茶葉聯(lián)苯菊酯原位降解菌株的微生物學(xué)特性研究

賀望興　胡桂萍　石旭平　曹揮華　朱運華　張國彪　歐陽雪靈　游艷紅　胡瑤根

(江西省蠶桑茶葉研究所　330202)

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茶葉聯(lián)苯菊酯原位降解菌株的微生物學(xué)特性研究

賀望興胡桂萍*石旭平曹揮華朱運華張國彪歐陽雪靈游艷紅胡瑤根

(江西省蠶桑茶葉研究所330202)

對前期富集馴化篩選得到的茶園聯(lián)苯菊酯降解微生物L(fēng)B-1進行最佳培養(yǎng)基、生長條件以及對環(huán)境的適應(yīng)性等微生物學(xué)特性分析。結(jié)果表明:菌株LB-1在牛肉膏蛋白胨加糖培養(yǎng)基、發(fā)酵溫度30℃、pH值為7、裝液量30mL的培養(yǎng)條件下生長最快。菌株LB-1在發(fā)酵培養(yǎng)基中呈S型生長，在高于2 %的氯化鈉濃度下大量死亡，表明LB-1對高鹽環(huán)境不具備良好的適應(yīng)性。

茶；聯(lián)苯菊酯降解菌；Klebsiella sp.；微生物特性

茶葉是我國一種重要的經(jīng)濟作物，2012年我國茶葉產(chǎn)量居世界第一，出口量居世界第二。隨著生活水平的提高，人們對茶葉食品安全問題越來越重視[1]。調(diào)查顯示農(nóng)藥殘留量超標(biāo)已成為當(dāng)前我國茶葉出口和內(nèi)銷最嚴(yán)重的質(zhì)量安全問題之一。聯(lián)苯菊酯是一種人工合成的菊酯類超高效殺蟲、殺螨劑，在我國是代替有機氯和其他劇毒性殺蟲劑的主要農(nóng)藥類型之一，其使用量僅次于有機磷，占世界殺蟲劑市場的 20%，占我國殺蟲劑施用面積的 1/3 以上[2～3]。但由于聯(lián)苯菊酯具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，農(nóng)作物利用率低，在環(huán)境中不易分解等特點，導(dǎo)致土壤環(huán)境和作物上聯(lián)苯菊酯殘留嚴(yán)重，嚴(yán)重危害到人類的健康和生態(tài)環(huán)境安全[4]。最新研究表明，聯(lián)苯菊酯還有蓄毒性，人和動物長期接觸會引起一些慢性疾病[5～6]，且具有致癌、致畸、致突變的危險[7～8]；

自然環(huán)境中殘留的農(nóng)藥主要是通過生物和非生物2種途徑來實現(xiàn)農(nóng)藥的降解和轉(zhuǎn)化[9]，而傳統(tǒng)的物理、化學(xué)農(nóng)藥降解方法，往往對儀器和試劑的要求高，成本高，且降解過程中易產(chǎn)生有毒物質(zhì)，造成二次污染。微生物降解農(nóng)殘因具有安全、綠色、高效和無二次污染等優(yōu)點，被認(rèn)為是處理農(nóng)藥殘留的一種新型有效的方法[10]。目前國內(nèi)外研究學(xué)者已篩選到大量菊酯類農(nóng)藥降解菌株，這些菌株歸屬于二十多個種屬[11]。研究發(fā)現(xiàn)微生物對農(nóng)藥的降解方式主要有酶促和非酶促兩種，且以酶促方式為主要形式。國外已有報道環(huán)境中的聯(lián)苯菊酯可以被微生物通過微生物自身酶系統(tǒng)以及分泌的代謝物作用而被分解[12～13]，國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)聯(lián)苯菊酯是被降解微生物作為有機碳源而降解，且聯(lián)苯菊酯濃度越高，微生物生長越好[14]。究其原因是微生物通過酶對農(nóng)藥分子的特殊毒性基團進行代謝，使其失去毒性，并在代謝過程中將農(nóng)藥分子當(dāng)作自身需要的碳源物質(zhì)，從中獲得生長所需的能量[15]。因此土壤微生物在聯(lián)苯菊酯的降解過程中發(fā)揮著重要作用[16～18]。

針對近年來我國茶產(chǎn)業(yè)中菊酯類農(nóng)藥超標(biāo)事件頻發(fā)，茶葉質(zhì)量安全現(xiàn)狀堪憂的問題，筆者開展了茶葉聯(lián)苯菊酯的農(nóng)藥殘留降解研究。實驗前期通過富集馴化篩選得到一株適合茶園聯(lián)苯菊酯降解的微生物L(fēng)B-1，克雷伯氏菌Klebsiella sp.，本實驗主要對其進行生物學(xué)分析及菌劑開發(fā)技術(shù)前期工藝研制，以期為進一步提高茶葉綠色清潔化生產(chǎn)技術(shù)水平，實現(xiàn)茶葉菊酯類農(nóng)藥殘留零超標(biāo)提供理論和技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L)(NA)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂15～20，pH 7.4～7.6。

牛肉膏蛋白胨加糖培養(yǎng)基(g/L)(NA+S)：牛肉膏3，蛋白胨10，葡萄糖 5，瓊脂15～20，pH 7.4～7.6。

富集培養(yǎng)基(g/L)(EM)：蛋白胨5，酵母提取物5，磷酸氫二鉀1，葡萄糖1，pH 7.0～7.2。

基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)基(g/L)(MSM)：磷酸氫二鈉1.5，磷酸二氫鉀1.5，硝酸四氫氮1，硫酸鎂0.2，氯化鈣0.01，硫酸鎂0.001，酵母提取物0.05，pH 7.0～7.2。

PDA培養(yǎng)基(g/L)(PDA)：馬鈴薯 200，葡萄糖 20，瓊脂 20，pH自然。

1.2實驗方法

1.2.1液體發(fā)酵最適培養(yǎng)基優(yōu)化

將已活化好的菌株LB-1分別以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量轉(zhuǎn)接到裝液量100mL的牛肉膏培養(yǎng)基、牛肉膏加糖培養(yǎng)基、富集培養(yǎng)基、基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基中，在30℃、150r/min條件下振蕩培養(yǎng)。在其他條件保持不變的情況下培養(yǎng)1d，進行單因素試驗。各單因素設(shè)計以不接種為對照，每個處理設(shè)3個重復(fù)，測定不同發(fā)酵培養(yǎng)基條件下菌株LB-1在ODnm600波長下的光密度值，確定菌株LB-1最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2.2生長條件優(yōu)化

將已活化好的菌株LB-1以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃、150r/min條件下振蕩培養(yǎng)。最佳液體發(fā)酵工藝條件試驗：分別通過改變發(fā)酵基本條件中溫度(15℃，25℃，30℃，35℃，45℃)、pH(2.0，4.0，6.0，7.0，8.0)、裝液量(20mL，30mL，50mL，80mL，100mL)，在其他條件保持不變的情況下培養(yǎng)1d，進行單因素試驗。各單因素設(shè)計以不接種為對照，每個處理設(shè)3個重復(fù)，測定不同發(fā)酵參數(shù)條件下菌株LB-1在ODnm600波長下的光密度值，確定菌株LB-1最佳生長條件。

1.2.3菌株LB-1生長曲線分析

用接種環(huán)取一環(huán)經(jīng)過平板活化的菌株LB-1至發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，在30℃、150r/min的條件下每隔2h取一次菌液，菌液在ODnm600波長下測定其光密度值，繪制菌株LB-1的生長曲線。

1.2.4菌株 LB-1對不同環(huán)境的適應(yīng)性

將已活化好的菌株LB-1分別以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量轉(zhuǎn)接到含不同NaCl濃度(1%,2%,4%,6%,8%)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃、150r/min條件下振蕩培養(yǎng)。在其他條件保持不變的情況下培養(yǎng)1d，進行單因素試驗。各單因素設(shè)計以不接種為對照，每個處理設(shè)3個重復(fù)，測定不同NaCl濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基條件下菌株LB-1在ODnm600波長下的光密度值，確定菌株LB-1對不同環(huán)境的適應(yīng)性。

2　結(jié)果與分析

2.1液體發(fā)酵最適培養(yǎng)基優(yōu)化

菌株LB-1液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果如圖1所示，菌株LB-1在NA+S培養(yǎng)基中生長最快，OD值為0.545；其次為NM培養(yǎng)基，OD值為0.507；然后是NA培養(yǎng)基，OD值為0.408；接著是PDA培養(yǎng)基，OD值為0.337；而在MSM培養(yǎng)基中生長最慢。這表明菌株LB-1偏好有機碳源和氮源，對無機碳氮利用性差。這可能與有機碳、氮源可以給微生物提供碳、氮源的同時還可以提供豐富的生長因子有關(guān)。

圖1　液體發(fā)酵最適培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2生長條件優(yōu)化

2.2.1發(fā)酵裝液量優(yōu)化

菌株LB-1發(fā)酵裝液量優(yōu)化結(jié)果如圖2所示，在裝液量達到30mL時，菌株LB-1生長最快，OD值為0.583；隨著裝液量的增加菌株LB-1的生長反而受到抑制，結(jié)果表明過多的裝液量會影響菌株LB-1的生長量，這可能是因為裝液量太多發(fā)酵液中溶氧量不足，菌生長過程中得不到充足的氧氣。綜合考慮可以確定菌株LB-1發(fā)酵最適裝液量為30mL。

2.2.2發(fā)酵液pH優(yōu)化

pH值與生物的生命活動以及新陳代謝密切相關(guān)，過高或過低的pH值都不利于微生物的代謝及生長速率，甚至可導(dǎo)致微生物死亡。菌株LB-1發(fā)酵液pH優(yōu)化結(jié)果如圖 3所示，LB-1在偏堿性條件下生長較好，其最適生長pH為7，OD值為0.445。當(dāng)pH值低于6時其生長明顯受到抑制，菌株 LB-1對堿性條件適應(yīng)性強的特點使之可適用于堿性土壤的修復(fù)，具有較大的應(yīng)用范圍。

圖2　裝液量優(yōu)化

圖3　發(fā)酵液pH優(yōu)化

2.2.3發(fā)酵溫度優(yōu)化

溫度主要通過影響菌生長、產(chǎn)物形成和合成方向等方面來影響發(fā)酵過程。發(fā)酵溫度是發(fā)酵生產(chǎn)中重要的影響因素，所以必須采用最適宜的溫度來進行發(fā)酵。菌株LB-1發(fā)酵液溫度優(yōu)化結(jié)果如圖4所示：LB-1在低溫和高溫環(huán)境中生長都不好，尤其在低溫環(huán)境下菌株LB-1生長幾乎停滯，隨著溫度的提高菌株LB-1生長開始復(fù)蘇，在 30 ℃的發(fā)酵溫度下LB-1生長最快，OD值為0.345，但發(fā)酵溫度再提高菌株LB-1開始衰亡，實驗結(jié)果可以確定其最適發(fā)酵溫度是30 ℃。

2.3菌株LB-1生長曲線分析

菌株LB-1生長曲線分析結(jié)果如圖5所示，菌株LB-1在發(fā)酵培養(yǎng)初期(0～2h)細菌由于主要在適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境以及為對數(shù)生長期的快速繁殖合成必要的前體物質(zhì)而生長緩慢，在2～16 h培養(yǎng)時間內(nèi)菌株處于對數(shù)生長期，該期間菌株LB-1快速繁殖，菌濃度越來越高；培養(yǎng)16 h之后菌株進入穩(wěn)定生長期，菌株生長量與死亡量相平衡，菌濃度變化不大；在培養(yǎng)20 h后由于培養(yǎng)液營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡以及有害次生代謝產(chǎn)物的積累導(dǎo)致菌株生長量低于死亡量，細菌進入衰亡期。

圖4　發(fā)酵溫度優(yōu)化

圖5　菌株LB-1生長曲線

2.4菌株LB-1對不同環(huán)境的適應(yīng)性

菌株LB-1對不同環(huán)境的適應(yīng)性結(jié)果如圖6所示，菌株LB-1在2 %的NaCl濃度下表現(xiàn)出最好的適應(yīng)性，OD值為0.418。隨著NaCl濃度的上升，LB-1的適應(yīng)性越來越差，尤其當(dāng)NaCl濃度高于6 %時，菌株LB-1的生長量最低，最低時OD值為0.07。研究結(jié)果顯示，菌株LB-1對高鹽環(huán)境不具備良好的適應(yīng)性，這可能是因為高鹽環(huán)境下菌株LB-1高度失水，導(dǎo)致了LB-1的死亡。

圖6　菌株 LB-1對不同環(huán)境的適應(yīng)性

3　結(jié)論與討論

實驗研究了降解聯(lián)苯菊酯菌株LB-1的最適生長培養(yǎng)基、生長條件、生長曲線以及對不同環(huán)境的適應(yīng)性，以期為今后的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用提供理論參數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，菌株LB-1以牛肉膏蛋白胨加糖培養(yǎng)基，在發(fā)酵溫度30℃、pH值為7、裝液量30 mL的培養(yǎng)條件下生長最快；菌株LB-1在發(fā)酵培養(yǎng)基中呈S型生長，在發(fā)酵2～16h內(nèi)處于對數(shù)生長期，之后進入穩(wěn)定生長期，在培養(yǎng)20h后菌株進入衰亡期；菌株LB-1在高于2 %的氯化鈉濃度下大量死亡，表明LB-1對高鹽環(huán)境不具備良好的適應(yīng)性。

最適發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果與李清云等[20]報道的菊酯降解菌GF31最適碳源為葡萄糖、最適有機氮源為牛肉膏、且在有機氮源的生長情況普遍比無機氮源好的結(jié)果相一致。生長條件優(yōu)化實驗結(jié)果與高亞楠等[19]、李清云等[20]報道的高效菊酯降解菌的最適發(fā)酵溫度27℃、pH值為7、裝液量40mL基本相符。這表明菊酯類降解菌具有某種對環(huán)境條件的相似性。針對實驗室環(huán)境條件與室外將降解菌噴灑在茶葉上降解農(nóng)殘有很大區(qū)別，降解菌LB-1如何在室外茶園中發(fā)揮相同功效，將是接下來深入研究的方向。

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公益性項目(No.201303094)；江西省科技支撐計劃(20151BBA13042)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303094-08)。