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    液氮蒸汽熏蒸時(shí)間對(duì)犬精子冷凍效果的影響

    2016-09-23 10:12:22滑志民張似青趙熠群張陳華
    黑龍江動(dòng)物繁殖 2016年5期
    關(guān)鍵詞:頂體活率細(xì)管

    滑志民,張似青,趙熠群,張陳華,曾 暉,杜 波

    (上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)系,上海 201699)

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    液氮蒸汽熏蒸時(shí)間對(duì)犬精子冷凍效果的影響

    滑志民,張似青,趙熠群,張陳華,曾暉,杜波

    (上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)系,上海 201699)

    本試驗(yàn)研究了0.5 mL細(xì)管冷凍保存犬精液過(guò)程中液氮熏蒸時(shí)間對(duì)精子冷凍效果的影響。試驗(yàn)分為5組,將精液細(xì)管置于液氮液面上方2 cm處,分別熏蒸0 min(直接投入液氮)、1 min、2 min、4 min、8 min。解凍后通過(guò)活率、活力、畸形率及頂體完整率對(duì)精子進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果:液氮蒸汽熏蒸0 min和1 min組精子活率和活力顯著低于其它各組(P<0.05)。與直接投入液氮相比,在液氮蒸汽中預(yù)冷凍超過(guò)2 min能夠提高精子頂體完整率(P<0.05)。本試驗(yàn)表明在使用0.5 mL細(xì)管冷凍犬精子時(shí),液氮熏蒸時(shí)間在4~8 min較為適宜。

    犬;精子冷凍;液氮熏蒸

    犬精子冷凍技術(shù)可有效解決名貴種公犬稀少,跨地域配種,種公犬因腿傷不能配種等問(wèn)題,還可充分發(fā)揮種公犬的繁殖潛能,加快優(yōu)良基因的擴(kuò)散及種質(zhì)資源保存等。在我國(guó),犬采用冷凍精液人工授精還沒(méi)有廣泛開展,但也有一些研究和嘗試。在精液冷凍過(guò)程中降溫速度是影響冷凍效果的重要因素之一,有些研究已經(jīng)開始用程序降溫冷凍儀來(lái)精確控制冷凍降溫速度和過(guò)程,但多數(shù)還是用液氮熏蒸法冷凍犬的精液,該法操作簡(jiǎn)單,無(wú)需特殊冷凍設(shè)備。本試驗(yàn)就液氮熏蒸時(shí)間對(duì)犬精子冷凍效果進(jìn)行了研究。

    1 材料與方法

    1.1試驗(yàn)動(dòng)物

    試驗(yàn)犬為中型畢格公犬5只,2~6歲,健康,繁殖性能良好,均能正常采精。飼養(yǎng)于上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng),犬舍帶有運(yùn)動(dòng)場(chǎng),每日飼喂兩次商品犬糧,自由飲水。

    1.2主要器材和試劑

    0.5 mL細(xì)管(富士平)、顯微鏡(SMZ745,尼康公司)、顯微鏡用恒溫板(HW-1,金壇市宏華儀器廠),自動(dòng)精液分析儀(北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司)、恒溫臺(tái)(QB2000,海南其林貝爾儀器制造有限公司)、電熱恒溫水浴箱(HH-W420金壇市醫(yī)療儀器廠)、電子天平(AL204,梅特勒-托利多公司)。冷凍液配制所需藥品及試劑均購(gòu)自Sigma公司。

    1.3精液采集

    采用按摩法采精,每3 d采精1次。采精前用37°C無(wú)菌生理鹽水清洗包皮內(nèi)外,然后用一只手握住陰莖龜頭球部位進(jìn)行反復(fù)按摩,待其陰莖充分勃起射精后,另一手持無(wú)菌燒杯收集乳白色富含精子的部分。將燒杯中的精液轉(zhuǎn)移入無(wú)菌離心管,置于37°C水浴中保溫。經(jīng)鏡檢,活力達(dá)到0.7以上為合格精液,用于試驗(yàn)研究[1]。

    1.4精液冷凍保護(hù)液的配制

    將2.4 g三羥甲基氨基甲烷(Tris),1.4 mg/mL檸檬酸,0.8 g葡萄糖,5萬(wàn)IU青霉素,5萬(wàn)IU鏈霉素溶于100 mL純水中,用磁力攪拌器攪拌30 min混合均勻,過(guò)濾除菌備用。上述溶液配好后加入20%的卵黃和5%的甘油配成精液稀釋液。

    1.5精液稀釋與冷凍

    將采集的所有精液混合,精液密度儀測(cè)定密度,按照稀釋后密度為8×107個(gè)/mL來(lái)計(jì)算稀釋倍數(shù),采用二次稀釋法立即稀釋。首先將已預(yù)熱到37°C的稀釋液緩慢地注入到含有鮮精的試管中,精液與稀釋液比例為1∶1,緩慢搖勻后放入4 ℃冰箱平衡1.5 h,從冰箱中取出,加入4°C稀釋液,最終精子的密度調(diào)整為8×107個(gè)/mL,再次放入4 ℃冰箱平衡30 min,精液分裝于0.5 mL的細(xì)管中,封口,做好標(biāo)記,準(zhǔn)備冷凍。

    精液冷凍采用液氮熏蒸法預(yù)冷,將裝入精液的細(xì)管置于冷凍架上,細(xì)管與液氮面保持2 cm。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)置不同的熏蒸時(shí)間,熏蒸后投入液氮中保存1周以上。

    1.6精液的解凍與質(zhì)量評(píng)定

    將細(xì)管從液氮中取出,迅速投入37 ℃的水浴中,保持20 s解凍,顯微鏡下檢測(cè)精子活率和活力,通過(guò)Giemsa染色檢查精子畸形率和頂體完整率[1]。

    1.7試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    試驗(yàn)分為5組,根據(jù)細(xì)管在液氮蒸汽中熏蒸時(shí)間的不同分為:0 min(直接投入液氮)、1 min、2 min、4 min、6 min和8 min組。冷凍好的精子解凍后,檢查其活率、活力、畸形率和頂體完整率,來(lái)確定較適當(dāng)?shù)难魰r(shí)間。每組取3只細(xì)管解凍檢查,數(shù)據(jù)以3次平均值來(lái)表示。

    1.8數(shù)據(jù)分析

    數(shù)據(jù)分析應(yīng)用Excel軟件中的方差分析。

    2 結(jié)果

    通過(guò)表1可看出,液氮蒸汽預(yù)冷凍2 min、4 min、8 min三組間精子活率和精子活力沒(méi)有顯著差異(P>0.05),而三組均極顯著高于液氮蒸汽熏蒸0 min組(P<0.01),顯著高于液氮蒸汽熏蒸1 min組。同時(shí)液氮蒸汽熏蒸1 min組的精子活率和精子活力均顯著高于液氮蒸汽熏蒸0 min組(P<0.05)。

    表1液氮蒸汽熏蒸時(shí)間對(duì)精子活動(dòng)力的影響

    液氮蒸汽熏蒸時(shí)間/min01248精子活率/%3.26±0.58aA23.09±2.21bAB41.95±5.84cB49.20±3.96cB48.73±4.57cB精子活力/%2.48±0.39aA18.73±1.88bAB33.52±3.28cB42.83±4.02cB42.49±4.13cB

    注:同一行內(nèi)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),同一行內(nèi)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

    表2液氮蒸汽熏蒸時(shí)間對(duì)精子頂體和形態(tài)的影響

    形態(tài)檢查液氮蒸汽熏蒸時(shí)間/min01248頂體完整率/%26.59±3.56a37.93±5.79a58.46±5.73b61.18±5.04b60.62±3.68b畸形率/%29.39±2.87a31.76±2.02a33.58±3.37a35.37±3.52a36.21±3.98a

    注:同一行內(nèi)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

    由表2可知,在頂體完整率方面,液氮蒸汽熏蒸2 min、4 min、8 min三組無(wú)顯著差異(P>0.05),但三組均比液氮蒸汽熏蒸1 min和0 min組有顯著升高(P<0.05)?;温史矫?,各組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

    3 討論

    本試驗(yàn)表明,在使用0.5 mL細(xì)管冷凍保存犬精液時(shí),熏蒸0 min,即直接投入液氮,解凍后精子存活率和精子活力極低,分別只有3.26%和2.48%。而樣品即使在液氮蒸汽中熏蒸1 min,精子運(yùn)動(dòng)能力也顯著提高,精子存活率和精子活力達(dá)到了23.09%和18.73%,在液氮蒸汽預(yù)冷凍大于2 min,效果更顯著,精子活率達(dá)40%以上。這表明過(guò)于快速的降溫對(duì)精子會(huì)造成致死性的損傷。在熏蒸2 min以上各組精子頂體完整率較直接投入液氮也有顯著提高。精子的頂體是覆蓋于精子核前2/3以上區(qū)域的囊性結(jié)構(gòu),冷凍過(guò)程會(huì)導(dǎo)致精子質(zhì)膜和頂體受到不同程度的損傷。有研究認(rèn)為冷凍對(duì)犬精子頂體結(jié)構(gòu)破壞較牛精子更為嚴(yán)重,主要表現(xiàn)為頂體的空泡化和膨脹[3]。本試驗(yàn)表明,將犬精液細(xì)管不經(jīng)液氮蒸汽預(yù)冷凍,直接投入液氮,對(duì)精子頂體會(huì)造成較嚴(yán)重的損傷。在精液冷凍過(guò)程中,如果降溫速度太快,大量的水分會(huì)滯留在細(xì)胞中,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,細(xì)胞膜受損,進(jìn)而死亡。另外一方面,如果降溫速度太慢,細(xì)胞外液先形成冰晶,細(xì)胞內(nèi)水分子會(huì)向細(xì)胞外流動(dòng),細(xì)胞可能皺縮,胞內(nèi)溶質(zhì)濃度過(guò)高,也會(huì)對(duì)精子造成損害??傊?,合適的降溫速度是精液冷凍成功的關(guān)鍵因素之一。當(dāng)然,降溫速度通常還與細(xì)管的容量、冷凍保護(hù)液的成分、熏蒸時(shí)細(xì)管距液氮面的高度等因素有關(guān)。

    本試驗(yàn)表明,在使用0.5 mL細(xì)管冷凍犬精子時(shí),細(xì)管在距液氮面2 cm的情況下,液氮熏蒸時(shí)間不應(yīng)低于2 min,推薦熏蒸時(shí)間在4~8 min較為適宜。

    [1]高雅,羅桂河,李衛(wèi)東,等.不同濃度乙二醇和甘油對(duì)犬精液冷凍效果的影響[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(8):25-28.

    [2]劉璐,張劭俁,張彧,等.犬常規(guī)冷凍稀釋液中添加谷胱甘肽的研究[J].北京農(nóng)業(yè),2010,4月下旬刊:1-9.

    [3]Luberda Z.The role of glutathione in mammalian gametes[J].Reprod Biol,2005,5(1):5-17.

    2016-05-27

    上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院院內(nèi)科研課題(091124)

    滑志民(1979-),男,碩士,講師。研究方向:動(dòng)物繁殖調(diào)控與胚胎工程。

    E-mail:huazhimincn@163.com

    S829.2

    A

    1005-2739(2016)05-0014-03

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