青海牦牛源賈第蟲的鑒定及分子特征分析

王光華，李秀萍，王戈平，蔡其剛，馬利青

(青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧 810016)

?

青海牦牛源賈第蟲的鑒定及分子特征分析

王光華，李秀萍，王戈平，蔡其剛，馬利青*

(青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧 810016)

從青海省祁連縣采集93份牦牛糞樣用于賈第蟲檢測。所有樣品經(jīng)蔗糖密度梯度離心法純化處理后，采用盧戈氏碘液染色鏡檢和免疫熒光試驗進行檢測，將鏡檢陽性樣品采用套式PCR方法擴增18 S rRNA，并對擴增產(chǎn)物進行測序分析。結(jié)果鏡檢和免疫熒光試驗中有9份樣品為賈第蟲陽性，陽性率為9.7%。鏡檢陽性樣品采用套式PCR方法擴增后有8份樣品為18 S rRNA基因陽性，產(chǎn)物長度292 bp，測序后的序列分別命名為QHQL201501～QHQL201508。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，分離的蟲株屬于牛源十二指腸賈第蟲，基因型均為反芻動物特有的聚集體E，未發(fā)現(xiàn)具有人獸共患潛力的A型和B型。

牦牛；賈第鞭毛蟲；18 S rRNA；套式PCR

十二指腸賈第鞭毛蟲(Giardiaduodenalis)簡稱賈第蟲，是一種呈全球性分布的寄生性腸道原蟲，主要寄生在人和某些哺乳動物的小腸，引起以腹瀉和消化不良為主要癥狀的賈第蟲病(Giardiasis)，當人或動物攝入被賈第蟲污染的飲水和食物時就會感染該病原[1]。目前，賈第蟲病已被列為全世界危害人類健康的10種主要寄生蟲病之一[2]。賈第蟲的基因型根據(jù)分子遺傳學(xué)和表型不同可分為8個主要的聚集體(A～H)，每個聚集體都有不同的宿主范圍，集聚體A和B主要感染人和其他哺乳動物，即屬于人畜共患型；其他集聚體是宿主專一性的，集聚體C和D主要感染犬和犬科動物；集聚體E主要感染牛、羊等偶蹄動物；集聚體F、G、H分別感染貓、鼠和海豹[3-4]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR和熒光定量PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于賈第蟲的分子流行病學(xué)調(diào)查。目前，賈第蟲的檢測和基因分型技術(shù)主要通過分析小亞基核糖體RNA(ssu-rRNA)、β賈第素(bg)、谷氨酸脫氫酶(gdh)、延伸因子-1α(ef-1α)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpi)及滋養(yǎng)體表面抗原基因進行分析[5]。

本研究從青海省海北藏族自治州祁連縣牦牛養(yǎng)殖牧場隨機采集了93份新鮮牦牛糞樣，采用蔗糖密度梯度離心法純化后，分別采用盧戈氏碘液染色法和免疫熒光抗體試驗進行顯微鏡檢測，鏡檢陽性樣品用基于18 S rRNA基因的套式PCR方法擴增并測序分析，鑒定分離蟲株的基因型，為今后該地區(qū)牦牛源賈第蟲病的防控和研究提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1糞樣采集2014年9月，以青海省祁連縣某養(yǎng)殖戶為調(diào)查對象，清晨采集牦牛新鮮糞樣共計93份，分別編號為QHQL201401～QHQL201493，按等比例分別加入25 g/L的重鉻酸鉀溶液后存放于4℃冰箱。

1.1.2主要試劑與儀器糞樣DNA提取試劑盒、GoTaqDNA聚合酶預(yù)混液等，自凱杰公司產(chǎn)品；DNA標準DL 2 000、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒、瓊脂糖等，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；賈第蟲熒光素標記單克隆抗體試劑盒，Cellabs公司產(chǎn)品；胰蛋白胨、酵母提取物，OXOID公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑如氯化鈉、氫氧化鈉和碘液等均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1形態(tài)學(xué)鑒定將采集的牦牛糞樣按照文獻[6]的方法，每份糞樣經(jīng)蔗糖密度梯度離心法純化后，取適量樣品涂于載玻片上并用盧戈氏碘液染色法染色，蓋上蓋玻片之后用顯微鏡觀察賈第蟲包囊存在情況。

1.2.2免疫熒光試驗(IFT)將純化后的93份樣品，每份樣品取30 μL分別滴加到不同的載玻片上，干燥后滴加20 μL賈第蟲單克隆熒光抗體，使其均勻的覆蓋樣品，將所有樣品置于濕盒中，37℃孵育30 min；之后用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH 7.4)沖洗2次，樣品上滴加20 μL甘油，用蓋玻片覆蓋后立即用熒光顯微鏡觀察。

1.2.3樣品DNA的提取取鏡檢陽性樣品500 μL,按照糞樣DNA提取試劑盒(Qiagen Stool Mini Kit)的說明書提取賈第蟲基因組DNA。將獲得的DNA溶于80 μL滅菌水中，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.418 S rRNA基因的套式PCR擴增參照文獻[7]的引物和方法對盧戈氏碘液染色鏡檢和IFT檢測均為陽性的樣品進行基于18 S rRNA基因的套式PCR擴增。第1輪PCR反應(yīng)體系為：12.5 μL GoTaqDNA聚合酶預(yù)混液，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，模板DNA 3 μL，加滅菌水至25 μL；反應(yīng)條件為：95℃ 4 min；95℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；之后72℃ 7 min。上游引物Gia2029，5′-AAGTGTGGTGCAGACGGACTC-3′，下游引物Gia2150c 5′-CTGCTGCCGT CCTTGGATGT-3′；第2輪PCR體系中模板為第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物2 μL，其余試劑與首輪體系一致。第2輪反應(yīng)條件為：95℃ 4 min；95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)；之后72℃ 7 min。第2輪反應(yīng)中上游引物為RH115′-CATC CGGTCGATCCTGCC-3′，下游引物為RH4 5′-AGTCGAACCCTGATTCTCCGCCAGG-3′，擴增基因片段長度約為292 bp。PCR產(chǎn)物電泳后回收并純化，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。

1.2.5系統(tǒng)發(fā)育分析將PCR擴增獲得的產(chǎn)物測序后與從GenBank下載的賈第蟲參考序列(表1)比對，并用DNA Star軟件中的MegAlign分析序列之間的同源性。采用Mega5.2軟件計算各序列間的遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(鄰近法)。

2　結(jié)果

2.1形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

分別將93份牦牛糞樣用盧戈氏碘液染色后，在400倍普通光學(xué)顯微鏡下觀察，在9份樣品中發(fā)現(xiàn)存在橢圓形包囊結(jié)構(gòu)，大小約為7.5 μm～9 μm×10 μm～14 μm，從形態(tài)結(jié)構(gòu)上可初步判定為賈第蟲包囊(圖1)。

2.2免疫熒光試驗結(jié)果

將樣品分別與賈第蟲熒光抗體反應(yīng)后，用熒光顯微鏡觀察，共有9份樣品中發(fā)現(xiàn)了具有熒光的橢圓形包囊(圖2)，大小約為7.5 μm～9 μm×10 μm～14 μm，判定為賈第蟲陽性。該結(jié)果與盧戈氏碘液染色法鏡檢的結(jié)果一致。

2.3套式PCR擴增結(jié)果

將鏡檢陽性的9份樣品采用基于賈第蟲18 S rRNA的套式PCR方法進行擴增，共有8份樣品擴增出了大小約為292 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖3)。

圖1　盧戈氏碘液染色的牦牛賈第蟲包囊(400×)

圖2　免疫熒光抗體法檢測牦牛賈第蟲包囊(400×)

M. DNA標準DL1 000；1. 陰性對照；2. 陽性對照；3～10. 糞樣PCR產(chǎn)物

M. DNA Marker DL1 000; 1. Negative control; 2. Positive control; 3-10. PCR products of fecal samples

圖318 S rRNA基因PCR擴增結(jié)果

Fig.3PCR results of 18 S rRNA gene

2.4系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

將測序結(jié)果與GenBank中下載的相關(guān)序列用DNA Star7.0軟件進行多序列比對，用MEGA5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出本次檢測出的牦牛源賈第蟲為十二指腸賈第蟲(Giardiaduodenalis)，根據(jù)參考序列進一步分析表明其基因型為E型(表1、圖4和圖5)。

3　討論

本試驗分別采用盧戈氏碘液染色鏡檢、免疫熒光試驗(IFT)和套式PCR方法對青海省祁連縣牦牛糞樣中的賈第蟲進行了檢測。所有樣品經(jīng)盧戈氏碘液染色鏡檢和免疫熒光試驗鏡檢后發(fā)現(xiàn)9份樣品中存在賈第蟲包囊，本試驗中2種鏡檢的結(jié)果一致，表明這2種方法在賈第蟲鏡檢中都具有重要作用。之后采用套式PCR方法擴增了鏡檢陽性樣品的18 S rRNA基因片段，有8份樣品18 S rRNA基因陽性，其中1份樣品出現(xiàn)鏡檢陽性而PCR方法檢測陰性的現(xiàn)象，分析可能是由于賈第蟲包囊在樣品中分布不均勻或樣品中存在PCR擴增酶抑制物造成的[8-9]，因此，在DNA提取和PCR擴增過程中需提前考慮這些因素，從而避免對試驗結(jié)果的干擾。

圖4　基于18 S rRNA基因的牦牛源賈第蟲種類鑒定

圖5　以18 S rRNA基因?qū)﹃笈Ｔ促Z第蟲的基因型鑒定

對于賈第蟲的分類，20世紀初曾多達50余種，1952年，F(xiàn)ilice根據(jù)形態(tài)學(xué)等特征對賈第蟲種類進行了評價，將多數(shù)種都劃歸為十二指腸賈第蟲，僅保留了少數(shù)幾個有效種[10]。目前多數(shù)研究學(xué)者認為賈第蟲有6個有效種，其中Giardiaagilis、Giardiaardeae、Giardiamuris、Giardiamicroti和Giardiapsittaci可感染不同種類的動物，而Giardiaduodenalis主要感染人和其他哺乳動物[11]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，僅憑形態(tài)學(xué)和宿主種類的分類方法已經(jīng)不適合賈第蟲的分類?；谛喕颂求wRNA基因、磷酸丙糖異構(gòu)酶、谷氨酸脫氫酶、延伸因子1-α基因等的核苷酸序列分析，可將來自不同動物的十二指腸賈第蟲劃分為不同的基因型[12]。本研究通過對青海省祁連縣分離的牦牛源賈第蟲18 S rRNA基因進行擴增、測序和序列分析，結(jié)果表明分離的牦牛源賈第蟲為集聚體E型。本結(jié)果為進一步研究青海省牛源賈第蟲奠定了基礎(chǔ)。

[1]張永輕,滕美君,王云華,等.中國人源藍氏賈第鞭毛蟲ppdk基因的克隆及其表達產(chǎn)物的鑒定[J].中國病原生物學(xué)雜志,2010,5(11):834-839.

[2]張會寧,于鑫,魏博,等.隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的危害及其控制技術(shù)[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2011,34(12):135-140.

[3]鄧明俊,肖西志,孫濤,等.藍氏賈第鞭毛蟲檢測技術(shù)研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2012,33(12):168-173.

[4]Ye J B,Xiao L H,Wang Y F,et al.Dominance ofGiardiaduodenalisassemblage A andEnterocytozoonbieneusigenotype BEB6 in sheep in Inner Mongolia,China [J].Vet Parasitol,2015,210:235-239.

[5]梁樂,汪世龍,王惠琴.水源性藍氏賈第鞭毛蟲分子生物學(xué)檢測方法研究進展[J].國際醫(yī)學(xué)寄生蟲病雜志,2009,36(2):114-117.

[6]Hamnes I S,Gjerde B,Robertson L,et al.Prevalence ofCryptosporidiumandGiardiain free-ranging wild cervids in Norway [J].Vet Parasitol,2006,141:30-41.

[7]Juan D R,Ruben D H,Carolina H,et al.Molecular diagnosis and genotype analysis ofGiardiaduodenalisin asymptomatic children from a rural area in central Colombia [J].Infect Genet Evol,2015,32:208-213.

[8]顧有方,王立克,李陽,等.安徽省部分地區(qū)山羊藍氏賈第鞭毛蟲流行病學(xué)調(diào)查及基因型分析[J].中國寄生蟲與寄生蟲病雜志,2014,32(5):401-403.

[9]Ash A,Lymbery A,Lemon J,et al.Molecular epidemiology ofGiardiaduodenalisin an endangered carnivore-The African painted dog[J].Vet Parasitol,2010,174:206-212.

[10]肖淑敏.牛源環(huán)孢子蟲與賈第蟲的分子特征與檢測研究[D].廣東廣州:華南農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[11]Feng Y Y,Xiao L H.Zoonotic potential and molecular epidemiology ofGiardiaspecies and giardiasis [J].Clin Microbiol Rev,2011,1:110-140.

[12]李結(jié),王培園,張萍,等.犬源賈第蟲EF1α基因的克隆及序列分析[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2012,33(1):53-56.

Identification and Molecular Characterization of Yak-derivedGiardiaSpecies in Qinghai Province

WANG Guang-hua,LI Xiu-ping,WANG Ge-ping,CAI Qi-gang,MA Li-qing

(Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine,Xining,Qinghai,810016，China)

A total of 93 fecal samples from yak from Qilian county in Qinghai province were screened for the presence ofGiardia.All the samples were detected by microscope and immunofluorescence test (IFT).Then,the microscopy-positive samples were amplified by nested PCR targeting the18S rRNA gene.The results showed nine out of 93 fecal samples were detected asGiardiapositive by microscope and IFT with a positive rate of 9.7%.Eight out of nine microscopy-positive samples were amplified by nPCR targeting the18S rRNA gene and the PCR product is 292 bp.The sequences were named as QHQL201501-QHQL201508 after sequencing.Phylogenetic analysis indicated that these isolated species areGiardiaduodenalis,assemblage E.The zoonostic genotype was not found in the present study.

yaks;Giardia; genotype; 18 S rRNA; nested-PCR

2016-02-26

青海省自然科學(xué)基金項目(2013-Z-934Q)；外專千人計劃(WQ20136300172)

王光華(1978-)，男，青海大通人，副研究員，博士，主要從事病原微生物學(xué)研究。*通訊作者

S852.722

A

1007-5038(2016)08-0015-04