自養(yǎng)型錳氧化菌的選育及除錳效果研究

侯荷霞

（青島理工大學(xué)，山東 青島 266033）

自養(yǎng)型錳氧化菌的選育及除錳效果研究

侯荷霞

（青島理工大學(xué)，山東 青島 266033）

自養(yǎng)型生物除錳濾池可以有效地去除地下水中的錳，為了獲取接種該濾池的菌種并探究其除錳效果，利用改良的JFM培養(yǎng)基對(duì)曝氣池中的活性污泥進(jìn)行馴化培養(yǎng)，篩選出了除錳率在90%以上的高效自養(yǎng)型錳氧化菌。通過平板培養(yǎng)和革蘭氏染色，得到3種不同的菌落且均為陰性菌，16S rDNA基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)5種不同的科屬。菌液經(jīng)過2個(gè)周期的傳代培養(yǎng)，探究其除錳效果，最高除錳率達(dá)到了98%。

自養(yǎng)型除錳菌；篩選；鑒定；16S rDNA；除錳效果

10.13358/j.issn.1008-813x.2016.04.22

錳是人體健康必需的微量元素，廣泛存在于地下水中。我國人口多以地下水為主要飲用水水源，但我國地下水中的錳含量遠(yuǎn)超過生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)，尤其是北方地區(qū)，地下水錳含量普遍在1 mg/L以上［1］。長(zhǎng)期飲用錳含量高的水會(huì)對(duì)人類的身體健康產(chǎn)生惡劣的影響，造成人體生理疾?。?］。因此，構(gòu)建生物除錳濾池去除地下水中的錳十分必要。地下水生物除錳濾池中，錳氧化菌是除錳功能的主體。但地下水中溶解性的有機(jī)物濃度很低，對(duì)于這種貧營養(yǎng)環(huán)境，自養(yǎng)型錳氧化菌較異養(yǎng)型錳氧化菌更易生存且擁有更好的除錳性能。因此，選擇培養(yǎng)自養(yǎng)型錳氧化菌可為地下水生物除錳工藝提供更優(yōu)質(zhì)的除錳菌源。同時(shí)，鑒定自養(yǎng)型錳氧化菌的菌種，探究其生理生化特征以及除錳性能可為實(shí)際生物除錳濾池中構(gòu)建高效除錳菌群提供理論參考。

除錳菌的來源主要有土壤、污水處理廠曝氣池和含錳井壁泥［3-4］。不同來源的除錳菌的營養(yǎng)特性、生理習(xí)性、結(jié)構(gòu)特征、培養(yǎng)方式和除錳效率等存在一定的差異。本實(shí)驗(yàn)選擇污水處理廠曝氣池中的活性污泥作為自養(yǎng)型除錳菌的菌源，選擇合適的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，并對(duì)篩選得到的高效自養(yǎng)型除錳菌的菌體形態(tài)、菌落特征以及除錳效果進(jìn)行了初步的研究。

1　試驗(yàn)材料及方法

1.1主要儀器設(shè)備

振蕩器PY-150（武漢匯誠科技有限公司）；電子分析天平 FA2004N（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；光學(xué)顯微鏡DMB-1223（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；臺(tái)式離心 Thermo Fishe（美國塞默飛世而科技公司）；紫外分光光度計(jì) UV759（上海皖寧精密科學(xué)儀器有限公司）；光照培養(yǎng)箱SPX-250B-G（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2菌種的來源

菌種來源：一是取自青島市海泊河污水處理廠曝氣池好氧區(qū)的活性污泥，該區(qū)含有較多的自養(yǎng)菌，將預(yù)處理后的活性污泥作為菌源；二是本實(shí)驗(yàn)室一直保存的自養(yǎng)型除錳菌菌種。

1.3培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)采用JFM培養(yǎng)基［5］，采用NaHCO3和HCl調(diào)pH在6.8～7.2之間。其中JFM、JFM8、JFM6、JFM4、JFM2、JFM0分別表示培養(yǎng)基中檸檬酸鐵銨濃度為10 g/L、8 g/L、6 g/L、4 g/L、2 g/L、0g/L，其他成分含量及pH值均相同。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加瓊脂1.5%，濕熱滅菌后使用。表1為各培養(yǎng)基的成分及說明。

表1　培養(yǎng)基成分及說明

1.4細(xì)菌培養(yǎng)方式

搖瓶培養(yǎng)：室溫下160 r/min連續(xù)震蕩，7 d為一個(gè)周期。

平板培養(yǎng)：25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d［5］。

1.5細(xì)菌鑒定方法

細(xì)菌表觀鑒定：稀釋涂布平板實(shí)驗(yàn)和革蘭氏染色。

細(xì)菌菌種鑒定：16S rDNA基因組測(cè)序。

1.6錳離子的檢測(cè)

采用高碘酸鉀紫外分光光度法。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1培養(yǎng)基的選擇

由JFM培養(yǎng)基的成分可以看出，該培養(yǎng)基中不含有機(jī)物，只含有相應(yīng)的鐵源、錳源及細(xì)菌所需的微量生長(zhǎng)因子，是適合自養(yǎng)型錳氧化菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基中檸檬酸鐵銨的濃度為10 g/L，鐵含量較高，可能會(huì)造成鐵細(xì)菌生長(zhǎng)優(yōu)于錳細(xì)菌，但是諸多研究表明錳細(xì)菌是伴隨著鐵細(xì)菌一起生長(zhǎng)的，因此需要找到一個(gè)合適的檸檬酸鐵銨濃度來保證錳細(xì)菌在培養(yǎng)基中是優(yōu)勢(shì)菌。

改變JFM培養(yǎng)基中檸檬酸鐵銨的濃度，分別為10 g/L、8 g/L、6 g/L、4 g/L、2 g/L、0 g/L，其他成分完全相同，對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基名稱為JFM、JFM8、JFM6、JFM4、JFM2、JFM0。分別配置以上6種培養(yǎng)基各300 ml，于18個(gè)150 ml的錐形瓶中各100 ml，且在每個(gè)錐形瓶中加入10 ml實(shí)驗(yàn)室保留的菌種，室溫下置于160 r/min搖床上連續(xù)震蕩。每天同一時(shí)間檢測(cè)錐形瓶中剩余錳濃度，觀察培養(yǎng)基的顏色變化、渾濁度以及錐形瓶壁的粘附物。

連續(xù)培養(yǎng)5 d后從搖床上取下錐形瓶，靜止觀察，所有錐形瓶上均出現(xiàn)了棕褐色的菌圈。但是，含JFM0和JFM2培養(yǎng)基的錐形瓶壁上的菌圈較其他錐形瓶上的小且沒有牢固的粘附在瓶壁上，輕輕搖晃，菌圈就會(huì)消失，而其他瓶壁上的菌圈比較牢固，有實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明該菌圈為錳氧化物［6］。此外JFM、JFM8、JFM6錐形瓶靜止5min即出現(xiàn)了沉淀，10min后沉淀與上清液已經(jīng)出現(xiàn)明顯的分離。JFM6錐形瓶中的培養(yǎng)基培養(yǎng)前后變化見圖1。

培養(yǎng)過程中各培養(yǎng)基對(duì)錳離子的去除率變化見圖2，從圖中可以看出JFM、JFM8和JFM6對(duì)錳的去除率最高，2 d后去除率即達(dá)到90%以上，而JFM4、JFM2和JFM0對(duì)錳的去除率較低，2 d后去除率分別為71%、43%、10%。第三天和第四天錐形瓶的去除率基本上維持恒定，沒有再變化。從而確定JFM、JFM8和JFM6是適合自養(yǎng)型錳氧化菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，考慮到JFM和JFM8中檸檬酸鐵銨的濃度較高，故采用JFM6培養(yǎng)基培養(yǎng)自養(yǎng)型錳氧化菌。

圖1　JFM 6錐形瓶搖床培養(yǎng)前后變化

圖2　不同培養(yǎng)基對(duì)自養(yǎng)型錳氧化菌的除錳率

2.2活性污泥的預(yù)處理

取20 ml活性污泥混合液，加入含有100 mlNaCl（0.8%）溶液的150ml錐形瓶中，加數(shù)粒玻璃珠，置于180 r/min搖床震蕩20 min，沉淀10 min，取上部懸濁液30 ml進(jìn)行離心分離。將30 ml懸濁液分別注入3個(gè)離心管，每個(gè)離心管中均含有10 ml懸濁液，將離心管置于3 000 r/min的離心機(jī)中離心10min，倒掉上清液，每個(gè)離心管均用NaCl（0.8%）溶液懸浮成10ml菌液備用。

2.3自養(yǎng)型錳氧化菌的篩選

采用JFM6培養(yǎng)基篩選自養(yǎng)型除錳菌：共4個(gè)150 ml錐形瓶，編號(hào)為0#、1#、2#、3#，每瓶含有100 ml的培養(yǎng)基。將滅菌后的培養(yǎng)基置于無菌操作臺(tái)上，打開紫外和通風(fēng)，進(jìn)行二次滅菌。待培養(yǎng)基冷卻至室溫時(shí)，將制備好的3個(gè)10 ml的菌液分別加入到編號(hào)為1#、2#、3#的錐形瓶中，3個(gè)錐形瓶為平行試驗(yàn)，0#錐形瓶中加入10 mlNaCl（0.8%） 溶液，作為空白試驗(yàn)。將錐形瓶置于室溫下160 r/min搖床上連續(xù)震蕩，7 d為一代，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每天同一時(shí)間檢測(cè)錐形瓶中錳濃度。

每代結(jié)束后更換新的培養(yǎng)基，接種上一代培養(yǎng)的菌液，接種量為10%，采用相同的方法進(jìn)行培養(yǎng)，循環(huán)下一代，直到自養(yǎng)型錳氧化菌擁有較高的除錳率，結(jié)束訓(xùn)化培養(yǎng)，篩選出高效自養(yǎng)型除錳菌。圖3為預(yù)處理的活性污泥在JFM6培養(yǎng)基中經(jīng)過2代的篩選過程中對(duì)錳的去除率的變化曲線圖。

圖3　利用JFM 6培養(yǎng)基對(duì)自養(yǎng)型錳氧化菌的篩選

由圖3可以看出，預(yù)處理的活性污泥在JFM6培養(yǎng)基中經(jīng)過兩個(gè)周期的培養(yǎng)，對(duì)錳的去除率都表現(xiàn)為先增高后平穩(wěn)的趨勢(shì)。其中第一周期的第一天錳氧化菌對(duì)錳基本上沒有去除率，分析原因是錳氧化菌從活性污泥到JFM6培養(yǎng)基，環(huán)境改變太大，大部分錳氧化細(xì)菌還不適應(yīng)培養(yǎng)基環(huán)境，生長(zhǎng)緩慢，對(duì)錳基本沒有去除作用。第二天時(shí)，錳的去除率開始升高，錳氧化細(xì)菌開始適應(yīng)培養(yǎng)基的環(huán)境，其他不適應(yīng)JFM6培養(yǎng)基環(huán)境的雜菌開始死亡。第三天，錳的去除率呈直線上升，從13%上升到66%，表明錳氧化細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。第四天去除率上升緩慢，之后的3 d除錳率基本維持在78%，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)已被錳氧化細(xì)菌消耗完，且錳氧化細(xì)菌分泌的代謝物及其他死亡菌裂解出的有毒物質(zhì)抑制了錳氧化菌的新陳代謝，錳氧化菌進(jìn)入穩(wěn)定期。第二周期的除錳率較第一周期有所升高，最高達(dá)到了90%以上，較高的除錳率也說明自養(yǎng)型錳氧化菌已經(jīng)篩選培養(yǎng)成功。

2.4自養(yǎng)型錳氧化菌的表型鑒定

對(duì)篩選得到的高效自養(yǎng)型除錳菌進(jìn)行涂布平板實(shí)驗(yàn)，觀察自養(yǎng)型錳氧化菌的菌落特征并對(duì)自養(yǎng)型錳氧化菌進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)。

2.4.1涂布平板實(shí)驗(yàn)

配制固體培養(yǎng)基（JFM6培養(yǎng)基+1.5%的瓊脂），梯度稀釋JFM6中菌液稀釋倍數(shù)分別為10-3、10-4和10-5倍，然后取適量稀釋后的菌液均勻分散在平板表面，干燥后放在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行樣。

2.4.2革蘭氏染色

刮取培養(yǎng)皿中的少量菌落進(jìn)行涂片，然后經(jīng)過固定、初染、水洗、媒染、脫色、復(fù)染、水洗、干燥等一系列過程，放于光學(xué)顯微鏡下觀察，若菌體呈紫色則為革蘭氏陽性菌（G+），若菌體呈紅色則為革蘭氏陰性菌（G-）。

圖5　自養(yǎng)型除錳菌革蘭氏染色

觀察固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落，如圖4，發(fā)現(xiàn)有3種不同形態(tài)特征的菌落，分別命名為J-1、J-2、J-3。挑取菌落對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)。表2為自養(yǎng)型除錳菌菌落特征和細(xì)菌形態(tài)。

表2　自養(yǎng)型除錳菌菌落特征和細(xì)菌形態(tài)

2.5自養(yǎng)型錳氧化菌的菌種鑒定

對(duì)培養(yǎng)得到的高效自養(yǎng)型錳氧化菌采用分子遺傳學(xué)鑒定法，通過PCR技術(shù)和16S rDNA測(cè)序，從核酸水平上鑒定自養(yǎng)型除錳菌菌種。

首先采用土壤DNA抽提試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，然后利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，以細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F-1492R對(duì)該菌的16S rDNA基因組進(jìn)行擴(kuò)增，之后對(duì)16S rDNA基因組進(jìn)行測(cè)序。最后通過NCBI軟件對(duì)該菌的16S rDNA基因序列進(jìn)行BLAST對(duì)比分析。其中16S rDNA基因組的PCR擴(kuò)增和測(cè)序均由青島擎科榟熙生物技術(shù)有限公司完成。

通過分析發(fā)現(xiàn)該高效自養(yǎng)型除錳菌涉及到Alcaligenes產(chǎn)堿桿菌科、Derxia德克斯氏菌屬、Pseudomonas假單胞菌屬、Nitrosomonadaceae亞硝化單胞菌科、Crenotrichaceae鐵細(xì)菌科5種不同的科屬。其中Derxia和Pseudomonas［7］屬于兼性自養(yǎng)菌。

2.5自養(yǎng)型錳氧化菌的除錳效果

對(duì)篩選得到的高效自養(yǎng)型錳氧化菌進(jìn)行傳代培養(yǎng)，探究其除錳效果。具體操作為：對(duì)篩選得到的菌液進(jìn)行離心分離，調(diào)轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，時(shí)間為10min，棄掉90%的上清液，然后用NaCl （0.8%）溶液將沉淀懸浮為10ml，添加到100ml新的培養(yǎng)基中，室溫下放在160 r/min搖床上連續(xù)震蕩培養(yǎng)，每天檢測(cè)培養(yǎng)基中剩余的錳濃度，探究其除錳效果。圖6為篩選得到的自養(yǎng)型錳氧化菌在JFM6培養(yǎng)基中經(jīng)過2個(gè)周期的培養(yǎng)過程中，對(duì)錳的去除效果的變化曲線圖。

圖6　自養(yǎng)型錳氧化菌的除錳效果

從圖6可以看出，自養(yǎng)型錳氧化菌在兩個(gè)周期的傳代培養(yǎng)過程中，最終除錳率都能達(dá)到90%以上，具有良好的除錳效果。且兩個(gè)周期培養(yǎng)過程中錳氧化菌的適應(yīng)期都僅為1 d，第二天便進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，最后4 d進(jìn)入穩(wěn)定期，兩個(gè)周期穩(wěn)定期的除錳率分別為94%和98%。

3　結(jié)論

（1）改變JFM培養(yǎng)基中檸檬酸鐵銨的濃度，選擇出最適合篩選、富集自養(yǎng)型除錳菌的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中檸檬酸鐵銨的濃度為6 g/L，其他成分含量均與JFM培養(yǎng)基一致。

（2）對(duì)篩選得到的高效自養(yǎng)型除錳菌進(jìn)行稀釋涂布平板培養(yǎng)，得到3種不同的菌落，分別為J-1、J-2和J-3，分別對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)自養(yǎng)型錳氧化菌為G-。

（3）對(duì)篩選得到的高效自養(yǎng)型除錳菌進(jìn)行16S rDNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)該菌種涉及到產(chǎn)堿桿菌科、德克斯氏菌屬、假單胞菌屬、亞硝化單胞菌科、鐵細(xì)菌科5種不同的科屬，其中德克斯氏菌屬、假單胞菌屬屬于兼性自養(yǎng)菌。

（4）對(duì)篩選得到的高效自養(yǎng)型錳氧化菌進(jìn)行傳代培養(yǎng)，研究其對(duì)錳離子的去除效果，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)周期的最高除錳率分別為94%和98%，說明篩選得到的自養(yǎng)型錳氧化菌具有良好的除錳效果。

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（編輯：程?。?/p>

A Research on Screening and Identifying Autotrophic M anganese-oxidizing Bacteria and M anganese Removal Effect

Hou Hexia
（Qingdao Technological University，Qingdao Shandong 266033，China）

The autotrophic biologicalmanganese removal filter can removemanganese in groundwater effectively.In order to get vaccinated strains of the filter and explore its effect ofmanganese removal，used the improved JFM medium to train the activated sludge from the aeration tank，and selected the efficient autotrophic manganese oxidation bacteria whosemanganese removal rate was above 90%.Three different negative bacteria colonies were obtained through plate culture and Gram stain，as well five different genera were found by 16S rDNA genome sequencing.After two cycles of subculture，the microbial manganese removal rate of the broth containing the above bacteria reached 98%.

autotrophicmanganese bacteria，screen，identify，16S rDNA，manganese removal

X523

A

1008-813X（2016）04-0085-05

2016-06-14

侯荷霞（1990-），女，山東省菏澤市人，青島理工大學(xué)建筑與土木工程專業(yè)（市政）在讀碩士研究生，主要從事水處理技術(shù)方面的研究工作。