智力發(fā)育遲緩新候選基因POSTN對(duì)腦損傷神經(jīng)元體外保護(hù)作用研究

林伊鳳　楊　琳　馬思敏　盧宇藍(lán)　王慧君　陳龍霞　周文浩

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·論著·

智力發(fā)育遲緩新候選基因POSTN對(duì)腦損傷神經(jīng)元體外保護(hù)作用研究

林伊鳳1楊琳2馬思敏3盧宇藍(lán)2王慧君2陳龍霞3周文浩3

目的通過對(duì)1例智力發(fā)育遲緩患兒全外顯子組測(cè)序(WES)，旨在為該患兒尋找潛在的致病原因。方法納入1例在復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)住院期間診斷不明患兒，采用SureSelct Human All Exon捕獲試劑盒和Illumina HiSeq2000測(cè)序平臺(tái)，行WES檢測(cè)；數(shù)據(jù)分析采用我院分子診斷中心建立的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析流程；結(jié)果采用Sanger直接測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。建立體外大鼠神經(jīng)元原代培養(yǎng)和糖氧剝奪(OGD)模型，分為空白對(duì)照組(Sham+PBS亞組、Sham+POSTN亞組)、OGD組(OGD+PBS亞組和OGD+POSTN亞組)，采用免疫熒光、LDH毒性檢測(cè)、BrdU和TUNEL方法檢測(cè)POSTN對(duì)2組及其亞組神經(jīng)元生長增殖和凋亡的影響。結(jié)果患兒WES共檢測(cè)到532 151個(gè)變異，篩選后檢測(cè)到POSTN基因(NM_006475)外顯子23:c.A2475T:p.G825G和外顯子19:c.G2251A:p.E751K。Sanger測(cè)序顯示p.G825G來自母親，p.E751K來自父親，符合復(fù)合雜合遺傳模式。培養(yǎng)的大鼠原代神經(jīng)元(MAP-2或NeuN陽性細(xì)胞)中有內(nèi)源性POSTN的表達(dá)。LDH活性Sham+POSTN亞組與Sham+PBS亞組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OGD+POSTN亞組與OGD+PBS亞組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OGD+PBS亞組致神經(jīng)元細(xì)胞缺氧2、6、12 d后比Sham+PBS亞組BrdU陽性的神經(jīng)元數(shù)量增高，TUNEL陽性神經(jīng)元凋亡也增高；OGD+POSTN亞組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元增殖較OGD+PBS亞組均明顯增高，但凋亡減少。結(jié)論P(yáng)OSTN可以減少腦損傷后LDH對(duì)于神經(jīng)元的細(xì)胞毒性，促進(jìn)損傷后神經(jīng)元的增殖，抑制凋亡。

POSTN基因；突變；全外顯子序列檢測(cè)；神經(jīng)元

AbstractObjectiveIn this study, whole-exome sequencing was used to identify pathogenic mutations in a newborn with cerebral dysplasia. MethodsThe exome targets of the patient′s DNA was captured with the SureSelct Human All Exon kit followed by sequencing with the Illumina HiSeq2000 platform. The data analysis pipeline of Children′s Hospital of Fudan University was used for the annotation and variant calling. The detected variant was confirmed with Sanger direct sequencing. Neurons were isolated from neonatal rats and the oxygen-glucose deprivation (OGD) model was established. The cultured neurons were divided into 2 control group (Sham+PBS and Sham+POSTN subgroups) and OGD group (OGD+PBS and OGD+POSTN subgroups). Immunofluorescence, LDH cytotoxicity detection, BrdU staining and TUNEL staining were used to detect the proliferation and apoptosis of cultured neurons.ResultsWhole-exome sequencing identified total of 532 151 variants in the proband, and revealed two novel compound heterozygous variants in exon 23:c.A2475T:p.G825G and exon 19:c.G2251A:p.E751K inPOSTN(NM_006475) gene. Sanger direct sequencing confirmed these two variants. POSTN was expressed in the cultured rat neurons (MAP-2 and NeuN positive cells). LDH cytotoxicity in Sham+POSTN subgroup was compromised with Sham+PBS subgroup. However, POSTN protected neurons from LDH cytotoxicity in OGD groups. The neurons were treated with OGD for 2, 6, 12 days, compared with Sham+PBS subgroups, the proliferation of neurons was increased in OGD+PBS subgroup as well as apoptosis of neurons. After POSTN treatment, the number of proliferative neurons was markedly increased in OGD group, however, the apoptotic neuron number was significantly decreased.ConclusionPOSTN treatment decreased LDH cytotoxicity, increased the proliferation and decreased apoptosis of OGD-treated neurons.

細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用越來越受到關(guān)注，其中的糖蛋白(如纖連蛋白)，對(duì)神經(jīng)元保護(hù)、神經(jīng)突起生長和神經(jīng)干細(xì)胞遷移都具有不同作用[1]。Periostin(POSTN)是一種93 kD的分泌性細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，表達(dá)和作用于多種細(xì)胞和組織。POSTN能通過成骨細(xì)胞增殖、分化、黏附和生長促進(jìn)骨組織發(fā)育和重構(gòu)[2]。Shimamura等[3,4]報(bào)道POSTN在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，在成年小鼠休克模型中，POSTN對(duì)缺血大腦具有神經(jīng)保護(hù)作用。近年來研究證明，POSTN在成熟皮質(zhì)神經(jīng)元中具有神經(jīng)保護(hù)作用[3]，在小腦顆粒神經(jīng)元中可促進(jìn)神經(jīng)突起生長[5]。

截止目前，尚未建立POSTN基因異常與疾病的明確關(guān)聯(lián)性。POSTN基因敲除小鼠新生兒期病死率為14%，并有明確的結(jié)構(gòu)畸形。常見的缺陷為心肌、平滑肌的異常，軟骨蛋白多糖的錯(cuò)誤表達(dá)，并可抑制TGF-β信號(hào)通路[6]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，POSTN可以促進(jìn)腦損傷大鼠腦組織中SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，改善腦損傷大鼠空間學(xué)習(xí)能力[7]。

1　病例報(bào)告

2　方法

2.1DNA提取及全外顯子組捕獲采用QIAGEN公司mini blood全血試劑盒及其標(biāo)準(zhǔn)DNA抽提方法提取基因組DNA(gDNA)，用美國Thermofisher公司NanoDrop紫外分光光度儀測(cè)定樣本的濃度及定量。參照SureSelct Human All Exon試劑盒說明書，gDNA經(jīng)過超聲打斷、末端修復(fù)、接頭連接和雜交捕獲。捕獲文庫采用Illumina HiSeq2000平臺(tái)行序列檢測(cè)。

2.2測(cè)序數(shù)據(jù)初步分析原始圖像文件經(jīng)Illumina base calling 軟件1.7進(jìn)行圖像識(shí)別(Base calling)，去除污染及接頭序列處理后。Clean reads采用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)軟件v.0.5.9-r16，以人類基因組hg19(GRCh37)為參考序列行比對(duì)。采用SAMtools軟件v.0.1.16，對(duì)生成的BAM文件行排序、合并和去除重復(fù)。生成初步分析數(shù)據(jù)包括：reads長度分析、數(shù)量及總產(chǎn)量、reads比對(duì)到參考序列的總序列在基因組中的覆蓋度(Coverage)與測(cè)序深度(Depth)等。采用SOAPsnp軟件 v.1.05進(jìn)行SNV分析。低可信度SNPs將被排除：①測(cè)序深度<4；②對(duì)于一致性的質(zhì)量評(píng)分<20；③鄰近區(qū)域平均拷貝數(shù)>2；④與前1個(gè)SNV距離<5 bp。

2.3WES數(shù)據(jù)篩選流程嚴(yán)格按照我院分子診斷中心建立的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)流程[9]。檢測(cè)變異采用ANNOVAR和VEP參照hg19人類基因組參考序列進(jìn)行注釋，對(duì)1 000 Genomes phase Ⅲ、ExAC進(jìn)行手工注釋。通過SIFT(Sorting Intolerant From Tolerant)，Polyphen2(Polymorphism Phenotyping)和MutationTaster軟件預(yù)測(cè)單氨基酸替換對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響。

2.4Sanger測(cè)序驗(yàn)證檢測(cè)的變異采用Primer 3在線行引物設(shè)計(jì)，使用KAPA 2G Robust Hot Start ReadMix進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。通過Sanger直接測(cè)序法(3500XL Genetic Analyzer，ABI)驗(yàn)證。

2.5神經(jīng)元培養(yǎng)和糖氧剝奪(OGD)模型制備取24 h內(nèi)新生的SPF級(jí)SD大鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供)，碘酒、乙醇消毒后斷頭，去除顱骨，在冰上完整剝離腦膜，分離皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元，剪碎腦組織至1 mm×1 mm×1 mm，0.125%胰酶消化30 min，種植培養(yǎng)液(DMEM/F12培養(yǎng)液+10%胎牛血清+青霉素、鏈霉素雙抗)中止消化，緩慢吹打，以種植培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以4×105·mL-1密度分別接種于多聚賴氨酸鋪板的6孔培養(yǎng)板上，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，12 h后全量更換為維持培養(yǎng)液(Neurobasal培養(yǎng)液+B27添加物+青霉素、鏈霉素雙抗)，每2～3 d更換一半培養(yǎng)液。

將DMEM(無糖,含L-谷氨酰胺)培養(yǎng)基通入含有99.95% N230 min以排出培養(yǎng)基中的溶解O2。將培養(yǎng)基換成經(jīng)氮?dú)馓幚淼臒o糖培養(yǎng)基，細(xì)胞放入缺氧箱后，95%N2+5%CO2混合氣體通氣，流量2 L·min-1，當(dāng)氧含量降至0.1%左右時(shí)通氣結(jié)束，將缺氧箱放入37℃培養(yǎng)箱，30 min后取出更換神經(jīng)元培養(yǎng)基。

2.6LDH毒性檢測(cè)神經(jīng)元經(jīng)過30 min OGD及POSTN或PBS處理24 h后，取細(xì)胞使用Roche試劑盒檢測(cè)LDH釋放，評(píng)估細(xì)胞毒性。根據(jù)試劑盒提供方法，實(shí)驗(yàn)開始前設(shè)背景對(duì)照組(只加培養(yǎng)基)，未處理細(xì)胞組(作為低LDH活性對(duì)照)，高LDH活性對(duì)照組(即在檢測(cè)前將細(xì)胞裂解試劑直接加至該組樣品中)。96孔板中，待測(cè)樣品每孔加入100 μL反應(yīng)液(高LDH活性對(duì)照組每孔加入5 μL裂解液)室溫放置10 min，每孔加入50 μL終止液。492 nm波長下檢測(cè)吸光度值。細(xì)胞毒性數(shù)值按照如下公式計(jì)算：[(樣品值-背景對(duì)照值)-(低LDH活性對(duì)照值-背景對(duì)照值)]/[(高LDH活性對(duì)照值-背景對(duì)照值)-(低LDH活性對(duì)照值-背景對(duì)照值)]。

2.7免疫熒光染色BrdU以10 μmol·L-1的終濃度在OGD第2、6、12 d加入培養(yǎng)基中，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行BrdU免疫熒光染色。4%PA固定15 min后，經(jīng)0.01 mol·L-1PBS漂洗，1∶1甲酰胺∶2×SSC，65℃ 1 h后，細(xì)胞經(jīng)2 mol·L-1HCl 37℃ 30 min，細(xì)胞經(jīng)0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH 7.6)，Tris-A(含0.1% Trition X-100的Tris-HCl、pH 7.6緩沖液)及Tris-B(含0.1% Trition X-100、1%羊血清的Tris-HCl pH 7.6緩沖液)各漂洗15 min，細(xì)胞加入小鼠抗BrdU(1∶400)一抗室溫孵育2 h后，4℃過夜，第2天取出玻片0.01 mol·L-1PBS漂洗后加入Rodamin熒光二抗室溫孵育1 h，細(xì)胞經(jīng)0.01 mol·L-1PBS漂洗后，使用含有DAPI的封片劑封片。BrdU陽性表示為神經(jīng)元增殖。

1.2 檢查方法與儀器 采用美國GE公司生產(chǎn)的Discovery VCT 64型PET/CT儀。患者檢查前禁食6 h以上，血糖<10 mmol/L；按體質(zhì)量靜脈注射18F-FDG(上海原子科興藥業(yè)有限公司)4.44 MBq/kg。安靜休息約60 min后進(jìn)行顯像，掃描范圍自顱頂至股骨中部。全身常規(guī)CT掃描(電壓120 kV，電流140 mA，層厚3.75 mm，螺距0.516)。PET掃描以三維(3D)模式采集，2 min/床位，通常每次采集7～8個(gè)床位。

2.8TUNEL檢測(cè)在OGD的第2、6、12 d對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行TUNEL免疫熒光染色, 凋亡率以TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI總細(xì)胞數(shù)表示。TUNEL染色步驟：細(xì)胞爬片經(jīng)4%多聚甲醛固定25 min后，經(jīng)0.01 mol·L-1PBS漂洗，經(jīng)0.2%Triton X-100作用5 min后，0.01 mol·L-1PBS漂洗，在平衡液E buffer中平衡8 min，加入TdT反應(yīng)液37℃孵育1 h后，使用2×SSC作用15 min終止反應(yīng)，經(jīng)0.01 mol·L-1PBS漂洗，用含有DAPI的封片劑封片。在40倍熒光顯微鏡下每張取5～6個(gè)視野爬片，將照片導(dǎo)入IPP軟件對(duì)雙標(biāo)細(xì)胞和DAPI總細(xì)胞分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算兩者比值。

3　結(jié)果

3.1WES數(shù)據(jù)分析

3.1.1先證者WES初步數(shù)據(jù)結(jié)果數(shù)據(jù)量63.82 Mb，平均讀長150 bp，目的區(qū)段數(shù)據(jù)量63.57 Mb，測(cè)序深度130×，錯(cuò)配0.44%，目的區(qū)域覆蓋91.33，側(cè)翼區(qū)域覆蓋87.33，深度>20×97.99%。

3.1.2WES數(shù)據(jù)分析共檢測(cè)到532 151個(gè)變異(包括SNV及InDel)，經(jīng)過質(zhì)量控制篩選、變異頻率篩選、變異分類篩選，剩余272個(gè)變異。其中148個(gè)變異所在基因在OMIM及HGMD數(shù)據(jù)庫與疾病相關(guān)。根據(jù)家系數(shù)據(jù)信息，常染色體顯性遺傳疾病的致病基因上檢測(cè)到9個(gè)新發(fā)變異，均與先證者表型不符合；常染色體隱性遺傳疾病的致病基因上檢測(cè)到18個(gè)符合遺傳模式的變異，其中POSTN、SYNE1可能與先證者表型符合；X連鎖遺傳疾病的致病基因上檢測(cè)到3個(gè)符合遺傳模式的變異，其中RPS6KA3可能與先證者表型符合。人工分析SYNE1基因突變導(dǎo)致脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào), 常染色體隱性遺傳8型,MIM:610743，主要為小腦退行性變，導(dǎo)致進(jìn)展性步態(tài)不協(xié)調(diào)、共濟(jì)失調(diào)，與先證者表型不符合；RPS6KA3基因突變導(dǎo)致精神發(fā)育遲滯, X連鎖19型, MIM:300844，患者通常會(huì)有特殊面容、骨骼畸形、指趾畸形，與先證者表型不符合；故不支持SYNE1和RPS6KA3基因變異位點(diǎn)為先證者致病突變。

POSTN基因(NM_006475)上2個(gè)變異，其中外顯子23:c.A2475T:p.G825G為同義變異，但位于23號(hào)外顯子起始位置，MutationTaster(http://www.mutationtaster.org)預(yù)測(cè)影響剪切，為可能致病變異；外顯子19:c.G2251A:p.E751K為錯(cuò)義變異，Polyphen2及MutationTaster均預(yù)測(cè)為有害變異，可能影響蛋白質(zhì)功能。

3.2Sanger驗(yàn)證針對(duì)POSTN基因檢測(cè)到的2個(gè)變異位點(diǎn)，3500XL序列分析儀(ABI)行Sanger驗(yàn)證，p.G825G來自母親，p.E751K來自父親，符合復(fù)合雜合遺傳模式。

3.3海馬神經(jīng)元POSTN表達(dá)情況原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)7 d，免疫熒光法檢測(cè)神經(jīng)元內(nèi)POSTN表達(dá)情況。分別以MAP-2、NeuN標(biāo)記成熟神經(jīng)元，圖1顯示，培養(yǎng)的原代神經(jīng)元(MAP-2或NeuN陽性細(xì)胞)中有內(nèi)源性POSTN的表達(dá)。

圖1POSTN大鼠原代神經(jīng)元中的表達(dá)(×400)

3.4神經(jīng)元損傷情況培養(yǎng)的原代神經(jīng)元分為2組，空白對(duì)照組(Sham+PBS亞組、Sham+POSTN亞組)、OGD組(OGD+PBS亞組和OGD+POSTN亞組)?？瞻讓?duì)照組或OGD組細(xì)胞，經(jīng)PBS或POSTN處理24 h后，LDH釋放試驗(yàn)檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞損傷。結(jié)果顯示，Sham+POSTN亞組LDH活性與Sham+PBS亞組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；OGD+PBS亞組致神經(jīng)元缺氧后，LDH活性較Sham+PBS亞組增高，OGD+POSTN亞組LDH活性較OGD+PBS亞組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05(圖2)。

圖2LDH活性試驗(yàn)檢測(cè)各組神經(jīng)元損傷情況

3.5POSTN對(duì)神經(jīng)元增殖和凋亡影響原代培養(yǎng)的神經(jīng)元經(jīng)OGD處理后POSTN分別干預(yù)2、6和12 d，BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)神經(jīng)元增殖。TUNEL免疫熒光染色顯示神經(jīng)元凋亡。結(jié)果顯示，OGD+PBS亞組致神經(jīng)元細(xì)胞缺氧2、6和12 d后較Sham+PBS亞組，神經(jīng)元MAP-2和 BrdU陽性的神經(jīng)元數(shù)量增高，TUNEL陽性凋亡神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量也增高；OGD+POSTN亞組處理2、6和12 d后神經(jīng)元增殖較OGD+PBS亞組均明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01(圖3)，且2、6和12 d后神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05(圖4)。

圖3　BrdU染色檢測(cè)各組不同時(shí)點(diǎn)神經(jīng)元增殖情況

圖4TUNEL染色檢測(cè)各組不同時(shí)點(diǎn)神經(jīng)元凋亡情況

注藍(lán)色: 神經(jīng)元細(xì)胞核; 綠色: TUNEL陽性細(xì)胞

4　討論

POSTN參與調(diào)節(jié)高血壓和心肌梗死引起的心肌肥大反應(yīng)、間質(zhì)纖維化和心室重建。小鼠心臟過度表達(dá)POSTN可以保護(hù)心肌梗死引起的心臟破裂[10]。POSTN直接作用于神經(jīng)元促進(jìn)神經(jīng)突起生長的作用依賴于FAK和Akt信號(hào)通路的激活[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在分化的神經(jīng)干細(xì)胞中POSTN表達(dá)明顯增加；在POSTN敲除小鼠海馬區(qū)增殖和分化的神經(jīng)干細(xì)胞無明顯差異；培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞中加入重組POSTN可促進(jìn)其增殖并向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，改善腦損傷大鼠空間學(xué)習(xí)能力[7]。

本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在空白對(duì)照組中分別給予POSTN和PBS處理后，LDH活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但對(duì) OGD組分別給予POSTN和PBS處理后，LDH活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OGD+POSTN亞組2、6和12 d神經(jīng)元增殖較OGD+PBS亞組均明顯增高,但凋亡細(xì)胞減少。說明POSTN可以減少腦損傷后LDH對(duì)于神經(jīng)元的細(xì)胞毒性，促進(jìn)損傷后神經(jīng)元的增殖，抑制凋亡。

本文結(jié)果為后續(xù)構(gòu)建POSTN突變質(zhì)粒，建立條件性神經(jīng)元POSTN基因突變小鼠模型，觀察基因突變小鼠表型改變以及POSTN突變對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響做了必要鋪墊。分離突變小鼠和正常小鼠神經(jīng)元，通過CHIPseq和RNAseq分析POSTN下游目的基因和可能參與的信號(hào)通路，通過組織學(xué)和生物化學(xué)方法對(duì)CHIPseq和RNAseq結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，選擇相應(yīng)的激動(dòng)劑或抑制劑治療突變小鼠，觀察突變小鼠表型和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育改變，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察正常小鼠、突變小鼠和治療后突變小鼠在記憶、學(xué)習(xí)、運(yùn)動(dòng)功能變化。通過一系列基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)POSTN基因是否是導(dǎo)致智力發(fā)育遲緩的致病基因及其相關(guān)致病機(jī)制。

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(本文編輯：張崇凡)

Study on the pretective effect of a novel cerebral dysplasia gene, POSTN on cultured neurons from OGD injury in vitro

LINYi-feng1,YANGLin2,MASi-min3,LUYu-lan2,WANGHui-jun2,CHENLong-xia3,ZHOUWen-hao3

(1InstituteofPediatrics, 2MolecularDiagnosticCenter, 3DepartmentofNeonatology,Children′sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102,China)

ZHOU Wen-hao，E-mail:zwhchfu@126.com

POSTNgene; Mutation; Whole-exome sequencing; Neuron

衛(wèi)生局重要疾病攻關(guān)項(xiàng)目：2013ZYJB0015；國家自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目：81401010；上海市浦江人才計(jì)劃：14PJ1401700

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院1 兒科研究所，2 分子診斷中心，3 新生兒科上海，201102

周文浩，E-mail:zwhchfu@126.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2016.03.013

2016-05-13

2016-06-15)