超聲波強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解的研究進(jìn)展

胡芳 董旭 史長偉 吳學(xué)棟

（1. 齊齊哈爾大學(xué)輕工與紡織學(xué)院，齊齊哈爾 161006；2. 亞麻加工技術(shù)教育部工程研究中心，齊齊哈爾 161006）

能源需求不斷增加，而化石燃料儲(chǔ)量日益減少，使得可再生能源越來越受到關(guān)注。生物乙醇是世界上使用最多的生物燃料［1］，可與汽油、柴油等原油衍生液體運(yùn)輸燃料混合使用。作為能源安全和氣候變化問題的共同解決方案，是近年來非?；钴S的研究領(lǐng)域。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，如農(nóng)林業(yè)廢棄物和部分城市固體廢物，是可再生的、豐富的、廉價(jià)的第二代生物乙醇生產(chǎn)原料。第二代生物乙醇的生產(chǎn)涉及4個(gè)步驟，包括木質(zhì)纖維素的預(yù)處理、纖維素酶解成可發(fā)酵糖、可發(fā)酵糖經(jīng)發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乙醇和蒸餾。雖然原料的收購價(jià)格比化石燃料具有競爭力，但利用現(xiàn)有技術(shù)將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為生物乙醇的成本仍然很高。酶法糖化路線約占過程總成本的20%，這一步驟具有創(chuàng)新和降低成本的潛力［2］。近年來，超聲波在酶催化生物轉(zhuǎn)化中得到了廣泛的應(yīng)用，具有短時(shí)間內(nèi)強(qiáng)化反應(yīng)過程、提高產(chǎn)率、降低能耗、更好地利用原料和催化劑等顯著優(yōu)點(diǎn)［3］。很多研究人員提出利用超聲波強(qiáng)化的策略，有大量文獻(xiàn)報(bào)道，超聲波強(qiáng)化的木質(zhì)纖維素酶解提高了可發(fā)酵糖及生物乙醇的產(chǎn)率，并對(duì)強(qiáng)化機(jī)理進(jìn)行了不同側(cè)面的探索。本文綜述了超聲波強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解的應(yīng)用進(jìn)展，并著重對(duì)超聲波強(qiáng)化酶解的機(jī)理進(jìn)行了分析，旨在為該領(lǐng)域的深入研究提供參考。

1 木質(zhì)纖維素酶解過程及限制酶解的因素

木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，纖維素是葡萄糖單元通過 β-1，4糖苷鍵連接的線型高分子量聚合物。纖維素中存在的羥基形成分子間和分子內(nèi)氫鍵，其超分子結(jié)構(gòu)由結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)組成，結(jié)晶區(qū)分子排列規(guī)則且緊密，多糖鏈穩(wěn)定性強(qiáng)，難于降解；而無定形區(qū)分子排列無規(guī)則且疏松，反應(yīng)性能較高。半纖維素是高度分支的、由多種糖基構(gòu)成的不均一聚合物，是無定形的。木質(zhì)素是高度支化的芳香族聚合物，具有疏水性，由苯丙烷結(jié)構(gòu)單元組成，與半纖維素共價(jià)交聯(lián)結(jié)合，緊密地嵌入纖維素纖維。

1.1 酶解過程

酶催化纖維素水解過程涉及3類酶：內(nèi)切葡聚糖酶（EC 3.2.1.4）、外切葡聚糖酶（CBH I，EC 3.2.1.176 ；CBH II，EC 3.2.1.91）和 β-D-葡萄糖苷酶（或稱纖維二糖酶）（EC 3.2.1.21），它們以相互作用的方式對(duì)纖維素進(jìn)行水解［4-5］。纖維素酶解為多步非均相反應(yīng)，不溶性纖維素最初通過內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的協(xié)同作用在固液界面分解。內(nèi)切葡聚糖酶啟動(dòng)纖維素水解過程，破壞纖維素鏈無定形區(qū)域的內(nèi)部糖苷鍵，增加纖維素鏈末端數(shù)量；然后兩種類型的外切葡聚糖酶從纖維素鏈的還原性末端或非還原性末端分離出纖維二糖。以上過程伴隨著可溶性中間產(chǎn)物的進(jìn)一步液相水解。最后，纖維二糖酶將纖維二糖轉(zhuǎn)化為可由酵母菌或細(xì)菌發(fā)酵成乙醇的D-葡萄糖。

除了以上3種主要的纖維素酶以外，還有許多輔助酶攻擊半纖維素［6］，如木聚糖酶切割木聚糖的主鏈；α-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶分別去除阿拉伯糖和4-O-甲基葡萄糖醛酸取代基；阿魏酰基酯酶攻擊阿拉伯糖取代基和阿魏酸之間的酯鍵。提高酶用量，可以獲得較高的糖產(chǎn)量，但同時(shí)導(dǎo)致成本增加，為了避免這一點(diǎn)，可以利用纖維素酶與其他酶之間的協(xié)同作用［7-8］。

1.2 限制酶解的因素

木質(zhì)纖維素不易被纖維素酶水解的主要原因是：（1）與纖維素共存的木質(zhì)素和半纖維素也是木質(zhì)纖維素生物質(zhì)酶解中的屏障，限制酶對(duì)纖維素的可及性［6，9］；（2）微晶纖維素的可及性低，阻礙了纖維素酶的有效作用［6，9］；（3）非均相反應(yīng)中的傳質(zhì)阻力［10-11］；（4）產(chǎn)物抑制作用［6，12］。

木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為生物乙醇的第一個(gè)步驟：預(yù)處理，采用機(jī)械粉碎、稀酸預(yù)處理、堿預(yù)處理、水熱法、氧化法、氨爆破、蒸汽爆破、有機(jī)溶劑預(yù)處理、離子液體預(yù)處理和生物法等［13］，可提高底物比表面積、降低纖維素結(jié)晶度、破壞木質(zhì)素和半纖維素的屏障，從而促進(jìn)纖維素的水解反應(yīng)［14］。雖然預(yù)處理去除了部分木質(zhì)素和半纖維素，但為了提高酶解的總糖收率，總會(huì)有部分木質(zhì)素和半纖維素保留在原料中，并影響酶解過程［15-16］。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶轉(zhuǎn)化涉及從液體介質(zhì)向固體底物表面的傳質(zhì)，由于這種傳質(zhì)是由擴(kuò)散控制的，所以酶解的總反應(yīng)速率由酶大分子的擴(kuò)散速率控制。一般來說，大型三維酶分子的擴(kuò)散速率很低，這大大阻礙了水解反應(yīng)的整體速率。使用纖維素酶的一個(gè)重要限制是，可溶性產(chǎn)物（纖維二糖和葡萄糖）的抑制作用降低了反應(yīng)速率。減少產(chǎn)物抑制作用的措施，包括水解過程中補(bǔ)充β-D-葡萄糖苷酶、添加纖維二糖脫氫酶、或采用同步糖化發(fā)酵（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）工藝［6］。

2 超聲波強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解的應(yīng)用

超聲波強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解，主要由以下幾個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)：超聲波預(yù)處理酶-底物、超聲波強(qiáng)化糖化、超聲波強(qiáng)化SSF、超聲波強(qiáng)化產(chǎn)酶過程，其中文獻(xiàn)報(bào)道最多的是超聲波強(qiáng)化糖化過程，如表1所示。

表1 超聲波強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解的應(yīng)用Table 1 Applications of ultrasound intensification for enzymatic hydrolysis of lignocellulose

表1續(xù)表 Continued

Silvello等［1］利用超聲波對(duì)酶-底物進(jìn)行預(yù)處理，然后在50℃、300 r/min條件下水解24 h。超聲波預(yù)處理的最佳條件為150.7 W/cm2、20 kHz、330 s和25℃，纖維素酶活性提高了42.35%，還原糖濃度達(dá)到對(duì)照樣的1.9倍。Subhedar 等［17］利用廢報(bào)紙酶解生產(chǎn)可發(fā)酵糖，并與常規(guī)酶解進(jìn)行了比較。在相同的底物濃度下，常規(guī)酶解的條件為：酶用量0.14%（W/V）、水解72 h，還原糖得率11.569 g/L；以超聲波輔助酶解，酶用量0.08%（W/V）、水解6.5 h、還原糖產(chǎn)量27.6 g/L。超聲波強(qiáng)化使酶解時(shí)間大大縮短，酶用量顯著減少，還原糖的釋放濃度達(dá)到對(duì)照樣的2.4倍。Subhedar等［18］以花生殼、椰子殼和開心果殼3種木質(zhì)纖維素生物質(zhì)為原料，超聲波輔助堿預(yù)處理后進(jìn)行常規(guī)酶解和超聲波輔助酶解，得到了相似的結(jié)果。Borah等［23］利用超聲波促進(jìn)雜草酶解過程，超聲波代替機(jī)械攪拌可以使水解動(dòng)力學(xué)提高近10倍，機(jī)械攪拌120 h與超聲處理10 h獲得了相同的糖產(chǎn)量。Gasparotto等［27］研究了固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶在直接和間接超聲波作用下對(duì)未經(jīng)處理蔗渣的酶解，認(rèn)為間接超聲波是更有前途的輔助酶反應(yīng)技術(shù)。

研究者們還進(jìn)行了超聲波強(qiáng)化SSF工藝［26，29-30］和超聲波強(qiáng)化微生物生產(chǎn)纖維素酶［26］的研究。SSF工藝具有操作條件溫和、發(fā)酵罐單一、水解和發(fā)酵兩步結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)。在SSF過程中，發(fā)酵微生物消耗生物質(zhì)中纖維素酶解釋放的己糖，降低糖化產(chǎn)物對(duì)酶的抑制作用，也降低了侵入性微生物污染的可能性。與傳統(tǒng)的兩步法相比，SSF工藝更加節(jié)能。然而，SSF工藝的一個(gè)主要問題是酶解的最佳溫度（50-55℃）與發(fā)酵的最佳溫度（30-35℃）之間的不同，因此SSF過程的主要限制是兩個(gè)獨(dú)立過程的最佳條件的折衷。Ofori-Boateng等［30］以棕櫚葉為原料，在超聲波-有機(jī)溶劑預(yù)處理后，在200 W、37 kHz、培養(yǎng)時(shí)間5 h、40℃、pH值5、酵母濃度15 g/L、固體負(fù)荷10%（W/V）條件下進(jìn)行SSF工藝，得到最大乙醇濃度18.2 g/L，產(chǎn)率57%。在相同的條件下，進(jìn)行無超聲波處理SSF工藝，生物乙醇濃度（3.1 g/L）和產(chǎn)率（14.0%）較低，常規(guī)SSF工藝需要超過24 h才能獲得高生物乙醇產(chǎn)量，而超聲波輔助SSF工藝在短時(shí)間和高固體負(fù)載下可顯著提高生物乙醇的產(chǎn)量。Singh等［29］在超聲波輔助下，利用銀膠菊，采用SSF生產(chǎn)生物乙醇，研究發(fā)現(xiàn)，在30℃下，發(fā)酵時(shí)間18.3 h后，乙醇濃度提高到15.62 g/L，乙醇產(chǎn)率為0.4 g/g預(yù)處理生物質(zhì)；無超聲波SSF實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵54 h后，乙醇濃度最高為10.57 g/L，乙醇產(chǎn)量為0.27 g/g預(yù)處理生物質(zhì)。超聲波處理對(duì)SSF過程最顯著的影響是縮短了發(fā)酵時(shí)間。Velmurugan等［26］研究了超聲波對(duì)甘蔗渣培養(yǎng)里氏木霉產(chǎn)纖維素酶、酶解及SSF生產(chǎn)乙醇的影響。甘蔗渣培養(yǎng)里氏木霉分生孢子的萌發(fā)強(qiáng)度明顯提高，超聲波處理通過增強(qiáng)細(xì)胞分裂來增加分生孢子數(shù)量。超聲波強(qiáng)化酶解的葡萄糖濃度為23.5 g/L，而常規(guī)酶解為19.7 g/L。240 W超聲下，水解液中乙酸和糠醛的最大濃度分別為399 mg/L和109 mg/L，遠(yuǎn)低于抑制水平。在SSF實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定了超聲波輔助水解條件與釀酒酵母生長的相容性，在400 W下，超聲波刺穿了細(xì)胞；而240 W的超聲波不會(huì)使細(xì)胞破裂，從而提供了超聲波對(duì)發(fā)酵的積極作用。超聲波-SSF發(fā)酵速率比常規(guī)SSF高，且大部分糖在發(fā)酵30 h后轉(zhuǎn)化為乙醇，最大濃度為11 g/L。另一方面，沒有超聲波的SSF實(shí)驗(yàn)顯示，即使在發(fā)酵36 h后，乙醇濃度仍逐漸增加，獲得的最大濃度為9 g/L。Silvana等［31］采用超聲波強(qiáng)化球孢白僵菌產(chǎn)β-1，3-葡聚糖酶，在24 h的發(fā)酵過程中，以195 W、24 kHz、50%占空比處理5 min，使β-1，3-葡聚糖酶的產(chǎn)量增加了46%。在掃描電子顯微鏡（SEM）照片中觀察到菌絲體的破碎，證實(shí)了酶更好地釋放到細(xì)胞外。Shaheen等［32］以80 mW/cm2、1.5 MHz、占空比20% 的超聲波強(qiáng)化里氏木霉產(chǎn)纖維素酶過程，超聲波輻照每天12次、每次5 min、發(fā)酵6 d，纖維素酶活性提高22%。未接受超聲波處理的樣品，菌絲壁圓而光滑；而超聲波處理后的里氏木霉，菌絲收縮、菌絲壁上有許多裂紋和開口，這些裂縫和開口可能促進(jìn)纖維素酶的釋放。

3 超聲波強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解的機(jī)理

基于不同的實(shí)驗(yàn)方法和側(cè)重點(diǎn)，關(guān)于超聲波強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解機(jī)理，研究者們提出了多種解釋，現(xiàn)歸納如下。

3.1 促進(jìn)非均相系統(tǒng)的擴(kuò)散和傳質(zhì)

在非均相系統(tǒng)中，空化泡發(fā)生非對(duì)稱坍塌，當(dāng)氣泡在固體表面附近破裂時(shí)，會(huì)產(chǎn)生高壓力/高速液體射流，這些射流可以清潔固體表面，并通過中間體的脫附而活化固體催化劑，還可以通過擾動(dòng)界面邊界層來增加傳質(zhì)。固體表面的不對(duì)稱塌陷也會(huì)導(dǎo)致底物碎片和表面粗糙［33］。因此，超聲波可以增加底物比表面積、微觀/分子水平的混合，從而增加傳質(zhì)。

Yachmenev等［11］和 Easson 等［34］認(rèn)為木質(zhì)纖維素酶促反應(yīng)可以總結(jié)為以下4個(gè)階段（圖1），其中2個(gè)階段（1和4）涉及酶大分子和酶反應(yīng)產(chǎn)物到達(dá)和離開固體底物表面的運(yùn)輸，這兩個(gè)階段都受擴(kuò)散控制，因此酶水解的總反應(yīng)速率由酶大分子的擴(kuò)散速率控制。但酶蛋白大分子的擴(kuò)散速率很低，大大阻礙了水解反應(yīng)的整體速率。非均相系統(tǒng)（如酶溶液-木質(zhì)纖維素生物質(zhì)）中空化泡的潰滅與均相系統(tǒng)不同，由于表面對(duì)液體流動(dòng)提供阻力，表面上或表面附近的空化泡是非對(duì)稱的。其結(jié)果是大量液體從氣泡的另一側(cè)（遠(yuǎn)離底物表面）涌出，形成強(qiáng)大的液體射流（約500 m/s）并作用于表面。同樣重要的是，空化泡的快速潰滅在氣泡周圍的液體中產(chǎn)生顯著的剪切力，并因此產(chǎn)生強(qiáng)烈的機(jī)械攪拌效應(yīng)。在非均相系統(tǒng)中，空化效應(yīng)比均相系統(tǒng)中的大幾百倍。這種理想的攪拌機(jī)制，發(fā)生在固液界面的緊密邊界層，大大提高了酶大分子對(duì)底物表面的供應(yīng)。由于酶促反應(yīng)的特殊性，超聲波在促進(jìn)擴(kuò)散和傳質(zhì)的同時(shí)，還發(fā)揮與之相關(guān)的以下積極影響：

圖1 固體底物酶促反應(yīng)階段Fig. 1 Schematic diagram of the general stages of an enzymatic reaction on a solid substrate

（1）超聲波不僅增大酶/底物的親和力，而且提高了酶/底物復(fù)合物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的速度。酶/底物的親和力增大是運(yùn)輸更快和酶與底物的相互作用增強(qiáng)的結(jié)果，這歸因于反應(yīng)混合物中由超聲波空化產(chǎn)生的微湍流和強(qiáng)烈的混合作用。Nadar等［3］、Sulaiman等［10］和 Subheder等［35］利 用 Michaelis-Menten方程變換，繪制了Lineweaver-Burk曲線，得到Michaelis常數(shù)（Km）和當(dāng)酶被底物飽和時(shí)的最大反應(yīng)速率（vmax）。結(jié)果表明，與未處理酶相比，超聲波處理后纖維素酶Km降低，而vmax增加。Silvell等［36］得到了相似的結(jié)果，在超聲波處理下，Km比對(duì)照組降低23%，vmax提高了21%。Km表示酶與底物之間的親和力，超聲波處理下Km的降低，是由于更快的傳質(zhì)和酶與底物相互作用增加。vmax的增加表明，在超聲波場下，反應(yīng)物向酶活性部位大量轉(zhuǎn)移，酶 - 底物復(fù)合物快速裂解［23，34］。（2）促進(jìn)可溶性產(chǎn)物，即纖維二糖和葡萄糖，從纖維素表面被帶走并在介質(zhì)中被稀釋，降低與酶活性位點(diǎn)結(jié)合的可能性，從而降低產(chǎn)物抑制程度。Borah 等［23］和Singh等［29］采用Holtzapled等［37］提出的一級(jí)產(chǎn)物抑制模型（又稱HCH-1酶解纖維素模型），研究了超聲波對(duì)銀膠菊和4種雜草的酶解強(qiáng)化過程，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到HCH-1模型參數(shù)值，其中產(chǎn)物結(jié)合常數(shù)降低，證實(shí)了超聲波強(qiáng)化減少了酶解過程中的產(chǎn)物抑制作用。（3）酶大分子通常不是完全剛性的，而是在溶液中具有某種構(gòu)象柔性，因此，由超聲波作用引起的固液界面邊界層的劇烈攪拌，將有助于酶大分子更容易“合適”地定位在底物上［11］。（4）微湍流破壞酶分子聚集體，使得酶活性位點(diǎn)更易于進(jìn)行反應(yīng)，從而提高活力［3，36］。

3.2 增加纖維素底物的可及性

微氣泡的快速崩解產(chǎn)生剪切力，有助于將木質(zhì)纖維素材料分解成更細(xì)小的顆粒，從而顯著增加酶攻擊的表面積。由空化氣泡的崩潰所產(chǎn)生的機(jī)械沖擊，為酶促作用打開了固體底物的表面［9，25，38］。

Adewuyi 等［9］利用BET比表面積測(cè)定法和XRD（X-ray diffraction，X射線衍射）技術(shù)對(duì)天然和處理后的纖維素進(jìn)行表征，結(jié)果表明，天然纖維素的比表面積為2.18 m2/g，但在僅酶存在的水解反應(yīng)后增加到2.68 m2/g，在超聲波/酶存在下增加到4.32 m2/g，分別增加了23%和近100%。經(jīng)過酶和（或）超聲波處理后，纖維素結(jié)晶度有顯著變化，從天然纖維素的75%降低到酶處理纖維素的70.37%、超聲波-酶處理纖維素的66.15%。因此，在超聲波存在下纖維素比表面積增加，同時(shí)纖維素粉末結(jié)晶度略有降低，酶和超聲波的協(xié)同作用使纖維素的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，促進(jìn)了纖維素水解。

3.3 影響酶蛋白空間結(jié)構(gòu)，提高酶活性

酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)對(duì)其催化效率有至關(guān)重要的作用，研究者們利用內(nèi)源熒光光譜法和圓二色（circular dichroism，CD）光譜法分析了超聲波對(duì)酶分子空間結(jié)構(gòu)的影響。

內(nèi)源性熒光主要與芳香族氨基酸殘基有關(guān)，特別是色氨酸殘基。Borah等［23］發(fā)現(xiàn)，機(jī)械攪拌和超聲處理均能使熒光強(qiáng)度降低，但超聲波的作用更明顯，最佳熒光發(fā)射波長（348 nm）沒有發(fā)生任何紅移或藍(lán)移。這種變化是由于空化產(chǎn)生的強(qiáng)烈微對(duì)流使得蛋白質(zhì)分子間疏水相互作用被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子去折疊，纖維素酶分子疏水性氨基酸基團(tuán)和酶分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)暴露，導(dǎo)致活性增強(qiáng)。Subhedar等［35］得出了相同的結(jié)論。Wang等［2］發(fā)現(xiàn)，纖維素酶分子的內(nèi)源熒光強(qiáng)度隨著超聲波功率、超聲波頻率和超聲波處理時(shí)間的增加而降低。

利用CD光譜法可以分析酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，Wang等［2］發(fā)現(xiàn)，24 kHz、15 W、10 min的超聲波處理使纖維素酶的構(gòu)象發(fā)生變化，部分α-螺旋發(fā)生變形，而無規(guī)卷曲含量增加，相應(yīng)地，酶活力提高到59.58 μ/mL；而在29 kHz、50 W、30 min條件下，纖維素酶α-螺旋含量增加且無規(guī)卷曲含量減少，纖維素酶的酶活力下降到31.62 μ/mL。Subhedar等［35］研究發(fā)現(xiàn)，在最佳超聲條件下，與未處理酶相比，α-螺旋含量下降了12.4%，無規(guī)卷曲增加了29.6%。Fan等［39］研究了超聲波處理對(duì)β-D-葡萄糖苷酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，得到了相同的結(jié)論。還有研究者發(fā)現(xiàn)，超聲波對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響同樣適用于固定化酶［2，40］，Ladole 等［40］將纖維素酶固定在磁性納米粒子上，在24 kHz、6 W、6 min條件下，酶催化活性提高近3.6倍。CD光譜分析表明，超聲波處理使β-片層和無規(guī)卷曲分別增加了6.23%和0.69%，而α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量則減少了1.8%和2.11%。CD光譜研究證實(shí)，超聲波處理使得酶蛋白的有序結(jié)構(gòu)減少，而無序結(jié)構(gòu)增加，有利于暴露酶蛋白內(nèi)部的催化位點(diǎn)，纖維素酶顯示出更大的靈活性，使得纖維素酶易于與底物相結(jié)合，有助于提高催化效率。

但超聲波處理對(duì)酶活性也存在負(fù)面影響，超聲波空化產(chǎn)生高活性中間體，如H·、OH·、H2O2、HO2和H2，可能與底物結(jié)合域或催化域的氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)［41］。有研究者提出［6］，活性中間體與蛋白質(zhì)骨架作用，會(huì)導(dǎo)致酶的聚集，從而阻礙活性位點(diǎn)，同時(shí)也降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。此外，超聲波處理產(chǎn)生的剪切力在酶失活中也有相當(dāng)大的作用［37，41］。但Nguyen等［41］和Sun等［42］的研究證實(shí)，超聲波并沒有引起纖維素酶分子的劇烈損傷，其一級(jí)結(jié)構(gòu)沒有降解或改變。

超聲波處理使纖維素酶活性增加或降低，與超聲波參數(shù)設(shè)置密切相關(guān)?？偟膩碚f，低強(qiáng)度超聲波將酶分子聚集體分解成更小的碎片，暴露更多的活性位點(diǎn)，有助于酶活性的增加；同時(shí)，高強(qiáng)度超聲波結(jié)合長時(shí)間處理導(dǎo)致自由基反應(yīng)，可使酶失活［43-45］。但不同的文獻(xiàn)中，引起酶活性下降的超聲波參數(shù)是不同的，這與超聲波發(fā)生器的類型、底物的性質(zhì)、其他參數(shù)的設(shè)定等有關(guān)。Su等［19］的研究發(fā)現(xiàn)，在高強(qiáng)度（＞120 W）下，纖維素酶活性在50℃時(shí)明顯下降；然而，在所有輸出功率（0-500 W）下，37℃時(shí)的纖維素酶活性都是穩(wěn)定的。Szabó等［43］發(fā)現(xiàn)，在40%振幅（40 kHz，最大功率500 W）下，酶活性在65 min內(nèi)損失了12%。當(dāng)振幅增加到60%和80%時(shí)，酶活性下降更為顯著，65 min后酶的活性分別只有原來的80%和75%。Silva等［46］發(fā)現(xiàn)，在20 kHz和50 W/cm2的超聲波條件下，β-D-葡萄糖苷酶活性提高1.5倍。Chen等［47］發(fā)現(xiàn)，在968 W/cm2和10 min時(shí)，β-D-葡萄糖苷酶活性下降了84.71%。Sun等［42］發(fā)現(xiàn)低溫度（20-45℃）、低超聲波強(qiáng)度（＜181.53 W/cm2）和短處理時(shí)間（＜15 min）導(dǎo)致了 β-D-葡萄糖苷酶的激活，而高溫度（45-60℃）、高超聲波強(qiáng)度（＞181.53 W/cm2）和長處理時(shí)間（＞15 min）導(dǎo)致其抑制。

4 關(guān)于超聲波強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解的不同觀點(diǎn)

4.1 超聲波處理是否會(huì)導(dǎo)致纖維素酶活性下降

如前所述，很多文獻(xiàn)報(bào)道了適當(dāng)條件下的超聲波處理改變纖維素酶的空間結(jié)構(gòu)，使纖維素酶活性提高，但高強(qiáng)度超聲波會(huì)導(dǎo)致纖維素酶失活，對(duì)此，有研究者提出了不同的觀點(diǎn)。Adewuyi等［9］在611 khz、104 w、50℃和pH 5.2條件下得到最佳的纖維素水解，葡萄糖產(chǎn)率為41.4%，延長時(shí)間（40-50 h）可獲得高達(dá)70%的葡萄糖產(chǎn)率。在大約30 h后觀察到水解速率降低，可能是由于除了產(chǎn)物、底物和吸附抑制之外，易水解的非晶纖維素的減少。Adewuyi等［9］提出，高活性中間產(chǎn)物的形成，特別是在高超聲波頻率下的形成，對(duì)溶解酶大分子的長期催化/活性沒有任何顯著影響。一個(gè)可能解釋是，在通常的低酶濃度下，酶相對(duì)于大量溶劑分子（如水）的比率極低，酶大分子被滯留在空化氣泡中并遇到由潰滅的氣泡所產(chǎn)生的高活性中間產(chǎn)物的可能性很低，因此大多數(shù)酶對(duì)超聲波的抵抗力非常高，以至于產(chǎn)生廣泛酶活性惡化所需的超聲波強(qiáng)度可能太高而無法達(dá)到。Yachmenev等［11］也支持了這一觀點(diǎn)。但在這些報(bào)道中，并沒有測(cè)定纖維素酶的活性，研究者認(rèn)為，利用超聲波和酶對(duì)纖維素水解的改善歸因于超聲波作用下纖維素的表面積增加和結(jié)晶度降低。另有研究者發(fā)現(xiàn)［19，43］，雖然高強(qiáng)度/長時(shí)間超聲波處理仍然使酶催化水解效率提高，但經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)纖維素酶活性確實(shí)下降了，其原因是超聲波對(duì)非均相纖維素-纖維素酶反應(yīng)的積極影響能夠克服其對(duì)酶活性的負(fù)面影響。因此超聲波強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解各種機(jī)理的相對(duì)貢獻(xiàn)，以及在酶解過程不同階段的差異，有待于進(jìn)一步研究。

4.2 超聲波反應(yīng)器的類型和參數(shù)設(shè)置對(duì)研究結(jié)果有重要影響

超聲波強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解的實(shí)驗(yàn)室研究中，常常采用槽式或變幅桿式超聲波反應(yīng)器，個(gè)別研究中采用了新型多頻超聲反應(yīng)器［9］和可提供均勻可控超聲波的六邊形超聲波反應(yīng)器［11，34］，對(duì)于變幅桿式超聲波反應(yīng)器，變幅桿的位置和直徑是影響超聲波作用的重要參數(shù)，不同類型超聲波反應(yīng)器和同種類型不同參數(shù)設(shè)置的超聲波反應(yīng)器，其研究結(jié)果難以比較。Gasparotto等［27］提出間接超聲波是最有前途的輔助酶反應(yīng)技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)中，直接超聲波和間接超聲波均由變幅桿式超聲波反應(yīng)器提供，但另有文獻(xiàn)［3］中提出的直接超聲波和間接超聲波被分別定義為由槽式和變幅桿式超聲波反應(yīng)器提供。利用理論和實(shí)驗(yàn)的方法，對(duì)超聲波反應(yīng)器空化行為進(jìn)行定量描述和評(píng)價(jià)，是對(duì)超聲波反應(yīng)器類型和參數(shù)設(shè)置進(jìn)行對(duì)比的有效途徑。超聲波反應(yīng)器的設(shè)計(jì)不僅對(duì)實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果有重要影響，更是決定超聲波強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解研究放大和實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的關(guān)鍵因素。

5 超聲波強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解的經(jīng)濟(jì)效益評(píng)價(jià)

木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶解成本高、效率低，是阻礙第二代生物乙醇成本競爭性生產(chǎn)的主要原因。盡管近年來纖維素酶的生產(chǎn)成本大幅度降低，但木質(zhì)纖維素糖化過程仍然是一個(gè)昂貴而緩慢的步驟。超聲波強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解可縮短反應(yīng)時(shí)間、減少纖維素酶的用量，但同時(shí)必須考慮設(shè)備的投資和維護(hù)，以及超聲波處理是一個(gè)能量密集過程這一現(xiàn)實(shí)。對(duì)這一過程進(jìn)行技術(shù)經(jīng)濟(jì)分析是重要的研究課題，但僅有個(gè)別文獻(xiàn)進(jìn)行了報(bào)道［47］，以舊報(bào)紙、辦公廢紙為原料的超聲波輔助酶解，附加的超聲波能量為5.2-10.4 MJ，總產(chǎn)糖量增加，額外能量輸出為15-160 kJ，超聲波輔助酶解對(duì)總成本有消極的影響。利用現(xiàn)有的超聲波技術(shù)，對(duì)纖維素生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理和熱化學(xué)/生物化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行強(qiáng)化，額外的超聲波處理消耗的能量大得多，而由于糖產(chǎn)量提高而增加的能量輸出僅為消耗能量的一小部分，在超聲波輔助糖化的初期，酶效率的提高可能并不顯著，原因在于木質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)非常頑固，同時(shí)，懸浮狀態(tài)下的微米/納米級(jí)木質(zhì)纖維素顆粒的高體積密度，導(dǎo)致超聲波能量嚴(yán)重衰減。為此，需要進(jìn)一步研究超聲波反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)和設(shè)計(jì)、超聲波參數(shù)和操作對(duì)特定反應(yīng)的適應(yīng)性；超聲波與其他強(qiáng)化處理方法結(jié)合，特別是大規(guī)模處理高固體濃度的生物質(zhì)原料；進(jìn)行超聲輔助反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和機(jī)理研究，應(yīng)分析不同反應(yīng)所需的活化能水平，以找到超聲波強(qiáng)化與化學(xué)活化的最佳組合。

6 總結(jié)與展望

僅用酶法進(jìn)行木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解是相當(dāng)緩慢的，超聲波可參與酶-底物預(yù)處理、糖化、SSF工藝和產(chǎn)酶過程，以多種方式強(qiáng)化木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化，對(duì)酶促反應(yīng)提供明顯的強(qiáng)化效果，可提高可發(fā)酵糖以及生物乙醇產(chǎn)量、增大酶解速率、減少酶解反應(yīng)時(shí)間和降低酶用量。本文總結(jié)了促進(jìn)非均相系統(tǒng)的擴(kuò)散和傳質(zhì)，增加纖維素底物的可及性，改變酶蛋白空間結(jié)構(gòu)、提高酶活性等超聲波強(qiáng)化酶解的機(jī)理，但超聲波強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解這一課題仍有很大的深入研究的空間，包括：

（1）超聲波強(qiáng)化與其他酶解改進(jìn)措施的協(xié)同作用。為了提高木質(zhì)纖維素酶解效率，可采用多種措施，如在酶解體系中加入適量的水溶性木質(zhì)素、非離子表面活性劑，可有效減少底物木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的無效吸附［48-49］；添加纖維二糖脫氫酶、擴(kuò)展蛋白和膨脹素，可顯著提高纖維素糖化效率［50］；Mg2+、Co2+、Ca2+和阿魏酸、對(duì)香豆酸等對(duì)纖維素酶具有激活作用［4］。超聲波強(qiáng)化與以上酶解改進(jìn)措施的協(xié)同作用的研究將為木質(zhì)纖維素生物乙醇的生產(chǎn)提供更多的機(jī)遇。

（2）超聲波空化的物理/化學(xué)與酶解的生物化學(xué)之間的確切聯(lián)系尚未建立。有必要研究在不同實(shí)驗(yàn)條件下的超聲波效應(yīng)，建立數(shù)學(xué)模型，量化可變參數(shù)對(duì)超聲波整體效應(yīng)的貢獻(xiàn)，從而預(yù)測(cè)過程效率的變化。需要了解酶結(jié)構(gòu)變化與超聲波處理的關(guān)系，了解酶反應(yīng)表觀動(dòng)力學(xué)變化與酶活性位點(diǎn)的數(shù)量和分布之間的聯(lián)系。

（3）超聲波強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解操作參數(shù)的綜合優(yōu)化。關(guān)鍵參數(shù)包括包超聲波發(fā)生器的結(jié)構(gòu)、功率、頻率、處理時(shí)間，以及酶解的一般參數(shù)，如溫度、酶用量、酶-底物比率等。此外，還應(yīng)考慮其他因素，如靜壓、充氣操作和溶劑特性。在分析實(shí)際強(qiáng)化機(jī)理的基礎(chǔ)上，對(duì)超聲波強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解操作參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。