• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    肺抑瘤膏對(duì)EGFR野生型Lewis肺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)及LC3表達(dá)的影響

    2016-09-23 02:08:29鄭心彭召云孟憲志莊賀
    世界復(fù)合醫(yī)學(xué) 2016年3期
    關(guān)鍵詞:電鏡生理鹽水基因突變

    鄭心,彭召云,,孟憲志,莊賀

    1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,山東濟(jì)南 250001;2.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東濟(jì)南 250014

    肺抑瘤膏對(duì)EGFR野生型Lewis肺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)及LC3表達(dá)的影響

    鄭心1,彭召云1,2,孟憲志1,莊賀2

    1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,山東濟(jì)南 250001;2.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東濟(jì)南 250014

    目的 建立Lewis肺腺癌小鼠移植瘤模型,取移植瘤進(jìn)行EGFR基因測(cè)序,觀察肺抑瘤膏對(duì)移植瘤的干預(yù)作用。方法 使用C57BL/6小鼠,接種Lewis肺腺癌細(xì)胞,造模成功后,隨機(jī)分4組,生理鹽水對(duì)照組(組Ⅰ)、肺抑瘤膏組(組Ⅱ),3-MA組(組Ⅲ),Rap組(組Ⅳ),藥物干預(yù)后,觀察瘤重,并進(jìn)行電鏡、Western Blot檢測(cè)及EGFR基因測(cè)序。結(jié)果 EGFR基因測(cè)序示:非突變型。肺抑瘤膏可以明顯減輕移植瘤瘤重,組Ⅱ與生理鹽水對(duì)照組瘤重比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),組Ⅱ抑瘤率為25.22%;以自噬抑制劑3-MA、自噬誘導(dǎo)劑Rap作為對(duì)照分析,肺抑瘤膏組與3-MA組在瘤重、LC3/β-actin相對(duì)表達(dá)量?jī)煞矫姹容^,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而與Rap組在瘤重、LC3/β-actin相對(duì)表達(dá)量?jī)煞矫姹容^,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。電鏡提示肺抑瘤膏可影響腫瘤細(xì)胞自噬。結(jié)論 肺抑瘤膏能夠明顯抑制EGFR非基因突變型肺腺癌移植瘤的生長(zhǎng),且可能通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞自噬起到治療作用。

    肺抑瘤膏;Lewis肺癌;EGFR非基因突變型;LC3

    原發(fā)性支氣管肺癌現(xiàn)居全球癌癥首位[1],其中,肺腺癌占肺癌發(fā)病率的25%左右[2],其確診時(shí)絕大多數(shù)已屬中晚期,化療耐藥、放療抵抗等問(wèn)題的存在[3-4],應(yīng)用單一治療方法均難以獲得滿意療效,EGFR非基因突變型肺腺癌靶向治療效果差[5],目前臨床治療迫切需要安全、有效的綜合治療方案,中藥抗EGFR非基因突變型肺腺癌的研究有重要臨床意義。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察肺抑瘤膏干預(yù)EGFR非基因突變型小鼠肺腺癌移植瘤模型,應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)、自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(Rap)作為對(duì)照,探討在細(xì)胞自噬方面抑制EGFR非基因突變型肺腺癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。

    1 臨床資料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及條件

    C57BL/6近交系雄性小鼠 [(合格證號(hào) SCXK(魯) 20140007)],6~8周齡,體重(18±2)g,購(gòu)于山東省實(shí)驗(yàn)中心。接種了Lewis鼠源肺腺癌細(xì)胞株的小鼠,購(gòu)于國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)。于SPF級(jí)動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)至適應(yīng)環(huán)境后,進(jìn)行造模。

    1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及藥物

    Taq DNA聚合酶、DNA分子量Marker,測(cè)序試劑:ABI BigDye3.1。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、預(yù)染Marker、SDS-PAGE電泳液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、PVDF膜、內(nèi)參、內(nèi)參二抗等。微管相關(guān)蛋白1輕鏈LC3抗體(CST)。戊二醛固定液。0.9%氯化鈉注射液,雷帕霉素(Rap,稀釋為0.85 mg/mL)(北京華邁科),3-甲基腺嘌呤(3-MA,稀釋為1.5 mg/mL),肺抑瘤膏(膏方含生藥量約4.3 g)由山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供[(灌胃0.2 mL/(次·d),相當(dāng)于70 kg成人按體表面積折算的等效劑量)]。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 造模方法

    頸椎脫臼法處死1只腫瘤生長(zhǎng)良好的Lewis肺腺癌荷瘤小鼠,在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌鑷子、剪刀完整剝離腫瘤組織,于冰上制備細(xì)胞懸濁液,低溫離心、計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0 mL×107 mL,兩人合作在小鼠腋窩下接種腫瘤細(xì)胞懸液0.2 mL/只(約含瘤細(xì)胞2.0×106個(gè))[6]。

    2.2 分組及給藥

    接種腫瘤細(xì)胞后,每日觀察小鼠腋下移植瘤情況,當(dāng)能摸到米粒大小瘤體時(shí),說(shuō)明瘤細(xì)胞接種成功。按照SPSS統(tǒng)計(jì)軟件隨機(jī)設(shè)立生理鹽水對(duì)照組(組Ⅰ)、肺抑瘤膏干預(yù)組(組Ⅱ),3-MA組(組Ⅲ),Rap組(組Ⅳ),10只/組。分組后開(kāi)始藥物干預(yù)。組Ⅰ予生理鹽水灌胃0.2 mL/(次·d)。組Ⅱ予肺抑瘤膏灌胃0.2 mL/(次·d)。組Ⅲ予提前稀釋分裝的3-MA,0.2 mL/次,腹腔注射,2次/周。組Ⅳ予提前稀釋分裝的Rap,0.2 mL/次,腹腔注射,2次/周。

    2.3 觀察指標(biāo)及方法

    ①瘤重、抑瘤率:末次灌胃24 h后稱重處死小鼠,快速剝離瘤體,稱瘤重,計(jì)算各組腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=(生理鹽水對(duì)照組平均瘤重-用藥組平均瘤重)/生理鹽水對(duì)照組平均瘤重×100%

    ②電鏡檢測(cè):剝離瘤體后,把標(biāo)本塊修整成符合要求的顆粒(≤0.5 mm),以最快的速度(最多 2 min),浸入戊二醛固定液,送檢。

    ③LC檢測(cè):免疫印跡法檢測(cè)移植瘤中自噬特異蛋白LC蛋白表達(dá)。

    ④EGFR檢測(cè):組Ⅰ、組Ⅱ小鼠移植瘤進(jìn)行EGFR基因(18、19、20、21號(hào)外顯子)毛細(xì)管電泳測(cè)序。

    2.4 統(tǒng)計(jì)方法

    采用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析所有數(shù)據(jù),采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)形式表示計(jì)量資料,行t檢驗(yàn);[n(%)]表示計(jì)數(shù)資料,行χ2檢驗(yàn),其中 P<0.05,說(shuō)明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05,說(shuō)明差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.1 一般情況

    隨移植瘤的生長(zhǎng),各組小鼠的活動(dòng)逐漸減少,精神萎靡,毛發(fā)無(wú)光澤易脫落,攻擊性明顯降低,進(jìn)食、飲水減少,組Ⅲ小鼠表現(xiàn)最明顯。

    3.2 種植成功率

    接種Lewis細(xì)胞后一周內(nèi)所有小鼠腋下均可觸及移植瘤,瘤體積均可達(dá)一定大小(約100~150 mm3),成瘤率100%,造模成功率100%。

    3.3 瘤重、抑瘤率

    組Ⅱ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ抑瘤率分別為25.22%、1.37%、32.55%、瘤變具體見(jiàn)表1。

    表1 小鼠移植瘤的瘤重[(±s),g]

    表1 小鼠移植瘤的瘤重[(±s),g]

    注:各組間瘤重比較:與組Ⅰ比較,▲P<0.05;與組Ⅱ比較,☆P<0.05。與組Ⅲ比較,△P<0.05;與組Ⅳ比較,□P<0.05。

    組別 瘤重組Ⅰ(n=10)組Ⅱ(n=10)組Ⅲ(n=10)組Ⅳ(n=10)(8.05±0.36)☆□(6.02±0.40)▲△(7.94±0.28)☆□(5.43±0.5)5▲△

    3.4 透射電鏡

    透射電鏡提示:肺抑瘤膏可影響腫瘤細(xì)胞自噬,見(jiàn)圖1。

    圖1 各組透射電鏡圖片(8000×)

    3.5 Western blot結(jié)果

    LC3、β-actin表達(dá)量,見(jiàn)圖2,圖3。

    圖2 LC3、β-actin蛋白條帶

    圖3 LC3/β-actin相對(duì)表達(dá)量柱狀圖

    圖3各組間LC3/β-actin相對(duì)表達(dá)量比較:生理鹽水對(duì)照組與3-MA組比較P=0.888,與肺抑瘤膏組比較P= 0.014,與Rap組比較P=0.004。肺抑瘤膏組與3-MA組比較P=0.019,與Rap組比較P=0.544。3-MA組與Rap組比較P=0.005。

    3.6 EGFR基因毛細(xì)管電泳測(cè)序結(jié)果

    (1)基因組DNA與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,見(jiàn)圖4、圖5。

    作業(yè)成本法的采用不只是管理層和財(cái)務(wù)部門(mén)實(shí)施的結(jié)果,作業(yè)成本法需要企業(yè)全員參加和支持。這是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)國(guó)產(chǎn),其數(shù)據(jù)來(lái)源于企業(yè)基層,來(lái)源于每個(gè)員工的工作,作業(yè)成本法的推進(jìn)和改革,需要企業(yè)各個(gè)部門(mén)的配合。

    圖4 樣品基因組DNA電泳圖

    圖5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

    (2)項(xiàng)目總結(jié):20個(gè)樣品的18,19,20,21號(hào)外顯子均測(cè)序合格。①其中20號(hào)外顯子含poly A和poly G結(jié)果,已經(jīng)進(jìn)行加測(cè)反應(yīng);②比對(duì)結(jié)果顯示無(wú)明顯突變。

    4 討論

    導(dǎo)師以中醫(yī)辯證論治為指導(dǎo),結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)擬定了肺抑瘤膏方,首次把中醫(yī)膏方引入肺癌的臨床與實(shí)驗(yàn)研究。方中以黨參、黃芪為君補(bǔ)益肺脾之氣;白術(shù)祛濕助脾氣健運(yùn)、茯苓滲濕健脾、麥冬養(yǎng)陰生津潤(rùn)肺清心、女貞子滋補(bǔ)肝腎共為臣藥。佐以浙貝、夏枯草、山慈菇清熱散結(jié),薏苡仁滲濕健脾,貫眾清熱涼血,莪術(shù)破血行氣、消積止痛,蜂房攻毒破積。生甘草清熱解毒,調(diào)和諸藥為使。本方諸藥合用,組方嚴(yán)謹(jǐn),扶正而不斂邪,祛邪而不傷正,氣血同治,寒熱平調(diào),平補(bǔ)陰陽(yáng),無(wú)耗氣傷陰之弊。整體體現(xiàn)了扶正祛邪、動(dòng)靜結(jié)合、攻補(bǔ)兼施的配伍特點(diǎn)。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)晚期肺癌患者應(yīng)用肺抑瘤膏,可有效控制原發(fā)腫瘤病灶,減輕化療引起的不良反應(yīng),提高患者的生存質(zhì)量,延長(zhǎng)患者生存期。且膏劑有口感好、劑型小、服用量少、便于攜帶、易于耐受等優(yōu)點(diǎn),充分體現(xiàn)了中藥簡(jiǎn)、便、廉、驗(yàn)的特點(diǎn)。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、提高機(jī)體免疫功能等多環(huán)節(jié)入手進(jìn)行了一系列研究,但對(duì)腫瘤細(xì)胞自噬的研究尚屬首次。

    自噬是溶酶體對(duì)細(xì)胞內(nèi)的部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器等進(jìn)行一系列降解過(guò)程的統(tǒng)稱。許多研究發(fā)現(xiàn)自噬可以在抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用,如通過(guò)誘發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性死亡,從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[7-9]。對(duì)自噬的分析一般是對(duì)組織切片標(biāo)本進(jìn)行電鏡觀察和 LC3蛋白的檢測(cè)[10]。自噬檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)是自噬性結(jié)構(gòu)的電鏡下形態(tài)學(xué)觀察,透射電子顯微鏡是觀察自噬現(xiàn)象的最直接、最經(jīng)典的方法。最常用的檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3蛋白表達(dá)的方法是蛋白印跡法。

    該次實(shí)驗(yàn)通過(guò)EGFR基因測(cè)序,證實(shí)Lewis肺腺癌EGFR基因?yàn)榉腔蛲蛔冃汀Mㄟ^(guò)肺抑瘤膏組與生理鹽水對(duì)照組比較,發(fā)現(xiàn)肺抑瘤膏組在減輕小鼠腋下移植瘤瘤重、提高腫瘤抑制率方面均明顯優(yōu)于生理鹽水對(duì)照組,提示肺抑瘤膏對(duì)EGFR非基因突變型肺腺癌移植瘤原發(fā)病灶有明顯的抑制作用,能有效抑制其瘤體生長(zhǎng),降低移植瘤的生長(zhǎng)率。以自噬抑制劑3-MA、自噬誘導(dǎo)劑Rap作為對(duì)照分析:電鏡結(jié)果示應(yīng)用自噬抑制劑3-MA后,自噬小泡數(shù)量較生理鹽水對(duì)照組明顯減少,應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑Rap后,自噬小泡數(shù)量較生理鹽水對(duì)照組明顯增加,與文獻(xiàn)描述一致。應(yīng)用肺抑瘤膏干預(yù)后,自噬小泡數(shù)量亦較生理鹽水對(duì)照組明顯增加,說(shuō)明肺抑瘤膏可影響腫瘤細(xì)胞自噬。蛋白的Western blot結(jié)果示3-MA可明顯抑制自噬標(biāo)志物L(fēng)C3蛋白表達(dá),Rap可誘導(dǎo)自噬蛋白LC3的表達(dá),兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005),與文獻(xiàn)中描述一致。肺抑瘤膏組與3-MA組在瘤重、LC3/β-actin相對(duì)表達(dá)量?jī)煞矫姹容^,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與Rap組在瘤重、LC3/β-actin相對(duì)表達(dá)量?jī)煞矫姹容^,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明肺抑瘤膏能明顯抑制EGFR非基因突變型肺腺癌移植瘤生長(zhǎng),增加自噬標(biāo)志蛋白LC3表達(dá),結(jié)合電鏡結(jié)果,推測(cè)肺抑瘤膏可能是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬而發(fā)揮治療作用的,為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供了證據(jù)及思路。

    [1]Chen W,Zheng R,Zhang S,et al.Annual report on status of cancer in China,2010[J].Chin J Cancer Res,2014,26(1): 48-58.

    [2]Chunhacha P,Chanvorachote P.Roles of caveolin-1 on anoikis resistance in non small cell lung cancer[J].Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol,2012,4(3):149-155.

    [3]Ofarrill JS,Gordon N.Autophagy in osteosarcoma[J].Adv Exp Med Biol,2014(804):147-160.

    [4]Lin Y,Wang X,Jin H.Egfr-TKI resistance in NSCLC patients:mechanisms and strategies[J].Am J Cancer Res,2014, 4(5):411-35.

    [5]Yang JC,Schuler M,Massey D,et al.Activity of afatinib in uncommon epidermal growth factor receptor(EGFR)mutations:findings from three trials of afatinib in EGFR mutation-positive lung cancer[J].J Thoracic Oncol,2013(5):584-589.

    [6]徐淑云,卞如濂,陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:1770.

    [7]Chen YJ,Chi CW,Su WC,et al.Lapatinib induces autophagic cell death and inhibits growth of human hepatocellular carcinoma[J].Oncotarget,2014,5(13):4845-4854.

    [8]Sharma K,Le N,Alotaibi M,et al.Cytotoxic autophagy in cancer therapy[J].Int J Mol Sci,2014,15(6):10034-10051.

    [9]Ouyang L,Shi Z,Zhao S,et al.Programmed cell death pathways in cancer:a review of apoptosis,autophagy and programmed necrosis[J].Cell Prolif,2012,45(6):487-498.

    [10]Martinet W,De Meyer G R,Andries L,et al.Detection of autophagy in tissue by standard immunohistochemistry:possibilities and limitations[J].Autophagy,2006,2(1):55-57.

    Expression of LC3 throug Anti-lung Tumor Ointment in Lewis Lung Model Mice of EGFR Non Genetic Mutations

    ZHENG Xin1,PENG Zhao-yun1,2,MENG Xian-zhi1,ZHUANG He2
    1.Second Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan,Shandong Proivnce,250001;2.Shandong U-niversity of Traditional Chinese Medicine,Jinan,Shandong Proivnce 250014 China

    Objective Through the establishment of Lewis lung tumor model in mice,the transplanted tumors were detected EGFR gene sequencing and Anti-lung Tumor Ointment were observed the intervention effect for transplanted tumors.Methods The C57BL/6 mice were inoculated with Lewis lung carcinoma cells to established of Lewis lung tumor model.The mice were randomly divided into four groups after successful modeling.Normal saline group (group I),Anti-lung Tumor Ointment group(group II),3-MA group(group III),Rap group(group IV).We observed the tumor weight and the electron microscope,and Western Blot,and EGFR gene sequencing.Results EGFR gene sequencing shows:Non-mutant.Anti-lung Tumor Ointment can significantly reduce the tumor weight.GroupⅡcompared with groupⅠin tumor weight,expression were different(P<0.05).Group II tumor suppressor rate was 25.22%.GroupⅡcompared with group III in tumor weight and LC3/β-actin relative expression,expression were different(P<0.05).GroupⅡcompared with group IV in tumor weight and LC3/β-actin relative expression,expression were no different(P>0.05).Electron microscopy result show that Anti-lung Tumor Ointment can affect autophagy.Conclusion Anti-lung Tumor Ointment can significantly inhibit transplanted tumor growth of EGFR non genetic mutations of lung adenocarcinoma in lewis lung model mice,and may play a therapeutic rolethrough the induction of autophagy.

    Anti-lung Tumor Ointment;Lewis lung carcinoma;EGFR non genetic mutations;LC3

    R73;R28

    A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2016.02.03.07

    2016-07-20;

    2016-08-18

    鄭心(1964.1-),女,山東濟(jì)南人,博士,主任醫(yī)師,主要從事肺癌及肺間質(zhì)病的中西醫(yī)結(jié)合診斷與治療研究工作。

    猜你喜歡
    電鏡生理鹽水基因突變
    大狗,小狗——基因突變解釋體型大小
    Physiological Saline
    管家基因突變導(dǎo)致面部特異性出生缺陷的原因
    基因突變的“新物種”
    自制生理鹽水
    竹斑蛾觸角感器電鏡掃描觀察
    電鏡成像方式對(duì)數(shù)字散斑相關(guān)方法結(jié)果的影響
    “拔伸松動(dòng)手法”對(duì)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎電鏡下軟骨超微結(jié)構(gòu)的影響
    從EGFR基因突變看肺癌異質(zhì)性
    提高電子顯微鏡使用效率的方法探討
    a级毛片免费高清观看在线播放| 在线看三级毛片| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产麻豆成人av免费视频| 成年av动漫网址| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产视频一区二区在线看| 亚洲精品一区av在线观看| 一级黄色大片毛片| 人人妻人人看人人澡| 国产v大片淫在线免费观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 成人永久免费在线观看视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 五月伊人婷婷丁香| 免费看美女性在线毛片视频| 一级毛片我不卡| 日日干狠狠操夜夜爽| av视频在线观看入口| 69av精品久久久久久| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美最黄视频在线播放免费| 97碰自拍视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 热99re8久久精品国产| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精品久久久久久久久久久久久| 免费黄网站久久成人精品| 日本黄色片子视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美+日韩+精品| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产精品精品国产色婷婷| 可以在线观看的亚洲视频| 国产成人a区在线观看| 婷婷亚洲欧美| 亚洲一区二区三区色噜噜| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲最大成人中文| 亚洲精品在线观看二区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 在线观看一区二区三区| 亚洲综合色惰| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲欧美日韩高清专用| 能在线免费观看的黄片| 国产精华一区二区三区| 性插视频无遮挡在线免费观看| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 天天一区二区日本电影三级| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲中文字幕日韩| 身体一侧抽搐| 亚洲自拍偷在线| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产高潮美女av| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲欧美日韩无卡精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产69精品久久久久777片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 免费在线观看影片大全网站| 精品久久久久久久久av| 色视频www国产| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久99热6这里只有精品| 成人鲁丝片一二三区免费| 久久久久久久久中文| 亚洲精品亚洲一区二区| 两个人视频免费观看高清| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲七黄色美女视频| 日本a在线网址| 一个人免费在线观看电影| 毛片一级片免费看久久久久| 国产精品一区二区免费欧美| 久久热精品热| 中国国产av一级| 最新在线观看一区二区三区| 久久久久久久久久成人| 日本 av在线| 两个人视频免费观看高清| 久久久国产成人免费| 51国产日韩欧美| 一本一本综合久久| 最近2019中文字幕mv第一页| 少妇的逼水好多| 嫩草影视91久久| 综合色av麻豆| 国产v大片淫在线免费观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 日韩精品有码人妻一区| 六月丁香七月| 最后的刺客免费高清国语| 久久久色成人| a级毛色黄片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产精品一区二区性色av| 国产精品三级大全| 免费在线观看成人毛片| 少妇熟女aⅴ在线视频| 最新中文字幕久久久久| 男插女下体视频免费在线播放| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久99热6这里只有精品| 给我免费播放毛片高清在线观看| 一级黄片播放器| 欧美另类亚洲清纯唯美| av福利片在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 在线看三级毛片| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 久久精品国产亚洲网站| 日韩 亚洲 欧美在线| 精品日产1卡2卡| 三级经典国产精品| 成年女人永久免费观看视频| 中出人妻视频一区二区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 有码 亚洲区| 99热这里只有是精品在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 免费av不卡在线播放| 在线天堂最新版资源| 日韩av不卡免费在线播放| 久久中文看片网| 精品欧美国产一区二区三| av专区在线播放| 午夜影院日韩av| 91久久精品国产一区二区成人| 午夜精品国产一区二区电影 | 插逼视频在线观看| 波多野结衣高清作品| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产毛片a区久久久久| www.色视频.com| 久久九九热精品免费| 欧美一级a爱片免费观看看| 22中文网久久字幕| 免费电影在线观看免费观看| 欧美激情在线99| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲av电影不卡..在线观看| av在线老鸭窝| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 97人妻精品一区二区三区麻豆| or卡值多少钱| 亚洲国产精品久久男人天堂| 97碰自拍视频| 日韩欧美精品免费久久| av专区在线播放| 午夜福利在线在线| 亚洲精品色激情综合| 国国产精品蜜臀av免费| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产69精品久久久久777片| 又黄又爽又免费观看的视频| 变态另类丝袜制服| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲成人av在线免费| 国产精品av视频在线免费观看| 男女之事视频高清在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 日本黄色片子视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 赤兔流量卡办理| 欧美日本亚洲视频在线播放| 日韩高清综合在线| 欧美+日韩+精品| 99热网站在线观看| 成人av在线播放网站| 又爽又黄a免费视频| 国产免费一级a男人的天堂| 一进一出抽搐gif免费好疼| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产大屁股一区二区在线视频| 天天一区二区日本电影三级| 午夜影院日韩av| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲精品一区av在线观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产真实乱freesex| 免费看日本二区| 亚洲无线观看免费| 精品人妻视频免费看| 99riav亚洲国产免费| 国产精品人妻久久久久久| 国产精品av视频在线免费观看| 麻豆成人午夜福利视频| 黄色一级大片看看| 精品午夜福利在线看| 51国产日韩欧美| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产精品亚洲美女久久久| 国语自产精品视频在线第100页| 男人舔女人下体高潮全视频| a级毛色黄片| 女同久久另类99精品国产91| 欧美日韩乱码在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲欧美日韩高清专用| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 中文字幕av在线有码专区| 免费看a级黄色片| 欧美成人一区二区免费高清观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美精品国产亚洲| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久久久久九九精品二区国产| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久人妻av系列| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 99热只有精品国产| 毛片一级片免费看久久久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 搡老岳熟女国产| 俺也久久电影网| 亚洲无线观看免费| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产高清三级在线| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 听说在线观看完整版免费高清| 国产v大片淫在线免费观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 此物有八面人人有两片| 黑人高潮一二区| 99热这里只有是精品在线观看| 国产精品久久久久久久电影| 嫩草影院入口| 久久精品国产亚洲av天美| 少妇熟女aⅴ在线视频| 我的老师免费观看完整版| 日本精品一区二区三区蜜桃| 可以在线观看的亚洲视频| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 精品久久久久久久久久久久久| 国产三级在线视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美在线一区亚洲| 亚洲人成网站高清观看| 日本黄色视频三级网站网址| 男女下面进入的视频免费午夜| 日韩强制内射视频| 亚洲图色成人| 国产成人精品久久久久久| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 色视频www国产| 三级国产精品欧美在线观看| 一级毛片我不卡| 不卡视频在线观看欧美| 久久久精品欧美日韩精品| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 不卡视频在线观看欧美| 嫩草影视91久久| 麻豆国产97在线/欧美| 成人av在线播放网站| 伦精品一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区久久| 直男gayav资源| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 九九热线精品视视频播放| 国产 一区 欧美 日韩| 国产一区二区在线观看日韩| 国模一区二区三区四区视频| 国产精品一区二区免费欧美| 婷婷精品国产亚洲av| 香蕉av资源在线| 国产精品久久久久久av不卡| 国产高清三级在线| 亚洲美女视频黄频| 成人二区视频| 国产精品福利在线免费观看| 国产中年淑女户外野战色| av福利片在线观看| 露出奶头的视频| 又爽又黄无遮挡网站| 国产精品1区2区在线观看.| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品不卡视频一区二区| 国产精品无大码| 99国产精品一区二区蜜桃av| 一本精品99久久精品77| 中文字幕av在线有码专区| 国产 一区 欧美 日韩| 色哟哟哟哟哟哟| 俄罗斯特黄特色一大片| 成人美女网站在线观看视频| 精品乱码久久久久久99久播| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产精品一及| 日本在线视频免费播放| 男人舔女人下体高潮全视频| 又爽又黄无遮挡网站| 插逼视频在线观看| 有码 亚洲区| 国产欧美日韩一区二区精品| av在线老鸭窝| 亚洲av中文av极速乱| 欧美在线一区亚洲| 精品国内亚洲2022精品成人| 无遮挡黄片免费观看| 国模一区二区三区四区视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久久午夜欧美精品| 久久久久国产网址| 热99在线观看视频| 久99久视频精品免费| 成年女人看的毛片在线观看| 最近手机中文字幕大全| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 中文字幕熟女人妻在线| 中国美白少妇内射xxxbb| 国国产精品蜜臀av免费| 午夜久久久久精精品| 亚洲真实伦在线观看| 丰满乱子伦码专区| 国产中年淑女户外野战色| 特级一级黄色大片| 综合色av麻豆| 日韩成人伦理影院| 97在线视频观看| 免费人成在线观看视频色| 免费av毛片视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 两个人的视频大全免费| 简卡轻食公司| 免费在线观看影片大全网站| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久久久国产a免费观看| 秋霞在线观看毛片| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产精品国产高清国产av| 嫩草影院新地址| 91狼人影院| a级毛片a级免费在线| 波多野结衣巨乳人妻| 床上黄色一级片| 黄色欧美视频在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 久久99热6这里只有精品| av专区在线播放| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久精品国产亚洲av天美| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 黄色一级大片看看| 免费搜索国产男女视频| h日本视频在线播放| 日韩av在线大香蕉| 在线a可以看的网站| 岛国在线免费视频观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 免费观看人在逋| 国内精品久久久久精免费| 国产乱人视频| 69人妻影院| 国产色爽女视频免费观看| 久久人人精品亚洲av| 麻豆成人午夜福利视频| 大型黄色视频在线免费观看| 99热6这里只有精品| 欧美又色又爽又黄视频| 久久人人爽人人片av| 男女啪啪激烈高潮av片| 韩国av在线不卡| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产亚洲欧美98| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲精品一区av在线观看| 99riav亚洲国产免费| 国产精品人妻久久久久久| 日韩中字成人| 免费观看的影片在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 麻豆国产97在线/欧美| 午夜视频国产福利| 我要看日韩黄色一级片| 少妇熟女aⅴ在线视频| 色播亚洲综合网| 波野结衣二区三区在线| 国内精品宾馆在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲av电影不卡..在线观看| 97碰自拍视频| 欧美在线一区亚洲| 精品久久久噜噜| 亚洲自拍偷在线| 一本一本综合久久| 免费观看在线日韩| 精品人妻熟女av久视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产单亲对白刺激| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 如何舔出高潮| 欧美又色又爽又黄视频| 午夜激情欧美在线| 最好的美女福利视频网| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美又色又爽又黄视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 国产一区二区在线av高清观看| 91精品国产九色| 悠悠久久av| 一个人观看的视频www高清免费观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| 精品一区二区三区人妻视频| 久久久国产成人免费| 日本黄大片高清| 男人和女人高潮做爰伦理| 日本免费一区二区三区高清不卡| 成人鲁丝片一二三区免费| 日韩一区二区视频免费看| 黑人高潮一二区| 免费一级毛片在线播放高清视频| 99九九线精品视频在线观看视频| 看免费成人av毛片| 高清毛片免费观看视频网站| 在线天堂最新版资源| 精品久久久久久久末码| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美另类亚洲清纯唯美| 少妇人妻一区二区三区视频| 午夜激情欧美在线| 12—13女人毛片做爰片一| 午夜激情福利司机影院| 日韩中字成人| av在线老鸭窝| 日韩强制内射视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 99久国产av精品国产电影| 久久久久久九九精品二区国产| 久久人人爽人人片av| 精品久久久久久久久亚洲| 又爽又黄a免费视频| 国产av不卡久久| 国产精品一区二区免费欧美| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 99热全是精品| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲va在线va天堂va国产| 免费av不卡在线播放| 欧美zozozo另类| 欧美人与善性xxx| 偷拍熟女少妇极品色| 人人妻人人看人人澡| 色综合站精品国产| 麻豆一二三区av精品| 国产黄a三级三级三级人| 精品久久久噜噜| 亚洲18禁久久av| 国产成人a区在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 日韩高清综合在线| 国语自产精品视频在线第100页| av在线天堂中文字幕| 真人做人爱边吃奶动态| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲欧美精品综合久久99| 国产男靠女视频免费网站| 麻豆成人午夜福利视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲国产精品成人综合色| 日韩成人伦理影院| 久久久久久大精品| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| av卡一久久| 插逼视频在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 午夜福利高清视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产精品一及| 久久久久久久久中文| 色播亚洲综合网| 免费在线观看影片大全网站| 91精品国产九色| 久久99热这里只有精品18| 校园春色视频在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 精品久久久久久久久久久久久| av免费在线看不卡| 久久人妻av系列| 亚洲av美国av| 一本精品99久久精品77| 久久亚洲精品不卡| 校园春色视频在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久人人爽人人片av| 亚洲成人久久性| 久久九九热精品免费| 免费看a级黄色片| 国产在视频线在精品| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 日本 av在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产av不卡久久| 免费看光身美女| 午夜老司机福利剧场| 亚洲中文字幕日韩| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 男插女下体视频免费在线播放| 国产精品1区2区在线观看.| 久久6这里有精品| 亚洲国产精品合色在线| 免费人成视频x8x8入口观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 午夜福利成人在线免费观看| 国产黄a三级三级三级人| 国产毛片a区久久久久| 久久久国产成人免费| 精品久久久久久久久亚洲| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 天美传媒精品一区二区| 三级国产精品欧美在线观看| 色av中文字幕| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产三级中文精品| 久久精品国产亚洲网站| 午夜福利在线在线| 热99re8久久精品国产| 老熟妇仑乱视频hdxx| 午夜激情欧美在线| www日本黄色视频网| 欧美最黄视频在线播放免费| 69av精品久久久久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲美女搞黄在线观看 | 精品少妇黑人巨大在线播放 | 91久久精品国产一区二区成人| 22中文网久久字幕| 亚洲第一电影网av| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 日日摸夜夜添夜夜爱| 三级经典国产精品| 亚洲精品影视一区二区三区av| 婷婷精品国产亚洲av| 美女cb高潮喷水在线观看| av中文乱码字幕在线| 国产久久久一区二区三区| 亚洲av美国av| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久精品综合一区二区三区| 欧美日韩国产亚洲二区| 日韩av在线大香蕉| 亚洲专区国产一区二区| 午夜福利在线观看吧| 高清午夜精品一区二区三区 | 可以在线观看毛片的网站| 性插视频无遮挡在线免费观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产高清三级在线| 久久6这里有精品| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 超碰av人人做人人爽久久| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲美女搞黄在线观看 | 国产高清不卡午夜福利| 熟女人妻精品中文字幕| 国产一区二区三区av在线 | 能在线免费观看的黄片| 精品不卡国产一区二区三区| 国产精华一区二区三区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美国产日韩亚洲一区| 乱人视频在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 桃色一区二区三区在线观看| 少妇丰满av| 亚洲在线观看片| 男女之事视频高清在线观看| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲欧美清纯卡通| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 一本久久中文字幕| 男女啪啪激烈高潮av片| 99久国产av精品| 国产私拍福利视频在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 校园人妻丝袜中文字幕| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 精品欧美国产一区二区三|