風濕骨痛膠囊對炎性反應的影響

田瑜，黎云燕

(天津醫(yī)科大學 第二醫(yī)院 藥學部，天津 300211)

·基礎(chǔ)研究·

風濕骨痛膠囊對炎性反應的影響

田瑜1，黎云燕*

(天津醫(yī)科大學 第二醫(yī)院 藥學部，天津 300211)

目的：探究風濕骨痛膠囊對炎癥反應的影響。方法：給藥前將大鼠隨機分為空白對照組，風濕骨痛膠囊高、中、低劑量組，陽性對照組，將各組大鼠后肢右足跖皮下注射角叉菜膠，測量致炎大鼠足跖腫脹百分率。腹腔注射羧甲基纖維素鈉溶液，于顯微鏡下計洗出液白細胞總數(shù)。小鼠腹腔注射醋酸溶液，記錄第1次扭體反應的時間(即潛伏期)及10 min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應的次數(shù)。將小鼠放置于(55±0.5)℃的熱板上，測定痛閾值。結(jié)果：與模型組比較，風濕骨痛膠囊高、中、低劑量組隨著致炎時間的延長腫脹率均持續(xù)降低(P<0.05，P<0.01)，白細胞游走數(shù)顯著減少(P<0.01)。小鼠鎮(zhèn)痛潛伏期顯著延長(P<0.05)，扭體次數(shù)明顯減少(P<0.01)，小鼠痛閾值明顯提高(P<0.01)。結(jié)論：風濕骨痛膠囊對炎性反應具有良好的抑制作用。

風濕骨痛膠囊；抗炎；鎮(zhèn)痛；消腫

炎癥是機體為應對各種致炎因素侵犯所引起的自身防御反應，誘導血液中的白細胞和免疫因子向感染組織游走，聚集及吞噬，毛細血管通透性增加，引起炎癥組織周圍紅腫，疼痛和發(fā)熱[1]。風濕骨痛膠囊具有溫經(jīng)散寒、消腫止痛、通筋活絡等功效，由制川烏、制草烏、紅花、甘草、木瓜、烏梅、麻黃7種中藥配伍組成。本實驗通過動態(tài)監(jiān)測炎癥組織隨時間變化的發(fā)展趨勢及鎮(zhèn)痛藥理活性，探究風濕骨痛膠囊對炎性反應的干預作用，不僅有助于及早緩解炎癥反應，也為臨床藥物多樣性的選擇提供重要參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動物

Wistar雄性大鼠，體重180～220 g，二級標準；雌性昆明種小鼠，體重18～22 g，二級標準；均購自天津醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號：SCXK(津)2014-0012。動物室溫度：(22±3)℃，濕度：(67±5)%，通風良好，自然光照。

1.2 藥品與試劑

風濕骨痛膠囊(安徽精方藥業(yè)股份有限公司，批號：20140425)；地塞米松片(山西亨瑞達制藥有限公司，批號：20131205)；阿司匹林片(上海信誼藥業(yè)有限公司，批號：20131125)；角叉菜膠(上海恒遠生物科技有限公司，批號：0001306592)；以10%羧甲基纖維素鈉配制成混懸液，實驗劑量以顆粒表示。其他試劑有冰醋酸、0.9%氯化鈉溶液等。

1.3 儀器

BS110S電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；DM1000光學顯微鏡(北京萬泰恒通國際科貿(mào)有限公司)；YLS-7B足跖容積測量儀(上海欣曼科教設(shè)備有限公司)；BAT-2肛溫計(深圳市萬博儀器儀表有限公司)，RB-200智能熱板儀(成都泰盟科技有限公司)。

2 方法

2.1 大鼠角叉菜膠足跖腫脹實驗

取體重(200±20)g雄性Wistar大鼠50只，每組10只，將大鼠分為空白對照組，灌胃給予等體積0.9%氯化鈉溶液；地塞米松片組，灌胃給予0.019 g·kg-1；風濕骨痛膠囊高、中、低劑量組(分別灌服1.0、0.5、0.25 g·kg-1)。大鼠在造模前按上述劑量給藥，每日1次，連續(xù)給藥1周，末次灌胃30 min后，將每只大鼠后肢右足跖皮下注射1%角叉菜膠0.05 mL，分別測量1、2、4、6、8 h致炎前后大鼠足跖周長變化，計算得出腫脹率[2]。腫脹率(%)=(致炎后足跖周長-致炎前足跖周長)/致炎前足跖周長×100%。

2.2 大鼠腹腔白細胞游走實驗

取體重(200±20)g雄性Wistar大鼠50只，每組10只，將大鼠分為空白對照組(灌胃給予等體積0.9%氯化鈉溶液)；地塞米松片組(灌胃給予0.019 g·kg-1)；風濕骨痛膠囊高、中、低劑量組(分別灌服1.0、0.5、0.25 g·kg-1)。大鼠在造模前按上述劑量給藥，每日1次，連續(xù)灌胃2周后，腹腔注射1%羧甲基纖維素鈉溶液0.5 mL，3 h后處死大鼠，每鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液5 mL洗腹腔內(nèi)容物，輕揉腹部，抽取腹腔液滴于白細胞計數(shù)板上，以加滿白細胞計數(shù)板為準，靜置2～3 min，待白細胞下沉，在細胞計數(shù)板中央放置計數(shù)專用的蓋玻片，排除氣泡，置顯微鏡下計數(shù)四角大方格內(nèi)的白細胞總數(shù)。壓線的白細胞只計數(shù)在上線和左線者，對于細胞團按單個細胞計數(shù)[3]。在低倍鏡下，白細胞呈圓形、漿透亮、核呈紫黑色、稍有折光，借此特點可與雜質(zhì)相區(qū)別。白細胞懸液細胞數(shù)(個/mL)=(4大格細胞總數(shù)/4)×104×10。

2.3 風濕骨痛膠囊對醋酸所致小鼠腹痛的影響

取體重18～22 g健康小鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組，分為空白對照組(給予等體積0.9%氯化鈉溶液)；阿司匹林組(灌胃給予0.2 g·kg-1)；風濕骨痛膠囊高、中、低劑量組(分別灌胃給予1.4、0.70、0.35 g·kg-1)。每天灌胃1次，連續(xù)灌胃7 d。于末次給藥30 min后，每只鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL/只，記錄各組小鼠出現(xiàn)第1次扭體反應的時間(即潛伏期)及10 min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應的次數(shù)(腹部收縮內(nèi)凹、伸展后肢、臀部抬高、蠕行)[2]。鎮(zhèn)痛百分率(%)=(空白對照組小鼠扭體次數(shù)-給藥組小鼠扭體次數(shù))/空白對照組小鼠扭體次數(shù)×100%。

2.4 風濕骨痛膠囊對熱板法所致小鼠的鎮(zhèn)痛作用

取體重18～22g雌性小鼠放置于(55±0.5)℃的熱板上，測定2次(間隔30 min)，取均值作為給藥前痛閾值(小鼠自投入熱板儀至出現(xiàn)舔后足的時間)。2次中有1 次痛閾值5～30 s內(nèi)不出現(xiàn)疼痛反應(舔后足或逃避)者棄之不用。記錄符合要求的小鼠痛閾值；取符合要求的小鼠50只隨機分為5組，空白對照組給予等體積0.9%氯化鈉溶液；阿司匹林組灌胃給予0.2 g·kg-1；風濕骨痛膠囊高劑量組灌胃給予1.4 g·kg-1；風濕骨痛膠囊中劑量組灌胃給予0.70 g·kg-1；風濕骨痛膠囊低劑量組灌胃給予0.35 g·kg-1。每天灌胃1次，連續(xù)灌胃7 d，末次給藥分別測藥后0.5、l、1.5 h的痛閾值，若60 s內(nèi)不出現(xiàn)疼痛反應者，按60 s計算，不再繼續(xù)實驗，以免燙傷小鼠足掌，影響下次觀察[4]。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

3 結(jié)果

3.1 風濕骨痛膠囊對大鼠足趾腫脹率的影響

通過腫脹率公式計算大鼠足跖致炎后腫脹百分率。由表1所示，與空白對照組1 h比較，空白對照組各時間點大鼠足跖腫脹率隨時間延長呈持續(xù)性加重。與空白對照組各時間點比較，各給藥組大鼠足跖腫脹率隨時間延長顯著降低(P<0.05，P<0.01)，尤以6 h和8 h消腫明顯，且高劑量組療效最好。與地塞米松組比較，風濕骨痛膠囊高、中、低劑量組1 h差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，2、4 h差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，大鼠后足跖腫脹率遠高于地塞米松組，與地塞米松組6、8 h比較，風濕骨痛膠囊中、低劑量組仍持續(xù)顯著性升高(P<0.05)，但高劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 風濕骨痛膠囊對大鼠角叉菜膠足腫脹的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與1 h比較，#P<0.05，##P<0.01；與地塞米松組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；下同。

3.2 風濕骨痛膠囊對大鼠腹腔白細胞游走的影響

如表2所示，與空白對照組比較，風濕骨痛膠囊各給藥組腹腔白細胞計數(shù)均有不同程度降低，尤以風濕骨痛膠囊中、高劑量組降低顯著(P<0.01)。與地塞米松組比較，風濕骨痛膠囊中、低劑量組白細胞數(shù)顯著性升高(P<0.01，P<0.05)，風濕骨痛膠囊高劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3.3 風濕骨痛膠囊對醋酸致痛小鼠的鎮(zhèn)痛作用

如表3所示，與空白對照組比較，風濕骨痛膠囊高、中、低劑量組及阿司匹林組疼痛潛伏期均顯著性延長，扭體次數(shù)隨給藥劑量增加呈劑量依賴性減少(P<0.05，P<0.01)，鎮(zhèn)痛百分率依次升高。與阿司匹林組比較，風濕骨痛膠囊中、低劑量組潛伏期差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，風濕骨痛膠囊高劑量組潛伏期明顯延長(P<0.05)，扭體次數(shù)均顯著增多(P<0.05，P<0.01)。

3.4 風濕骨痛膠囊對熱板法所致小鼠的鎮(zhèn)痛作用

如表4所示，與空白對照組比較，風濕骨痛膠囊高、中、低劑量組的痛閾值顯著性升高，且具有劑量依賴性(P<0.01)，0.5 h即出現(xiàn)鎮(zhèn)痛作用，在1 h產(chǎn)生最大鎮(zhèn)痛效果。與阿司匹林組比較，風濕骨痛膠囊高、中、低劑量組0.5、1、1.5 h痛閾值呈劑量依賴性升高，其中高、中劑量組1 h和高劑量組1.5 h痛閾值顯著性升高(P<0.01，P<0.05)，高、中劑量組0.5 h痛閾值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 風濕骨痛膠囊對大鼠腹腔白細胞游走的影響

表3 風濕骨痛膠囊對醋酸致痛小鼠的鎮(zhèn)痛作用

注：與阿司匹林組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；下同。

表4 風濕骨痛膠囊對熱板法所致小鼠的鎮(zhèn)痛作用

4 討論

炎性介質(zhì)是炎性反應的最主要因素，炎性介質(zhì)主要分為細胞源性炎性介質(zhì)和體液源性炎性介質(zhì)[5]。這些介質(zhì)共同作用，促進炎癥發(fā)展。炎癥的發(fā)展大致分為3個期：即以時間短暫、局部血管擴張和毛細血管通透性增加為特征的急性期，以白細胞和吞噬細胞浸潤為特征的亞急性期以及以組織變性和纖維化為特征的慢性增殖期[6]。本實驗結(jié)果顯示采用角叉菜膠致炎1、2、4、6、8 h后，發(fā)炎程度呈波動式變化，1～4 h大鼠足跖腫脹逐漸增大，4～8 h腫脹逐漸減弱，大鼠足跖在4 h腫脹率達最大，此結(jié)果與陳蘭英等[7]得出在5 h腫脹率達最大的結(jié)果較為接近。另有實驗證實角叉菜膠致炎后大鼠足跖表現(xiàn)為水腫、疼痛過敏、形成紅斑，并導致一些促炎因子如緩激肽、組胺、補體、活性氧以及一些氮類物質(zhì)的釋放，嗜中性粒細胞很容易遷移到炎癥部位，并能產(chǎn)生促炎細胞活性氧和其他的炎癥反應，大約在5 h左右足腫脹程度達最大[8]。但另也有不同報道，潘志遠等[9]采用同樣方法造模后1～3 h小鼠足跖腫脹率顯著升高，為急性炎癥發(fā)展期，其中以3 h足跖腫脹率達最大，4～6 h后緩慢降低，屬緩慢消退期。實驗結(jié)果的差異可能與選擇不同品種的實驗動物對角叉菜膠的敏感性、耐受性以及機體自身防御機制不同有關(guān)。與模型組比較，風濕骨痛膠囊高、中、低劑量組在6 h和8 h均能顯著降低大鼠足跖腫脹率，且在不同時間點有不同的作用強度。與地塞米松組比較，風濕骨痛膠囊中、低劑量組對大鼠足趾腫脹療效弱于地塞米松組，但風濕骨痛膠囊高劑量組在4、6 h與地塞米松組無顯著差異，隨著治療時間延長腫脹率顯著降低。由細胞釋放或體液中產(chǎn)生的參與、介導炎癥反應得到的炎癥介質(zhì)，通過各種途徑作用于血管，使血管擴張、通透性增加，引起滲出，吸引白細胞到達炎癥部位，導致組織損傷，引起局部炎癥反應和全身反應[4]。羧甲基纖維素鈉建立的炎癥模型其發(fā)病機制為在血管活性胺或前列腺素等介質(zhì)參與下激活補體，吸引白細胞，白細胞脫顆粒，釋放血管通透因子，并使血小板聚集，導致血管炎，引起局部組織水腫[10]。本實驗將大鼠腹腔注射1%羧甲基纖維素鈉溶液，造模3 h后，風濕骨痛膠囊高、中、低劑量組對白細胞游走的抑制作用強度呈劑量依賴性，且高劑量組與地塞米松組對白細胞游走的抑制作用相近，提示其抑制組織腫脹和白細胞游走作用為該藥抗炎作用的主要機理。

風濕骨痛膠囊高、中、低劑量組均能延長小鼠的疼痛耐受期并減少醋酸所致小鼠的扭體次數(shù)，其鎮(zhèn)痛百分率與阿司匹林組接近。將小鼠置于熱板上，給藥后0.5 h即出現(xiàn)顯著的鎮(zhèn)痛作用，此時與阿司匹林組鎮(zhèn)痛作用無顯著差異，隨著給藥時間延長，鎮(zhèn)痛閾值明顯高于阿司匹林組，在1 h達到最強的鎮(zhèn)痛療效，風濕骨痛膠囊高劑量組鎮(zhèn)痛作用顯著。

從實驗結(jié)果可以得出風濕骨痛膠囊對炎癥的急性期及亞急性期均有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，通過預防性給藥可以更好地緩解炎性反應，抑制白細胞黏附聚集，減輕腫脹，緩解疼痛。通過與臨床常用鎮(zhèn)痛抗炎藥物的橫向比較，證實風濕骨痛膠囊對炎性反應的確切療效，這對于臨床患者長期服用非甾體鎮(zhèn)痛抗炎藥或激素類抗炎藥所產(chǎn)生的不能耐受的不良反應是一種很好的替代藥物。通過對風濕骨痛膠囊抗炎鎮(zhèn)痛作用隨時間動態(tài)變化的研究，可以初步反映中藥復方藥效的整體作用特點，但對于風濕骨痛膠囊何種有效成分發(fā)揮抗炎作用以及通過何種途徑發(fā)揮療效均需要對其進行深入研究。

[1] Subhashini N，Purnima S，Devi J A，et al.Anti-inflammatory activity of Erythrina stricta Roxb in albino rats[J].Int J PharmTech Res，2011，3(2)：1014-1018.

[2] 李光民，儲金秀，韓淑英.三七乳香合劑鎮(zhèn)痛抗炎作用的實驗研究[J].河北醫(yī)藥，2015，37(10)：1458-1460.

[3] 何迅，龐秀清，葉蘭，等.蓮菊感冒膠囊抗炎解熱發(fā)汗解表作用[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2011，31(10)：810-813.

[4] 楊延林.三黃皮炎膏鎮(zhèn)痛抗炎作用的實驗研究[J].河南中醫(yī)，2013，33(7)：1049-1050.

[5] 趙德明.獸醫(yī)病理學[M].2版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2005：133-157.

[6] 徐叔云，卞如廉，陳修.藥理實驗方法學[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：906.

[7] 陳蘭英，王昌芹，劉榮華，等.芍藥甘草湯對角叉菜膠誘導的炎癥相關(guān)指標時序性變化研究[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20(4)：115-119.

[8] Zheng Xu，Jiangrui Zhou，Jianmei Cai，et al.Anti-inflammation effects of hydrogen saline in LPS activated macrophages and carrageenan induced paw oedema[J].J Inflammation，2012，9：2.

[9] 潘志遠，汪海.膽堿和阿司匹林協(xié)同抗炎作用及其藥理學機制的研究[D].北京：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院，2014.

[10] 雷紅偉，陳曉菁，黃念芳，等.雷公藤雙層片對大鼠羧甲基纖維素囊滲出液白細胞游走的影響[J].江漢大學學報(自然科學版)，2004，32(2)：67-68.

EffectsofRheumatismBonePainCapsulaonInflammatoryReaction

TIANYu，LIYunyan*

(TheSecondAffiliatedHospitalofTianjinUniversityofMedical，Departmentofpharmacy，Tianjin300211，China)

Objective：To study the Rheumatism Bone Pain Capsula(RBPC)effects on inflammatory reactions.Methods：The rats were divided into the blank group，the high dose group，the middle dose group and the low dose group of RBPC，as well as the positive control group before administration.The rats were injected carrageenan solution to the hind limb right digiti pedis subcutaneous tissue，to measure phlogogenous voix pedis of rats respectively and to get swelling rates of voix pedis of rats.The rats were injected sodium carboxymethy cellulose solution at abdominal cavity，white cell was counted.The mouse were injected acetic acid solution to abdominal cavity，and recorded time of the first writhing response as well as writhing response frequency in ten minutes.The mouse was put on a(55±0.5)℃ hot plate and the thermal pain threshold was determined.Results：Compared with the model group，the high dosage，the middle dosage and the low dosage of RBPC groups of swelling rates of foot-ankle perimeter of rats to keep degrade through phlogogenous times extension.white cell transmigration counts of the high dosage and the middle dosage of RBPC groups were degrade remarkably(P<0.01).The mouse of the thermal pain threshold step up remarkably.Conclusion：RBPC has good inhibition effects on inflammatory reactions.

Rheumatism bone plain capsula；anti-inflammatory；paregoric；detumescence

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.008

2015-08-17)

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黎云燕，副主任藥師，研究方向：臨床藥理；E-mail：lyyan3366@163.com