SDNF聯(lián)合HGF對(duì)大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞體外活性的作用

鄔　江，徐永清，朱　敏，朱崇濤，陳旭升

SDNF聯(lián)合HGF對(duì)大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞體外活性的作用

鄔江，徐永清，朱敏，朱崇濤，陳旭升

目的探討許旺細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（SDNF）聯(lián)合肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）對(duì)鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的作用。方法建立大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，按培養(yǎng)基不同分為4組：10%胎牛血清培養(yǎng)基（A組）、10%胎牛血清＋400 ng/ml SDNF（B組）、10%胎牛血清＋200 ng/mlhGF（C組）和10%胎牛血清＋400 ng/ml SDNF＋200 ng/mlhGF（D組），動(dòng)態(tài)觀測(cè)肌衛(wèi)星細(xì)胞的形態(tài)、MTT生長(zhǎng)曲線和肌管形成率等指標(biāo)的變化。結(jié)果含不同因子的培養(yǎng)基均可促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖；MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，C組和D組細(xì)胞生長(zhǎng)較為旺盛，但B、C、D組間差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而A組的細(xì)胞增殖較其他3組緩慢（P<0.05）；與A組相比，其他3組細(xì)胞融合數(shù)明顯增多，以B組和D組肌管形成較為突出（P<0.01）。結(jié)論HGF主要作用于肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活和增殖，而SDNF則側(cè)重于肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化，兩種因子共同作用有某種程度的疊加效果。

肌衛(wèi)星細(xì)胞；許旺細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；增殖；分化

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF)是目前已知的唯一可激活靜息狀態(tài)肌衛(wèi)星細(xì)胞的細(xì)胞因子。許旺細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Schwann cell-derived neurotrophic factor，SDNF）是近年來從許旺細(xì)胞中提取的，具有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元保護(hù)和促周圍神經(jīng)再生的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[1-2]。而肌衛(wèi)星細(xì)胞作為周圍神經(jīng)主要靶器官——肌肉的干細(xì)胞，經(jīng)證實(shí)在體外其增殖和分化與SDNF有一定的相關(guān)性。然而HGF和SDNF對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞生物活性的聯(lián)合作用尚無相關(guān)的研究報(bào)道。為肌組織工程進(jìn)一步研究的需要，為獲得高產(chǎn)量和高成肌性的肌衛(wèi)星細(xì)胞，有必要在體外評(píng)估這兩種因子對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞活性的聯(lián)合作用，為此本課題進(jìn)行了相關(guān)研究。

1　材料與方法

1.1SDNF制備按本實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作程序[3]制備SDNF。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組細(xì)胞取自3月齡Wistar雄性大鼠[由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物所提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(粵)2006-0015]。具體培養(yǎng)、鑒定方法見參考文獻(xiàn)[4]。細(xì)胞采用10%胎牛血清培養(yǎng)基原代培養(yǎng)，常規(guī)行α-sarcometric actin免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定。分組：96孔培養(yǎng)皿原代培養(yǎng)至第2 d換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，細(xì)胞分別用10%胎牛血清培養(yǎng)基（A組）、10%胎牛血清＋400 ng/ml SDNF（B組）、10%胎牛血清＋200 ng/mlhGF(Sigma)（C組）和10%胎牛血清＋400 ng/ml SDNF＋200 ng/mlhGF（D組）條件培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)72h后分兩批處理：（1）各組每日取3孔細(xì)胞計(jì)數(shù)，取3孔行MTT法檢測(cè)，記錄細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；（2）2%胎牛血清促分化處理，觀察分化時(shí)間，計(jì)數(shù)肌管形成數(shù)。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)變化A組細(xì)胞在接種培養(yǎng)后16～24h均已完全貼壁，且見有小突起長(zhǎng)出，逐漸形成梭形、紡錘形，均表現(xiàn)出典型的肌衛(wèi)星細(xì)胞形態(tài)變化特征，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，顯示成活率均在95%以上；24h后，見大量折光率強(qiáng)的圓形細(xì)胞貼壁，且有極個(gè)別細(xì)胞有小突起；48h后，可見大量梭形、紡錘形的單核細(xì)胞出現(xiàn)，其間混雜少量扁平、多突起、胞漿豐富的成纖維細(xì)胞；隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，梭形細(xì)胞的數(shù)量逐漸增加，其胞漿出現(xiàn)2～3個(gè)突起，相互拉網(wǎng)；繼續(xù)培養(yǎng)，單核細(xì)胞相互融合成為多核的肌管，肌管逐漸粗大、分叉增多。免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)這些細(xì)胞胞漿內(nèi)細(xì)絲呈α-sarcometric actin反應(yīng)陽性，而成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均未見有陽性細(xì)絲。與A組相比，B、C、D組細(xì)胞形態(tài)上差別不大（圖1、2）。

2.2不同培養(yǎng)基對(duì)鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖能力的影響

除A組外，加入不同因子的各組細(xì)胞均于第3 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，約1 w時(shí)間達(dá)生長(zhǎng)高峰后減緩速度。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，C組和D組細(xì)胞生長(zhǎng)較為旺盛，但B、C、D組間差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P> 0.05）。而A組的細(xì)胞增殖較其他3組緩慢 （P< 0.05），見表1。

2.3不同培養(yǎng)基對(duì)鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞分化能力的影響

各組細(xì)胞經(jīng)促分化處理后，第3 d均有融合表現(xiàn)；而隨后與A組相比，其他3組細(xì)胞融合數(shù)明顯增多，以B組和D組肌管形成較為突出（P<0.01），見表1。

圖1　A組鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞形態(tài)

圖2　B組鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞形態(tài)

表1　培養(yǎng)第7d各組鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞活性比較?????????????????????????????? ??　????????????　? ?????!?"???　?? ????????? #?　??!$?????$ %?　??"???????? ??　??$ ?????"?&’?(??)*+?,??-????"./??-??????

3　討論

3.1肌衛(wèi)星細(xì)胞的調(diào)控肌衛(wèi)星細(xì)胞的作用主要是補(bǔ)充受損的肌細(xì)胞，這也是骨骼肌受損后能部分修復(fù)的原因。肌肉受損后，受損部位周圍的肌衛(wèi)星細(xì)胞首先完成遷移過程，即能從健康肌纖維或肌纖維未受損端游移到肌纖維受損處。目前大量的體外研究已證實(shí)，肌衛(wèi)星細(xì)胞的調(diào)控包括正性調(diào)控因子和負(fù)性調(diào)控因子兩大類，而生長(zhǎng)因子在調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細(xì)胞激活、增殖和分化的調(diào)控中占主導(dǎo)地位。其中，胰島素生長(zhǎng)因子（IGF）類能明顯提高肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖能力和增加生肌調(diào)節(jié)因子的功能，其亞型機(jī)械生長(zhǎng)因子（MGF）被發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、抑制分化的功能，成為近年來細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。TGF-β同時(shí)抑制細(xì)胞增殖和分化[5]。bFGF有促增殖作用，但抑制細(xì)胞分化，且bFGF較其他生長(zhǎng)因子促增殖作用強(qiáng)[6]。近年有研究證實(shí)，正常成年骨骼肌中存在使肌衛(wèi)星細(xì)胞激活的HGF，通過促進(jìn)DNA合成、抑制細(xì)胞分化，從而形成更多的肌纖維，它是肌衛(wèi)星細(xì)胞的促分裂劑和趨化劑[7]。PDGF是血清中的有絲分裂原，可以促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞分化。除生長(zhǎng)因子外，激素、基膜及成熟肌細(xì)胞亦對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞的生長(zhǎng)有作用。最近又有研究表明，肌衛(wèi)星細(xì)胞激活后自分泌的IL-6對(duì)其增殖有促進(jìn)作用[8]。此外MRFS是肌肉形成的主要調(diào)節(jié)因子，可以使胚胎干細(xì)胞向成肌細(xì)胞方向分化，調(diào)節(jié)整個(gè)生肌程序的基因表達(dá)[9]。

3.2HGF和SDNF對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞的調(diào)控朱家愷課題組通過體內(nèi)外試驗(yàn)證明，SDNF對(duì)脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞有營(yíng)養(yǎng)作用，并能減輕毒物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損害，證實(shí)了SDNF對(duì)發(fā)育期動(dòng)物運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)作用[10]。HGF可激活靜息狀態(tài)的肌衛(wèi)星細(xì)胞。通過本課題的研究驚奇地發(fā)現(xiàn)，SDNF對(duì)神經(jīng)作用的靶器官之一的肌衛(wèi)星細(xì)胞同樣有一定的調(diào)控作用，綜合本研究中肌衛(wèi)星細(xì)胞的活力和生長(zhǎng)能力的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)含有HGF的兩組相對(duì)單純SDNF組可以促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖；但含有SDNF的兩組相對(duì)單純HGF組成肌更為突出，也就是說HGF主要作用于肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活和增殖，而SDNF則側(cè)重于肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化，兩種因子共同作用不會(huì)消弱各自的功效，相反有某種程度的疊加效果。

3.3SDNF與肌衛(wèi)星細(xì)胞的作用機(jī)制SDNF是許旺細(xì)胞分泌的活性因子，正常情況下許旺細(xì)胞的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白mRNA的表達(dá)極低，只有當(dāng)神經(jīng)受損后，損傷處周圍的營(yíng)養(yǎng)蛋白表達(dá)才會(huì)增高。即使體外培養(yǎng)許旺細(xì)胞亦不會(huì)增加蛋白的表達(dá)[11]。本課題在進(jìn)行SDNF研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，該營(yíng)養(yǎng)因子在神經(jīng)損傷10 d后分泌達(dá)高峰，其機(jī)理可能是神經(jīng)損傷后遠(yuǎn)端在軸突降解后產(chǎn)物和巨噬細(xì)胞分泌物共同刺激作用下，許旺細(xì)胞大量增生，同時(shí)許旺細(xì)胞分泌營(yíng)養(yǎng)蛋白的量亦上調(diào)，7～14 d達(dá)高峰，持續(xù)數(shù)周（視營(yíng)養(yǎng)蛋白的性質(zhì)而定）[12]。同時(shí)在臨床工作中我們也發(fā)現(xiàn)，在未修復(fù)損傷神經(jīng)的情況下，在一定周期內(nèi)，似乎中樞神經(jīng)損傷者比周圍神經(jīng)損傷者相應(yīng)支配區(qū)肌肉萎縮程度重；損傷部位離肌門越近，相應(yīng)支配區(qū)肌肉萎縮程度越輕。兩者的周期如此的巧合，是不是預(yù)示著神經(jīng)損傷處會(huì)分泌某種或多種能延緩肌萎縮的物質(zhì)？這些物質(zhì)能沿著神經(jīng)損傷遠(yuǎn)段進(jìn)入靶器官而產(chǎn)生延緩肌萎縮的作用，SDNF是不是其中之一呢？本課題證實(shí)了SDNF對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化有一定的調(diào)控作用，推測(cè)該因子確實(shí)有延緩骨骼肌萎縮的作用。

總之，SDNF對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化有一定的調(diào)控作用，相對(duì)而言促分化作用更加明顯。而HGF主要作用于肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活和增殖，兩種因子共同作用有某種程度的疊加效果，確有延緩失神經(jīng)肌萎縮的作用。

[1]朱家愷，陳麗芳.雪旺細(xì)胞和雪旺細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白的系列研究[J].中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，21（6）：461.

[2]鄔江，朱家愷，龐水發(fā).許旺細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白的研究進(jìn)展[J].中華顯微外科雜志，2008，31（4）：314-316.

[3]鄔江，朱家愷，許揚(yáng)濱，等.許旺細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白的質(zhì)譜分析[J].中華顯微外科雜志，2002，25（4）：276-278.

[4]鄔江，孫曉娟，秦建強(qiáng)，等.組織工程用大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞的體外篩選[J].中華顯微外科雜志，2002，25（2）：123-125.

[5]Yablonka-Reuveni Z，Seger R,Rivera AJ.Fibroblast growth factor promotes recruitment of skeletal muscle satellite cells in young and old rats[J].Jhistochem Cytochem，1999，47（1）：23-42.

[6]Doumit ME，Cook DR，Merkel RA.Testosterone up-regulates androgen receptors and decreases differentiation ofporcine myogenic satellite cells in vitro[J].Endocrinology，1996，137（4）：1385-1394.

[7]張蔚菁，賈懿劼，田京.肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖及分化影響因素研究進(jìn)展[J].國(guó)際骨科學(xué)雜志，2013，34（2）：104-106.

[8]Toth KG，McKay BR，De Lisio M，et al.IL-6 induced STAT3 signalling is associated with the proliferation ofhuman muscle satellite cells following acute muscle damage[J].PLoS One，2011，6 （3）：e17392.

[9]Wilborn CD，Taylor LW，Greenwood M，et al.Effects of different intensities of resistance exercise on regulators of myogenesis[J].J Strength Cond Res，2009，23（8）：2179-2187.

[10]劉黎軍，朱家愷，顧熊飛.許旺細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)作用 [J].中華顯微外科雜志，2000，23 （1）：39-41.

[11]SonYJ，ThompsonWJ.Schwanncellprocessesguide regeneration of peripheral axons[J].Neuron，1995，14（1）：125-132.

[12]Skene JH，Shooter EM.Denervated sheath cells secrete a new protein after nerve injury[J].Proc Natl Acad Sci USA，1982，80 （13）：4169-4173.

Effects of Schwann cell-derived neurotrophic factor andhepatocyte growth factor on activity of rats'muscle satellite cells in vitro

Wu Jiang,Xu Yongqing,Zhu Min,Zhu Chongtao,Chen XushengTrauma and Orthopaedics Research Institute of PLA,Kunming Generalhospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China

ObjectiveTo study the effects of Schwann cell-derived neurotrophic factor(SDNF)andhepatocyte growth factor on the proliferation and differentiation of rats'muscle satellite cells(MSCs)in vitro.MethodsRats'muscle satellite cell culturing systems in vitro were established and divided into four groups according to the different culture media:group A:10%FBS;group B: 10%FBS+400 ng/ml SDNF;group C:10%FBS+200 ng/mlhGF;group D:10%FBS+400 ng/ml SDNF+200 ng/mlhGF.MSCs were treated with various SDNF concentrations culture medium.The shape of MSCs was observed dynamically and cell growth curve,and the formation rate of myotube was determined.ResultsThe culturing media containing different factors all could promote the proliferation of MSCs.The MTT detection results indicated that the cell growth in group C and D was prosperous,but there was no significant difference in the growth among group B,C,and D(P>0.05).However,the cellular proliferation in group A was slower than that in the other three groups(P<0.05).The other three groups'cell fusion numbers increased significantly compared with that in group A,and the formation of myotube in group B and D was fairly obvious(P<0.01).ConclusionHGF plays major role in MSCs activation and proliferation,while SDNF can regulate the differentiation of rats'MSCs in vitro.The effects of the two kinds of factors interact and promote each other.

muscle satellite cell;Schwann cell-derived neurotrophic factor;hepatocyte growth factor;proliferation;differentiation

Q813.11/R685

A

1004-0188（2016）01-0001-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.01.001

云南省應(yīng)用科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2010ZC180）

650032昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院全軍創(chuàng)傷骨科研究所

1.3觀測(cè)指標(biāo)（1）形態(tài)變化：每天換液后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)變化。（2）肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的評(píng)價(jià)：即MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，評(píng)定增殖能力，篩選出促增殖的最佳條件培養(yǎng)基。（3）肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的評(píng)價(jià)：觀測(cè)分化時(shí)間（肌管最早出現(xiàn)的小時(shí)數(shù)）和肌管形成率（即10個(gè)視野的肌管數(shù)總和與對(duì)應(yīng)的細(xì)胞總數(shù)的百分比），評(píng)估分化能力，篩選出成肌效果最好的條件培養(yǎng)基。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)比較采用方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

（2015-07-17）