角毛藻冷藏存儲(chǔ)最長(zhǎng)時(shí)間的探討

馬衛(wèi)敬，王慧嶺，陳 昱，劉敏勝

(新奧科技發(fā)展有限公司，煤基低碳能源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北廊坊 065000)

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角毛藻冷藏存儲(chǔ)最長(zhǎng)時(shí)間的探討

馬衛(wèi)敬，王慧嶺，陳 昱，劉敏勝*

(新奧科技發(fā)展有限公司，煤基低碳能源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北廊坊 065000)

采用離心后不同的低溫保存方式和添加新鮮培養(yǎng)基的方法，對(duì)角毛藻離心收集后儲(chǔ)存的最長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，添加新鮮培養(yǎng)基的儲(chǔ)存方法優(yōu)于直接添加藻液的方法，并且存儲(chǔ)時(shí)間長(zhǎng)；角毛藻在3 000 r/min或較低轉(zhuǎn)數(shù)離心后，藻泥可以添加新鮮培養(yǎng)基儲(chǔ)存于-2 ℃冰箱，至少儲(chǔ)存35 d，再培養(yǎng)不影響生長(zhǎng)。角毛藻儲(chǔ)存溫度越低，儲(chǔ)存時(shí)間就越長(zhǎng)，但要在角毛藻不結(jié)冰的情況下。此保藏方法可以應(yīng)用于角毛藻銷(xiāo)售中轉(zhuǎn)儲(chǔ)存。

角毛藻；離心；儲(chǔ)存；再培養(yǎng)

牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)為耐高溫單細(xì)胞藻類(lèi)，在正常情況下細(xì)胞長(zhǎng)3.7～8.7 μm，寬2.9～8.3 μm，角毛長(zhǎng)10.2～14.5 μm。色素體1個(gè)，呈黃褐色。細(xì)胞大多數(shù)單獨(dú)生活，有時(shí)也由2～3個(gè)集合而成短的群體。在泥蚶和牡蠣等貝類(lèi)育苗生產(chǎn)中，角毛藻作為鮑魚(yú)、貝類(lèi)等幼體的優(yōu)質(zhì)餌料，與其他單胞藻相比具有耐高溫、繁殖速度快、抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[1]，深受水產(chǎn)養(yǎng)殖者的歡迎。梁妍等[2]研究離心和冷藏對(duì)牟氏角毛藻再培養(yǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)4 ℃冷藏后的角毛藻常溫下再培養(yǎng)效果較差。低溫冷藏會(huì)影響藻細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，并且隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞再培養(yǎng)愈來(lái)愈困難。但是，在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，若保存時(shí)間過(guò)短會(huì)使藻變質(zhì)壞掉，最終導(dǎo)致資源浪費(fèi)。筆者探討了角毛藻冷藏存儲(chǔ)的最長(zhǎng)時(shí)間。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料試驗(yàn)所用角毛藻由新奧科技發(fā)展有限公司藻種庫(kù)提供。試驗(yàn)藻種在跑道池中養(yǎng)殖，達(dá)到一定產(chǎn)量后進(jìn)行收集。

1.2培養(yǎng)基配方角毛藻細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的配方參考文獻(xiàn)[3]。

1.3儀器與藥品

1.3.1儀器。冰箱(Electrolux)，型號(hào)BCD-271WFC；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，型號(hào)sigma3K15/1079；電子顯微鏡，型號(hào)Olympus CX31RTSF。

1.3.2藥品。除微量元素為500 g/瓶的分析純外，其他均為50 kg食品級(jí)營(yíng)養(yǎng)鹽。

1.4試驗(yàn)方法將培養(yǎng)的角毛藻4 000 r/min離心5 min后添加新鮮培養(yǎng)基，將獲得的藻液與藻泥同時(shí)儲(chǔ)存于4 ℃和-2 ℃冰箱中。冷凍儲(chǔ)存23 d后，在光照強(qiáng)度100 μmol/(m2·s)下進(jìn)行再培養(yǎng)。使用紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)750 nm處測(cè)定OD值。使用電子顯微鏡觀察不同條件儲(chǔ)存后的細(xì)胞形態(tài)。

2　結(jié)果與分析

不同存儲(chǔ)條件下藻泥再培養(yǎng)情況的對(duì)比如圖1所示。從圖2可以看出，-2 ℃下藻泥細(xì)胞邊緣模糊，細(xì)胞有破損(圖2A)；-2 ℃下藻泥添加培養(yǎng)基冷凍的角毛藻細(xì)胞邊緣清晰，細(xì)胞狀態(tài)正常(圖2B)。

注：A.接種前；B.培養(yǎng)3 d后。a.4 ℃下儲(chǔ)存的藻泥；b.4 ℃下儲(chǔ)存的藻液；c.-2 ℃儲(chǔ)存下的藻泥；d.-2 ℃下儲(chǔ)存的藻液。Note：A.Before inoculation；B.Culture for 3 d；a.Algae mud under -2 ℃；b.Algae liquid stored at 4 ℃；c.Algae mud under -2 ℃；d. Algae liquid stored at -2 ℃.圖1　不同存儲(chǔ)條件下藻泥再培養(yǎng)情況的對(duì)比Fig.1　Comparison of subculture situation of algae mud under different storage conditions

注：A.-2 ℃下儲(chǔ)存的藻泥；B.-2 ℃下儲(chǔ)存的藻液。Note：A.Algae mud under -2 ℃；B.Adding culture medium in algae mud and algae liquid stored at -2 ℃.圖2　-2 ℃下儲(chǔ)存的角毛藻細(xì)胞的鏡檢結(jié)果對(duì)比Fig.2　Comparison of algae cell microscopy under -2 ℃ storage condition

圖3　4 ℃下培養(yǎng)不同時(shí)間藻泥和藻液的OD值對(duì)比Fig.3　Comparison of OD values of algae mud and liquid cultured at 4 ℃ for different time periods

由表1可知，在樣品不同條件下儲(chǔ)存23 d后進(jìn)行再培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)4 ℃藻泥、4 ℃藻液、-2 ℃藻泥均死亡變臭，不能進(jìn)行再培養(yǎng)。結(jié)合冷凍試驗(yàn)結(jié)果可知，離心后藻液在4 ℃下儲(chǔ)存的時(shí)間約為15 d，20 d左右會(huì)出現(xiàn)異味，因此儲(chǔ)存23 d再培養(yǎng)時(shí)就會(huì)影響藻體生長(zhǎng)。但是，-2 ℃下儲(chǔ)存23 d后的藻

注：A.接種前；B.接種后。Note：A.Before inoculation；B.After inoculation. 圖4　角毛藻再培養(yǎng)生長(zhǎng)情況的對(duì)比Fig.4　Comparison of growth situation of C.muelleri subculture

液再培養(yǎng)不受影響。 雖然管式離心后的藻泥濃度較高，但不可以直接在冰箱中儲(chǔ)藏；離心后的藻泥可以添加少量的培養(yǎng)基儲(chǔ)存于-2 ℃冰箱中，儲(chǔ)存23 d也不影響藻品質(zhì)，儲(chǔ)存33 d后無(wú)異味，儲(chǔ)存35 d后出現(xiàn)少量異味，但不影響生長(zhǎng)；用幾批收集后直接出售的藻液在4 ℃冰箱中儲(chǔ)存6 d就已變臭，這是因?yàn)樵迥嘤迷逡合♂專(zhuān)⑶以诘?天鏡檢時(shí)發(fā)現(xiàn)有活躍的原生動(dòng)物，所以建議收集后的藻泥用藻稀釋?zhuān)@樣會(huì)延長(zhǎng)儲(chǔ)存時(shí)間。角毛藻只要不結(jié)冰，取出正常培養(yǎng)就不受影響。

表1　不同儲(chǔ)存條件下藻泥的再培養(yǎng)情況

3　結(jié)論

(1)角毛藻在一定轉(zhuǎn)數(shù)離心后，藻泥添加養(yǎng)殖的藻液在4 ℃下儲(chǔ)存2～3 d后出現(xiàn)異味。離心后的藻泥添加新鮮培養(yǎng)基后，儲(chǔ)存時(shí)間變長(zhǎng)，-2 ℃下可以?xún)?chǔ)存35 d。原藻液中含有原生動(dòng)物等容易變質(zhì)，離心后的藻泥因?yàn)榧?xì)菌數(shù)量減少變得不易引起變質(zhì)，添加的新鮮培養(yǎng)基中原生動(dòng)物較少，故在低溫下保存時(shí)間較長(zhǎng)。

(2)-2 ℃為介于-4～4℃之間，不易結(jié)冰，基本符合儲(chǔ)

存要求。角毛藻在不結(jié)冰的低溫條件下儲(chǔ)存后，基本不影響生長(zhǎng)。

(3)此儲(chǔ)存方法可以應(yīng)用于角毛藻銷(xiāo)售中轉(zhuǎn)儲(chǔ)存。

[1] 鄭忠明，金春華，馮堅(jiān).牟氏角毛藻的生產(chǎn)性培養(yǎng)技術(shù)[J].水產(chǎn)科學(xué)，2002,21(6)：20-21.

[2] 梁妍，鄒寧，潘曰磊，等.離心·冷藏對(duì)牟氏角毛藻再培養(yǎng)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(33)：14459-14460，144624.

[3] 鄒寧，李艷，孫東紅.幾種有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的微藻及其應(yīng)用[J].煙臺(tái)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，21(1)：59-63.

Discussion on the Longest Storage Time ofChaetocerosmuelleriunder Refrigeration Condition

MA Wei-jing, WANG Hui-ling, CHEN Yu, LIU Min-sheng*

(ENN Science and Technology Development Co., Ltd., State Key Laboratory of Coal Based Low Carbon Energy, Langfang, Hebei 065000)

After centrifugation, different low-temperature storage method and the method of adding fresh culture medium were applied to research the longest storage time ofChaetocerosmuelleri. Results showed that the storage method of adding fresh culture medium was superior to directly adding algae liquid. After algal biomass was centrifuged at speed of 3 000 r/min or lower speed, fresh medium was added into the sludge and stored at -2 ℃ in refrigerator for at least 35 d. Subculture did not affect the growth. The lower storage temperature ofC.muellerimade longer storage time under the condition of non-freezing. This storage method could be used for transitional storage in the sale ofC.muelleri.

Chaetocerosmuelleri;Centrifugation; Storage; Subculture

馬衛(wèi)敬(1983- )，女，河北邯鄲人，助理工程師，從事微藻養(yǎng)殖與光反應(yīng)器制造等方面的研究。*通訊作者，副研究員，從事微藻高效養(yǎng)殖和微藻規(guī)模化養(yǎng)殖研究。

2016-05-20

S 984.4

A

0517-6611(2016)18-144-02