for further study on materials basis.

Pinelliae Rhizoma Fermentata；HPLC；fingerprint；fermentation

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.004

2016-03-01)

國家中醫(yī)藥管理局2015年公益性行業(yè)科研專項項目(201507004-12)

*

黃勤挽，副教授；研究方向：中藥炮制和藥劑研究；電話：028-61800231，E-mail：36190587@qq.com