鄭心,彭召云,,孟憲志,莊賀
1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,山東濟(jì)南 250001;2.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東濟(jì)南 250014
肺抑瘤膏對(duì)EGFR野生型Lewis肺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)及LC3表達(dá)的影響
鄭心1,彭召云1,2,孟憲志1,莊賀2
1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,山東濟(jì)南 250001;2.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東濟(jì)南 250014
目的 建立Lewis肺腺癌小鼠移植瘤模型,取移植瘤進(jìn)行EGFR基因測(cè)序,觀察肺抑瘤膏對(duì)移植瘤的干預(yù)作用。方法 使用C57BL/6小鼠,接種Lewis肺腺癌細(xì)胞,造模成功后,隨機(jī)分4組,生理鹽水對(duì)照組(組Ⅰ)、肺抑瘤膏組(組Ⅱ),3-MA組(組Ⅲ),Rap組(組Ⅳ),藥物干預(yù)后,觀察瘤重,并進(jìn)行電鏡、Western Blot檢測(cè)及EGFR基因測(cè)序。結(jié)果 EGFR基因測(cè)序示:非突變型。肺抑瘤膏可以明顯減輕移植瘤瘤重,組Ⅱ與生理鹽水對(duì)照組瘤重比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),組Ⅱ抑瘤率為25.22%;以自噬抑制劑3-MA、自噬誘導(dǎo)劑Rap作為對(duì)照分析,肺抑瘤膏組與3-MA組在瘤重、LC3/β-actin相對(duì)表達(dá)量?jī)煞矫姹容^,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而與Rap組在瘤重、LC3/β-actin相對(duì)表達(dá)量?jī)煞矫姹容^,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。電鏡提示肺抑瘤膏可影響腫瘤細(xì)胞自噬。結(jié)論 肺抑瘤膏能夠明顯抑制EGFR非基因突變型肺腺癌移植瘤的生長(zhǎng),且可能通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞自噬起到治療作用。
肺抑瘤膏;Lewis肺癌;EGFR非基因突變型;LC3
原發(fā)性支氣管肺癌現(xiàn)居全球癌癥首位[1],其中,肺腺癌占肺癌發(fā)病率的25%左右[2],其確診時(shí)絕大多數(shù)已屬中晚期,化療耐藥、放療抵抗等問(wèn)題的存在[3-4],應(yīng)用單一治療方法均難以獲得滿意療效,EGFR非基因突變型肺腺癌靶向治療效果差[5],目前臨床治療迫切需要安全、有效的綜合治療方案,中藥抗EGFR非基因突變型肺腺癌的研究有重要臨床意義。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察肺抑瘤膏干預(yù)EGFR非基因突變型小鼠肺腺癌移植瘤模型,應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)、自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(Rap)作為對(duì)照,探討在細(xì)胞自噬方面抑制EGFR非基因突變型肺腺癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及條件
C57BL/6近交系雄性小鼠 [(合格證號(hào) SCXK(魯) 20140007)],6~8周齡,體重(18±2)g,購(gòu)于山東省實(shí)驗(yàn)中心。接種了Lewis鼠源肺腺癌細(xì)胞株的小鼠,購(gòu)于國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)。于SPF級(jí)動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)至適應(yīng)環(huán)境后,進(jìn)行造模。
1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及藥物
Taq DNA聚合酶、DNA分子量Marker,測(cè)序試劑:ABI BigDye3.1。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、預(yù)染Marker、SDS-PAGE電泳液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、PVDF膜、內(nèi)參、內(nèi)參二抗等。微管相關(guān)蛋白1輕鏈LC3抗體(CST)。戊二醛固定液。0.9%氯化鈉注射液,雷帕霉素(Rap,稀釋為0.85 mg/mL)(北京華邁科),3-甲基腺嘌呤(3-MA,稀釋為1.5 mg/mL),肺抑瘤膏(膏方含生藥量約4.3 g)由山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供[(灌胃0.2 mL/(次·d),相當(dāng)于70 kg成人按體表面積折算的等效劑量)]。
2.1 造模方法
頸椎脫臼法處死1只腫瘤生長(zhǎng)良好的Lewis肺腺癌荷瘤小鼠,在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌鑷子、剪刀完整剝離腫瘤組織,于冰上制備細(xì)胞懸濁液,低溫離心、計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0 mL×107 mL,兩人合作在小鼠腋窩下接種腫瘤細(xì)胞懸液0.2 mL/只(約含瘤細(xì)胞2.0×106個(gè))[6]。
2.2 分組及給藥
接種腫瘤細(xì)胞后,每日觀察小鼠腋下移植瘤情況,當(dāng)能摸到米粒大小瘤體時(shí),說(shuō)明瘤細(xì)胞接種成功。按照SPSS統(tǒng)計(jì)軟件隨機(jī)設(shè)立生理鹽水對(duì)照組(組Ⅰ)、肺抑瘤膏干預(yù)組(組Ⅱ),3-MA組(組Ⅲ),Rap組(組Ⅳ),10只/組。分組后開(kāi)始藥物干預(yù)。組Ⅰ予生理鹽水灌胃0.2 mL/(次·d)。組Ⅱ予肺抑瘤膏灌胃0.2 mL/(次·d)。組Ⅲ予提前稀釋分裝的3-MA,0.2 mL/次,腹腔注射,2次/周。組Ⅳ予提前稀釋分裝的Rap,0.2 mL/次,腹腔注射,2次/周。
2.3 觀察指標(biāo)及方法
①瘤重、抑瘤率:末次灌胃24 h后稱重處死小鼠,快速剝離瘤體,稱瘤重,計(jì)算各組腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=(生理鹽水對(duì)照組平均瘤重-用藥組平均瘤重)/生理鹽水對(duì)照組平均瘤重×100%
②電鏡檢測(cè):剝離瘤體后,把標(biāo)本塊修整成符合要求的顆粒(≤0.5 mm),以最快的速度(最多 2 min),浸入戊二醛固定液,送檢。
③LC檢測(cè):免疫印跡法檢測(cè)移植瘤中自噬特異蛋白LC蛋白表達(dá)。
④EGFR檢測(cè):組Ⅰ、組Ⅱ小鼠移植瘤進(jìn)行EGFR基因(18、19、20、21號(hào)外顯子)毛細(xì)管電泳測(cè)序。
2.4 統(tǒng)計(jì)方法
采用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析所有數(shù)據(jù),采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)形式表示計(jì)量資料,行t檢驗(yàn);[n(%)]表示計(jì)數(shù)資料,行χ2檢驗(yàn),其中 P<0.05,說(shuō)明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05,說(shuō)明差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.1 一般情況
隨移植瘤的生長(zhǎng),各組小鼠的活動(dòng)逐漸減少,精神萎靡,毛發(fā)無(wú)光澤易脫落,攻擊性明顯降低,進(jìn)食、飲水減少,組Ⅲ小鼠表現(xiàn)最明顯。
3.2 種植成功率
接種Lewis細(xì)胞后一周內(nèi)所有小鼠腋下均可觸及移植瘤,瘤體積均可達(dá)一定大小(約100~150 mm3),成瘤率100%,造模成功率100%。
3.3 瘤重、抑瘤率
組Ⅱ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ抑瘤率分別為25.22%、1.37%、32.55%、瘤變具體見(jiàn)表1。
表1 小鼠移植瘤的瘤重[(±s),g]
表1 小鼠移植瘤的瘤重[(±s),g]
注:各組間瘤重比較:與組Ⅰ比較,▲P<0.05;與組Ⅱ比較,☆P<0.05。與組Ⅲ比較,△P<0.05;與組Ⅳ比較,□P<0.05。
組別 瘤重組Ⅰ(n=10)組Ⅱ(n=10)組Ⅲ(n=10)組Ⅳ(n=10)(8.05±0.36)☆□(6.02±0.40)▲△(7.94±0.28)☆□(5.43±0.5)5▲△
3.4 透射電鏡
透射電鏡提示:肺抑瘤膏可影響腫瘤細(xì)胞自噬,見(jiàn)圖1。
圖1 各組透射電鏡圖片(8000×)
3.5 Western blot結(jié)果
LC3、β-actin表達(dá)量,見(jiàn)圖2,圖3。
圖2 LC3、β-actin蛋白條帶
圖3 LC3/β-actin相對(duì)表達(dá)量柱狀圖
圖3各組間LC3/β-actin相對(duì)表達(dá)量比較:生理鹽水對(duì)照組與3-MA組比較P=0.888,與肺抑瘤膏組比較P= 0.014,與Rap組比較P=0.004。肺抑瘤膏組與3-MA組比較P=0.019,與Rap組比較P=0.544。3-MA組與Rap組比較P=0.005。
3.6 EGFR基因毛細(xì)管電泳測(cè)序結(jié)果
(1)基因組DNA與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,見(jiàn)圖4、圖5。
作業(yè)成本法的采用不只是管理層和財(cái)務(wù)部門(mén)實(shí)施的結(jié)果,作業(yè)成本法需要企業(yè)全員參加和支持。這是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)國(guó)產(chǎn),其數(shù)據(jù)來(lái)源于企業(yè)基層,來(lái)源于每個(gè)員工的工作,作業(yè)成本法的推進(jìn)和改革,需要企業(yè)各個(gè)部門(mén)的配合。
圖4 樣品基因組DNA電泳圖
圖5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖
(2)項(xiàng)目總結(jié):20個(gè)樣品的18,19,20,21號(hào)外顯子均測(cè)序合格。①其中20號(hào)外顯子含poly A和poly G結(jié)果,已經(jīng)進(jìn)行加測(cè)反應(yīng);②比對(duì)結(jié)果顯示無(wú)明顯突變。
導(dǎo)師以中醫(yī)辯證論治為指導(dǎo),結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)擬定了肺抑瘤膏方,首次把中醫(yī)膏方引入肺癌的臨床與實(shí)驗(yàn)研究。方中以黨參、黃芪為君補(bǔ)益肺脾之氣;白術(shù)祛濕助脾氣健運(yùn)、茯苓滲濕健脾、麥冬養(yǎng)陰生津潤(rùn)肺清心、女貞子滋補(bǔ)肝腎共為臣藥。佐以浙貝、夏枯草、山慈菇清熱散結(jié),薏苡仁滲濕健脾,貫眾清熱涼血,莪術(shù)破血行氣、消積止痛,蜂房攻毒破積。生甘草清熱解毒,調(diào)和諸藥為使。本方諸藥合用,組方嚴(yán)謹(jǐn),扶正而不斂邪,祛邪而不傷正,氣血同治,寒熱平調(diào),平補(bǔ)陰陽(yáng),無(wú)耗氣傷陰之弊。整體體現(xiàn)了扶正祛邪、動(dòng)靜結(jié)合、攻補(bǔ)兼施的配伍特點(diǎn)。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)晚期肺癌患者應(yīng)用肺抑瘤膏,可有效控制原發(fā)腫瘤病灶,減輕化療引起的不良反應(yīng),提高患者的生存質(zhì)量,延長(zhǎng)患者生存期。且膏劑有口感好、劑型小、服用量少、便于攜帶、易于耐受等優(yōu)點(diǎn),充分體現(xiàn)了中藥簡(jiǎn)、便、廉、驗(yàn)的特點(diǎn)。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、提高機(jī)體免疫功能等多環(huán)節(jié)入手進(jìn)行了一系列研究,但對(duì)腫瘤細(xì)胞自噬的研究尚屬首次。
自噬是溶酶體對(duì)細(xì)胞內(nèi)的部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器等進(jìn)行一系列降解過(guò)程的統(tǒng)稱。許多研究發(fā)現(xiàn)自噬可以在抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用,如通過(guò)誘發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性死亡,從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[7-9]。對(duì)自噬的分析一般是對(duì)組織切片標(biāo)本進(jìn)行電鏡觀察和 LC3蛋白的檢測(cè)[10]。自噬檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)是自噬性結(jié)構(gòu)的電鏡下形態(tài)學(xué)觀察,透射電子顯微鏡是觀察自噬現(xiàn)象的最直接、最經(jīng)典的方法。最常用的檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3蛋白表達(dá)的方法是蛋白印跡法。
該次實(shí)驗(yàn)通過(guò)EGFR基因測(cè)序,證實(shí)Lewis肺腺癌EGFR基因?yàn)榉腔蛲蛔冃汀Mㄟ^(guò)肺抑瘤膏組與生理鹽水對(duì)照組比較,發(fā)現(xiàn)肺抑瘤膏組在減輕小鼠腋下移植瘤瘤重、提高腫瘤抑制率方面均明顯優(yōu)于生理鹽水對(duì)照組,提示肺抑瘤膏對(duì)EGFR非基因突變型肺腺癌移植瘤原發(fā)病灶有明顯的抑制作用,能有效抑制其瘤體生長(zhǎng),降低移植瘤的生長(zhǎng)率。以自噬抑制劑3-MA、自噬誘導(dǎo)劑Rap作為對(duì)照分析:電鏡結(jié)果示應(yīng)用自噬抑制劑3-MA后,自噬小泡數(shù)量較生理鹽水對(duì)照組明顯減少,應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑Rap后,自噬小泡數(shù)量較生理鹽水對(duì)照組明顯增加,與文獻(xiàn)描述一致。應(yīng)用肺抑瘤膏干預(yù)后,自噬小泡數(shù)量亦較生理鹽水對(duì)照組明顯增加,說(shuō)明肺抑瘤膏可影響腫瘤細(xì)胞自噬。蛋白的Western blot結(jié)果示3-MA可明顯抑制自噬標(biāo)志物L(fēng)C3蛋白表達(dá),Rap可誘導(dǎo)自噬蛋白LC3的表達(dá),兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005),與文獻(xiàn)中描述一致。肺抑瘤膏組與3-MA組在瘤重、LC3/β-actin相對(duì)表達(dá)量?jī)煞矫姹容^,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與Rap組在瘤重、LC3/β-actin相對(duì)表達(dá)量?jī)煞矫姹容^,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明肺抑瘤膏能明顯抑制EGFR非基因突變型肺腺癌移植瘤生長(zhǎng),增加自噬標(biāo)志蛋白LC3表達(dá),結(jié)合電鏡結(jié)果,推測(cè)肺抑瘤膏可能是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬而發(fā)揮治療作用的,為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供了證據(jù)及思路。
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Expression of LC3 throug Anti-lung Tumor Ointment in Lewis Lung Model Mice of EGFR Non Genetic Mutations
ZHENG Xin1,PENG Zhao-yun1,2,MENG Xian-zhi1,ZHUANG He2
1.Second Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan,Shandong Proivnce,250001;2.Shandong U-niversity of Traditional Chinese Medicine,Jinan,Shandong Proivnce 250014 China
Objective Through the establishment of Lewis lung tumor model in mice,the transplanted tumors were detected EGFR gene sequencing and Anti-lung Tumor Ointment were observed the intervention effect for transplanted tumors.Methods The C57BL/6 mice were inoculated with Lewis lung carcinoma cells to established of Lewis lung tumor model.The mice were randomly divided into four groups after successful modeling.Normal saline group (group I),Anti-lung Tumor Ointment group(group II),3-MA group(group III),Rap group(group IV).We observed the tumor weight and the electron microscope,and Western Blot,and EGFR gene sequencing.Results EGFR gene sequencing shows:Non-mutant.Anti-lung Tumor Ointment can significantly reduce the tumor weight.GroupⅡcompared with groupⅠin tumor weight,expression were different(P<0.05).Group II tumor suppressor rate was 25.22%.GroupⅡcompared with group III in tumor weight and LC3/β-actin relative expression,expression were different(P<0.05).GroupⅡcompared with group IV in tumor weight and LC3/β-actin relative expression,expression were no different(P>0.05).Electron microscopy result show that Anti-lung Tumor Ointment can affect autophagy.Conclusion Anti-lung Tumor Ointment can significantly inhibit transplanted tumor growth of EGFR non genetic mutations of lung adenocarcinoma in lewis lung model mice,and may play a therapeutic rolethrough the induction of autophagy.
Anti-lung Tumor Ointment;Lewis lung carcinoma;EGFR non genetic mutations;LC3
R73;R28
A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2016.02.03.07
2016-07-20;
2016-08-18
鄭心(1964.1-),女,山東濟(jì)南人,博士,主任醫(yī)師,主要從事肺癌及肺間質(zhì)病的中西醫(yī)結(jié)合診斷與治療研究工作。