20種中草藥提取物對4種常見病原菌體外抑菌試驗

呂　彪，宋志元，儲　君，孫雪峰，張要齊*

（1.河南省新密市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南新密452370；2.河南惠通天下生物工程有限公司，河南新鄭451162）

20種中草藥提取物對4種常見病原菌體外抑菌試驗

呂彪1，宋志元2，儲君2，孫雪峰2，張要齊*2

（1.河南省新密市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南新密452370；2.河南惠通天下生物工程有限公司，河南新鄭451162）

∶為了觀察中草藥對病原菌的體外抑菌效果，本試驗采用水煎煮法提取大黃、黃連和黃芩等20種中草藥活性成分，利用試管二倍稀釋法分別測定中草藥提取物對4種常見病原菌（豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌和大腸桿菌）的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。結(jié)果顯示，大黃、黃連、黃芩、地錦草、石榴皮和白頭翁等對大腸桿菌的體外抑菌效果較好，其中大黃和黃連的效果最好；大黃對巴氏桿菌的體外抑菌效果較好，MIC為62.5mg/ml；黃連、黃柏和白頭翁對豬鏈球菌的體外抑菌效果較好，其中黃連的MIC＜1.95mg/ml，MBC為31.25mg/ml；黃連、黃柏、大黃和柴胡對金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果較好，其中黃連和黃柏的MIC分別為3.91和15.6mg/ml。

∶體外抑菌；試管二倍稀釋法；最小抑菌濃度；最小殺菌濃度

隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活水平的提高，肉類消費品的需求量大幅提高，畜禽養(yǎng)殖朝著規(guī)?；推髽I(yè)化的方向發(fā)展。但由細菌引起的疾病對養(yǎng)殖業(yè)沖擊很大，研究表明細菌是引起畜禽動物常見病和多發(fā)病的根源之一［1.2］，如大腸桿菌、豬鏈球菌、巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌等。目前，養(yǎng)殖行業(yè)對細菌性疾病的防治普遍使用抗生素及化學合成藥物，導致了致病性細菌產(chǎn)生耐藥性，細菌耐藥性又加重了抗生素及化學合成藥物的濫用，從而造成肉類食品藥物殘留加大，威脅著人們的健康。

在我國，中草藥用于治療動物疾病有著悠久的歷史，與抗生素及化學合成藥物相比，中草藥具有不易使細菌產(chǎn)生耐藥性，藥物殘留低，增強動物免疫力等優(yōu)點［3.4］。隨著人們對抗生素認識加深，越來越多的研究者把注意力轉(zhuǎn)向了中草藥。本試驗旨在考察20種中草藥提取物對大腸桿菌、豬鏈球菌、巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果，為中草藥及其復方制劑治療細菌性疾病方面的研究提供基礎(chǔ)。

1　材料

1.1中草藥板藍根、柴胡、金銀花、黃芩、黃連、黃柏、石榴皮、穿心蓮、菊花、防風、地錦草、馬齒筧、仙鶴草、白頭翁、吳茱萸、龍膽草、大黃、魚腥草、獨活、香薷等，均購自河南省禹州市中藥材批發(fā)行，所有藥物經(jīng)檢定均符合生藥質(zhì)量標準。

1.2菌種豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌和巴氏桿菌均購自中國獸醫(yī)檢查所；大腸桿菌由河南科技學院微生物實驗提供。

1.3培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基∶蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl10g，葡萄糖2g，加純水1000ml，pH7.3±0.1。其中培養(yǎng)豬鏈球菌時，需添加5%胎牛血清。

瓊脂培養(yǎng)基∶在液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂。

1.4試劑和儀器酵母浸粉、蛋白胨和瓊脂粉，葡萄糖和氯化鈉。

蒸汽滅菌鍋、酸度計、磁力加熱攪拌器、電熱恒溫培養(yǎng)箱和超凈工作臺。

2　方法

2.1藥液的制備精密稱取每味中藥各60g，加8倍量蒸餾水煎煮沸騰后改用文火煎1h，期間始終保持8倍量水，用4層紗布過濾∶殘渣加6倍量水同法煎煮1h后過濾，合并兩次濾液，減壓濃縮至60ml，使其濃度為1g/ml。

2.2菌液的制備挑取一環(huán)斜面菌種，接種至普通肉湯培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24h。用滅菌空白培養(yǎng)基校正菌液濃度，使活菌數(shù)為1～2×106 CFU/ml，備用。

2.3最小抑菌濃度（MIC）的測定采用試管二倍稀釋法［5］測定藥液對各供試菌的MIC。具體操作∶（1）取滅菌有棉塞試管11支，進行編號，編號后每管先加入與試驗菌種對應(yīng)的培養(yǎng)基2.0ml，然后于第一管中加入滅菌的受試藥液2.0ml，混勻后取出2.0ml放入第2管中，依次作2-1～2-9的梯度稀釋，直到第9管取出2.0ml棄去；第10管不加藥液，作為陽性對照；第11管加受試藥液2.0ml，混勻后取出2.0ml棄去，不加細菌，作為陰性對照，各管平行3份。（2）取細菌稀釋液0.1ml分別加入上述1～10管中混勻，11號管加0.1ml滅菌生理鹽水，注意每次移液要更換新的移液管，然后置各管于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。

2.4最小殺菌濃度（MBC）的測定挑取一環(huán)MIC終點濃度以上未生長細菌的各稀釋管內(nèi)培養(yǎng)物，劃線于與菌種對應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h，觀察有無細菌生長，培養(yǎng)基中無細菌生長的最低濃度即為受試藥液的最低殺菌濃度。

表1　20種中草藥對大腸桿菌的體外抑菌試驗結(jié)果（最小抑菌濃度和最小殺菌濃度）（mg/ml）

表2　20種中草藥對巴氏桿菌的體外抑菌試驗結(jié)果（最小抑菌濃度和最小殺菌濃度）（mg/ml）

3　結(jié)果與分析

3.120種中草藥對大腸桿菌的MIC和MBC

表1顯示了20種中草藥對大腸桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，結(jié)合最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，結(jié)果表明大黃、黃連、黃芩、地錦草、石榴皮和白頭翁等對大腸桿菌的抑菌效果較好，但也有差異。其中大黃和黃連對大腸桿菌的抑菌效果最好，MIC分別為15.63和31.25mg/ml，MBC分別為125和62.5mg/ml；黃芩、地錦草、石榴皮和白頭翁次之。其它中草藥對大腸桿菌的抑菌效果較差，其MIC和MBC均≥250mg/ml。

3.220種中草藥對巴氏桿菌的MIC和MBC

表2顯示了20種中草藥對巴氏桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，結(jié)果表明大黃對巴氏桿菌的抑菌效果最好，MIC和MBC分別為62.5 和500mg/ml。黃連次之，MIC和MBC分別125和500mg/ml。其它中草藥對巴氏桿菌的抑菌效果較差，MIC和MBC均≥250mg/ml，其中石榴皮、魚腥草、穿心蓮和吳茱萸對巴氏桿菌沒有抑菌效果。

3.320種中草藥對豬鏈球菌的MIC和MBC

表3顯示了20種中草藥對豬鏈球菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，結(jié)果表明黃連對豬鏈球菌的抑菌效果較好，MIC＜1.95mg/ml，MBC為31.25mg/ml；黃柏和白頭翁次之，MIC均為62.5 mg/ml，MBC均為500mg/ml；其它中草藥對豬鏈球菌的抑菌效果較差，其中防風、柴胡、吳茱萸、黃芩、龍膽草、穿心蓮、魚腥草、金銀花和大黃對豬鏈球菌沒有抑菌效果。

3.420種中草藥對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC

表4顯示了20種中草藥對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，結(jié)果表明黃連和黃柏對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC分別為3.91和15.6mg/ml，MBC分別為125和500 mg/ml；大黃和柴胡次之，MIC均為62.5mg/ml，MBC分別為250和500mg/ml；其它中草藥的抑菌效果較差，其中板藍根、吳茱萸、黃芩和防風對金黃色葡萄球菌沒有抑菌效果。

表3　20種中草藥對豬鏈球菌的體外抑菌試驗結(jié)果（最小抑菌濃度和最小殺菌濃度）（mg/ml）

表4　20種中草藥對金黃色葡萄球菌的體外抑菌試驗結(jié)果（最小抑菌濃度和最小殺菌濃度）（mg/ml）

4　結(jié)論與討論

4.1本試驗結(jié)果∶大黃、黃連、黃芩、地錦草、石榴皮和白頭翁等對大腸桿菌的體外抑菌效果較好，其中大黃和黃連的效果最好；大黃對巴氏桿菌的體外抑菌效果較好，MIC為62.5mg/ml；黃連、黃柏和白頭翁對豬鏈球菌的體外抑菌效果較好，其中黃連的MIC＜1.95mg/ml，MBC為31.25mg/ml；黃連、黃柏、大黃和柴胡對金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果較好，其中黃連和黃柏的MIC分別為3.91和15.6mg/ml。

4.2以上試驗結(jié)果說明很多中草藥具有抑菌效果，但不同中草藥對同一種菌的抑制效果不同，且同種中草藥對不同菌也有不同的抑制效果。中草藥的成分復雜，抑菌作用的機理和功能不同，其抑菌機制主要有［6］∶中草藥有效成分直接破壞病原菌細胞膜和細胞壁，干擾細菌的代謝作用；中草藥有效成分給機體提供營養(yǎng)，促進免疫器官的發(fā)育；中藥可以減輕5-羥色胺、組胺的血管通透性作用，抑制細胞的溢出，同時能增強組織和器官的機能，從側(cè)面達到抑菌的作用。

4.3本試驗為體外抑菌，體外抑菌效果可能跟體內(nèi)抑菌效果不同，需要進一步的驗證，但有研究表明∶中草藥可通過消除R質(zhì)粒［7］，抑制β-內(nèi)酰胺［8］，抑制病原菌的耐藥性［9］等方式，避免病原菌產(chǎn)生耐藥性，或?qū)δ退幘心孓D(zhuǎn)作用。在我國，中草藥用于養(yǎng)殖行業(yè)有著悠久的歷史，利用中草藥防治細菌性疾病，減少抗生素及化學合成藥物的使用，將會降低藥物殘留對人們的危害，同時也能促進中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展。

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S853.74

B

1003-8655（2016）04-0004-03

∶2016-03-18

∶新鄭市技術(shù)研究與開發(fā)經(jīng)費支持項目，項目編號2014PTG14。

∶呂彪，（1979-），獸醫(yī)師，碩士，E-mail∶lvbiao1979@126.com。

簡介∶張要齊，研究方向為農(nóng)業(yè)推廣，碩士，E-mail∶httx0371@126.com，