UPLC-MS/MS法同時檢測人血漿中唑吡坦、右佐匹克隆和扎來普隆的方法研究Δ

魏　欣，安　靜，吳　茵，董占軍，范理菊，白萬軍（河北省人民醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊　050051）

·臨床藥學(xué)與研究·

UPLC-MS/MS法同時檢測人血漿中唑吡坦、右佐匹克隆和扎來普隆的方法研究Δ

魏欣＊，安靜，吳茵，董占軍#，范理菊，白萬軍（河北省人民醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊050051）

目的：建立快速、準確、可同時檢測人血漿中唑吡坦、右佐匹克隆和扎來普隆的分析方法。方法：血漿樣品經(jīng)液-液萃取后，以卡馬西平為內(nèi)標，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測。色譜柱為WatersACQUITY UPLC HSS T3，流動相為0.1%氨水-乙腈（梯度洗脫），流速為0.2 ml/min，柱溫為40℃，進樣量為5 μl。采用電噴霧離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測方式進行正離子掃描，用于定量分析的離子對分別為m/z 308.2→263.1（唑吡坦）、m/z 389.3→245.0（右佐匹克?。?、m/z 306.2→236.1（扎來普?。?、m/z 237.3→151.2（內(nèi)標）。結(jié)果：唑吡坦、右佐匹克隆、扎來普隆血藥濃度分別在0.02～20.00、0.50～20.00、0.02～20.00 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r分別為0.990 1、0.996 8、0.991 7），定量下限分別0.02、0.50、0.02 ng/ml，檢測限分別為0.01、0.20、0.01 ng/ml；日內(nèi)、日間RSD＜15%，提取回收率為88.9%～106.5%，基質(zhì)效應(yīng)為94.8%～106.3%。結(jié)論：該方法簡便、快速、靈敏度高、專屬性好，可用于人血漿中唑吡坦、右佐匹克隆和扎來普隆的同時檢測。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；唑吡坦；右佐匹克?。辉鷣砥章。粰z測

1　材料

1.1儀器

LC-30AD型超高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）；AB Sciex Triple Quad 5500型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB公司）；Zentrifuge 1602型高速低溫離心機（德國Hettich公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AB204-S標準型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；XW-80A型旋渦混合器（上海精科實業(yè)有限公司）。

1.2藥品與試劑

唑吡坦對照品（批號：171258-200601，純度：99.0%）、右佐匹克隆對照品（批號：100871-200801，純度：100.0%）、扎來普隆對照品（批號：100670-200401，純度：98.5%）、卡馬西平對照品（內(nèi)標，批號：100142-201105，純度：99.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、甲酸、甲酸銨均為色譜純，氫氧化鈉為分析純，水為純凈水?？瞻籽獫{來源于我院體檢中心。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：0.1%氨水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1.00 min，70%A；＞1.00～6.00 min，70%A→10%A；＞6.00～7.00 min，10%A；＞7.00～7.01 min，10%A→70%A；＞7.01～10.00 min，70%A）；流速：0.2 ml/min；柱溫：40℃；進樣量：5 μl。

采用電噴霧離子源（ESI），以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式掃描，正離子方式檢測。電噴霧電壓（IS）：5 500V；離子源溫度（TEM）：650℃；氣簾氣（CUR）壓力：35 psi；碰撞氣（CAD）壓力：8 kPa；輔助氣1（GS1）壓力：65 psi；輔助氣2（GS2）壓力：65 psi；射入電壓（EP）：10 V；射出電壓（CXP）：14 V；其余質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1　質(zhì)譜參數(shù)Tab 1　Parameters of mass spectrometry

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液精密稱取各對照品適量，分別置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得唑吡坦、右佐匹克隆、扎利普隆質(zhì)量濃度約為1 mg/ml的對照品貯備液，置－20℃冰箱中保存。精密吸取各對照品貯備液適量，置于同一量瓶中，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 mg/ml的混合對照品貯備液，并逐級稀釋成質(zhì)量濃度為200、100、50、10、5、2、1、0.5、0.2 ng/ml的系列混合對照品溶液。

2.2.2內(nèi)標溶液精密稱取內(nèi)標對照品適量，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1 mg/ml的內(nèi)標貯備液，置－20℃冰箱中保存。精密吸取內(nèi)標貯備液適量，置于100 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為10 μg/ml的內(nèi)標溶液，備用。

2.3血漿樣品處理

取血漿0.1 ml，置于1.5 ml塑料離心管中，加入內(nèi)標溶液10 μl，渦旋混勻15 s，加入0.01 mol/L氫氧化鈉溶液10 μl，渦旋混勻15 s，加入萃取溶液[二氯甲烷-正己烷-乙酸乙酯（5∶4∶1，V/V/V）]400 μl，渦旋混勻1 min，以離心半徑5 cm、轉(zhuǎn)速14 000 r/min高速離心5 min，取上清液，用氮氣吹干，殘渣用80%乙腈復(fù)溶，取5 μl進樣分析。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1專屬性考察通過比較空白血漿與含藥血漿樣品，考察內(nèi)源物質(zhì)是否會對檢測造成影響。結(jié)果顯示，在“2.1”項色譜與質(zhì)譜條件下，內(nèi)源性物質(zhì)無明顯干擾，唑吡坦、右佐匹克隆、扎來普隆與內(nèi)標峰形良好，保留時間分別為5.75、5.25、5.35 min。其典型色譜圖見圖1。

2.4.2標準曲線制備和定量下限考察取空白血漿及相應(yīng)質(zhì)量濃度的混合對照品溶液各適量，分別配制成相當于唑吡坦質(zhì)量濃度為0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、5.00、10.00、16.00、20.00 ng/ml，右佐匹克隆質(zhì)量濃度為0.50、1.00、5.00、10.00、16.00、20.00 ng/ml，扎來普隆質(zhì)量濃度為0.02、0.05、0.10、0.20、 0.50、1.00、5.00、10.00、16.00、20.00 ng/ml的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣測定，記錄色譜圖。以待測物質(zhì)量濃度（x）為橫坐標、待測物與內(nèi)標峰面積的比值（y）為縱坐標，用加權(quán)最小二乘法（加權(quán)系數(shù)w=1/x2）進行線性回歸，得回歸方程分別為——唑吡坦：y唑=1.650 0x唑+0.014 1（r=0.990 1，n= 3）；右佐匹克?。簓右=0.020 8x右－0.000 4（r=0.996 8，n=3）；扎來普?。簓扎=0.400 0x扎+0.003 4（r=0.991 7，n=3）。結(jié)果表明，唑吡坦、右佐匹克隆、扎來普隆血藥濃度分別在0.02～20.00、0.50～20.00、0.02～20.00 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r＞0.990；其定量下限分別為0.02、0.50、0.02 ng/ml，檢測限分別為0.01、0.20、0.01 ng/ml。

圖1　典型色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+待測物+內(nèi)標；1.唑吡坦；2.右佐匹克隆；3.扎來普隆；4.內(nèi)標Fig 1　Typical chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+analyte+internal standard；1.zolpidem；2.eszopiclone；3.zaleplon；4.internal standard

2.4.3精密度與準確度試驗分別配制唑吡坦低、中、高質(zhì)量濃度（0.05、0.50、16.00 ng/ml，下同）的血漿樣品，右佐匹克隆低、中、高質(zhì)量濃度（0.50、5.00、16.00 ng/ml，下同）的血漿樣品，扎來普隆低、中、高質(zhì)量濃度（0.05、0.50、16.00 ng/ml，下同）的血漿樣品各5份，連續(xù)測定3 d，根據(jù)當日標準曲線計算各待測物的實測質(zhì)量濃度，考察各質(zhì)量濃度下的精密度與準確度。結(jié)果顯示，三者日內(nèi)、日間RSD＜15%，回收率為88.6%～112.2%，表明方法的精密度、準確度良好。精密度與準確度試驗結(jié)果見表2。

2.4.4提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗分別配制唑吡坦、右佐匹克隆、扎來普隆低、中、高質(zhì)量濃度的血漿樣品，每質(zhì)量濃度取5樣本分析，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，記錄相應(yīng)峰面積（C）。取空白血漿適量，按“2.3”項下方法處理后加入適量相應(yīng)質(zhì)量濃度的對照品溶液，使最終質(zhì)量濃度與前者相對應(yīng)，每質(zhì)量濃度取5樣本分析，記錄相應(yīng)峰面積（B）。取相應(yīng)質(zhì)量濃度的對照品溶液適量，不經(jīng)處理，直接進樣分析，記錄相應(yīng)峰面積（A）。按公式：提取回收率（%）=C/B×100%、基質(zhì)效應(yīng)（%）=B/A×100%計算。結(jié)果顯示，唑吡坦、右佐匹克隆和扎來普隆的提取回收率為88.9%～106.5%，內(nèi)標的提取回收率為90.3%；基質(zhì)效應(yīng)為94.8%～106.3%，內(nèi)標的基質(zhì)效應(yīng)為104.3%，符合生物樣品檢測要求[4]。提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗結(jié)果見表3。

表2　精密度與準確度試驗結(jié)果（±s）Tab 2　Results of precision and accuracy tests（±s）

表2　精密度與準確度試驗結(jié)果（±s）Tab 2　Results of precision and accuracy tests（±s）

?

表3　提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗結(jié)果（n=5）Tab 3　Results of extraction recovery and matrix effect tests （n=5）

2.4.5穩(wěn)定性試驗配制唑吡坦、右佐匹克隆和扎來普隆低、高質(zhì)量濃度的血漿樣品，分別考察在室溫下放置24 h和經(jīng)歷3次凍融循環(huán)（－20℃～20℃）后的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，各樣品的RSD＜15%，表明各待測物在上述條件下穩(wěn)定。穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表4。

表4　穩(wěn)定性試驗結(jié)果（±s， n=3）Tab 4　Results of stability tests（±s， n=3）

表4　穩(wěn)定性試驗結(jié)果（±s， n=3）Tab 4　Results of stability tests（±s， n=3）

待測物唑吡坦右佐匹克隆扎來普隆理論質(zhì)量濃度，ng/ml 0.05 16.00 0.50 16.00 0.05 16.00室溫放置24 h實測質(zhì)量濃度，ng/ml 0.048±0.006 15.756±1.789 0.484±0.037 15.928±1.327 0.048±0.005 15.918±1.121 RSD，% 11.68 11.35 07.69 08.33 10.29 07.04經(jīng)歷3次凍融循環(huán)實測質(zhì)量濃度，ng/ml 0.052±0.049 15.962±1.198 0.503±0.022 15.141±1.255 0.047±0.004 15.380±1.475 RSD，% 5.84 7.51 4.29 8.32 8.93 9.59

3　討論

3.1檢測方法比較

目前，國內(nèi)外主要采用氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]、氣質(zhì)聯(lián)用法[7]、液質(zhì)聯(lián)用法[8-9]等對NBZD血藥濃度進行檢測。這些方法或多或少存在靈敏度低、樣品處理過程復(fù)雜、分析時間長等問題。有文獻報道，采用熒光色譜法（HPLC-FLU法）測定人血漿中唑吡坦的濃度，靈敏度雖有很大提高，但操作過程繁雜，系統(tǒng)誤差大，而且進樣體積大，色譜柱耐受性差[10-12]。吳海等[13]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法同時測定了家兔全血中佐匹克隆、唑吡坦和扎來普隆的濃度，但其分析時間長，檢測限為1～3 ng/ml。

UPLC-MS/MS法集液相色譜的高分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度、強結(jié)構(gòu)定性等特征于一體，具有專屬性強、快速、靈敏、準確、可靠等優(yōu)點，是化學(xué)成分定性定量分析的有力工具。本研究采用UPLC-MS/MS法快速、準確地檢測人血漿唑吡坦、右佐匹克隆和扎來普隆的濃度，可應(yīng)用于臨床和法醫(yī)毒物相關(guān)物質(zhì)的檢測、鑒定[14]，為急診科和法醫(yī)鑒定此類藥物中毒提供了技術(shù)支持，同時也為治療藥物監(jiān)測及臨床合理用藥提供了參考依據(jù)。

3.2液-液萃取條件的選擇

前期試驗比較了不同萃取時間（0.5、1、2、3、4、5 min）對3種待測物提取回收率的影響，結(jié)果表明，各萃取時間下提取回收率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。為保證萃取效率，最終將萃取時間確定為1 min。前期試驗還比較了0、0.01、0.02、0.05、0.10 mol/L氫氧化鈉溶液對萃取的影響，結(jié)果表明，當氫氧化鈉濃度為0.01 mol/L時，3種待測物均有較高的萃取率，提示低濃度的堿性萃取液有利于該類物質(zhì)的萃取，故最終將氫氧化鈉的濃度確定為0.01 mol/L。此外，試驗還考察了不同體積（100、200、400、600 μl）萃取溶劑（二氯甲烷-正己烷-乙酸乙酯）對萃取效率的影響，結(jié)果顯示，隨著萃取溶劑體積的增加，各待測物提取回收率也隨之增大，故最終將萃取溶劑的體積確定為400 μl。

綜上，本試驗建立了同時檢測人血漿中唑吡坦、扎來普隆和右佐匹克隆的UPLC-MS/MS法，該方法具有操作簡便、靈敏度高、檢測快速等特點，可用于人血漿中NBZD的同時檢測。

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（編輯：張元媛）

Study on Simultaneous Determination Method of Zolpidem，Dexzopiclone and Zaleplon in Human Plasma by

UPLC-MS/MS
WEI Xin，AN Jing，WU Yin，DONG Zhanjun，F(xiàn)AN Liju，BAI Wanjun（Dept.of Pharmacy，Hebei Provincial People’s Hospital，Shijiazhuang 050051，China）

OBJECTIVE：To develop a method for rapid，accurate and simultaneous determination of dexzopiclone，zolpidam and zaleplon in human plasma.METHODS：After the plasma sample was processed by liquid-liquid extraction，UPLC-MS/MS was established to detect plasma sample with carbamazepine as internal standard.The separation was performed on a Waters ACQUITY UPLC HSS T3column with mobile phase composed of 0.1%ammonium solution-acetonitrile（gradient elution）at flow rate of 0.2 ml/min.The column temperature was set at 40℃，and sample size was 5 μl.The detection was performed by multiple reaction monitoring（MRM）via electrospray ionization（ESI）source in positive mode.The mass transition ion-pairs were as follows：m/z 308.2→263.1（zolpidem），m/z 389.3→245.0（dexzopiclone），m/z 306.2→236.1（zaleplon），m/z 237.3→151.2（internal standard）.RESULTS：The linear range of zolpidem，dexzopiclone and zaleplon were 0.02-20.00，0.50-20.00，0.02-20.00 ng/ml，respectively （r=0.990 1，0.996 8，0.991 7）.LLOQ of them were 0.02，0.50，0.02 ng/ml，and detection limit were 0.01，0.20，0.01 ng/ml.RSDs of intra-day and inter-day were all lower than 15%；extraction recovery were 88.9%-106.5%；matrix effect were 94.8%-106.3%.CONCLUSIONS：The method is simple，rapid，sensitive and specific，and it can be used for simultaneous determination of zaleplon，zolpidem and dexzopiclone in human plasma.

UPLC-MS/MS；Zolpidem；Dexzopiclone；Zaleplon；Determination

R917文獻標志碼A

1001-0408（2016）23-3194-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.23.09

河北省科技計劃項目（No.14273002D）

＊副主任藥師，碩士。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：0311-85988004。E-mail：13933171365@163.com

主任藥師，博士。研究方向：臨床藥學(xué)、藥理學(xué)。電話：0311-85988604。E-mail：13313213656@126.com

2016-01-17

2016-05-13）