NOX1 siRNA對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡的影響*

夏艷秋，王　娜，闕菡雅，徐小艷，薛　騰，燕　貞，姚　武，劉　瑩，周　舫#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001　2)鄭州市疾病預(yù)防控制中心公共衛(wèi)生科 鄭州 450000　3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450052

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NOX1 siRNA對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡的影響*

夏艷秋1)，王娜1)，闕菡雅2)，徐小艷1)，薛騰1)，燕貞1)，姚武1)，劉瑩3)#，周舫1)#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 4500012)鄭州市疾病預(yù)防控制中心公共衛(wèi)生科 鄭州 4500003)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450052

A549細(xì)胞;NOX1;TNF-α;凋亡

目的：探討NOX1對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡的影響。方法：將A549細(xì)胞分為3組，空白組、TNF-α組和TNF-α+NOX1 siRNA組。TNF-α+NOX1 siRNA組細(xì)胞采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染特異性NOX1 siRNA，轉(zhuǎn)染12 h后用含TNF-α(10 μg/L)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；空白組和TNF-α組細(xì)胞分別用培養(yǎng)基和含TNF-α的培養(yǎng)基培養(yǎng)。48 h后，采用Annexin V-FITC和PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率，DCFH熒光標(biāo)記法檢測細(xì)胞中ROS的表達(dá)量,Western blot法檢測NOX1及p-JNK蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：與空白組相比，TNF-α組細(xì)胞凋亡率和ROS表達(dá)量升高(P<0.05)，NOX1和p-JNK蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與TNF-α組比較，TNF-α+NOX1 siRNA組細(xì)胞凋亡率和ROS表達(dá)量降低(P<0.05)，細(xì)胞中NOX1和p-JNK蛋白表達(dá)水平也降低(P<0.05)。結(jié)論：NOX1可能通過增加ROS的表達(dá)，進(jìn)而激活JNK/MAPK信號(hào)通路，引起A549細(xì)胞的凋亡。

肺癌是目前中國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，ROS作為第二信使參與細(xì)胞間信號(hào)通路的調(diào)控，它所介導(dǎo)的信號(hào)通路如MAPK、JNK、PI3K/Akt等對(duì)細(xì)胞的生長、增殖、凋亡起著重要的作用。機(jī)體產(chǎn)生ROS的途徑有很多，NADPH氧化酶NOX家族蛋白被認(rèn)為是ROS的主要來源[4]。肺癌發(fā)生發(fā)展過程中需要ROS的參與[2]。NOX家族蛋白在肺組織中有著不同程度的表達(dá)，其中NOX1在肺癌組織中的表達(dá)水平高于正常組織[5]。目前關(guān)于NOX家族蛋白的研究多集中在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化及急性肺損傷等，關(guān)于肺癌的研究較少。A549細(xì)胞為人肺腺癌細(xì)胞,可以穩(wěn)定傳代。已有研究[6]發(fā)現(xiàn)，NOX1是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)介導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激內(nèi)源性ROS生成的重要催化酶。作者采用TNF-α刺激A549細(xì)胞，并用siRNA沉默NOX1基因，觀察細(xì)胞凋亡率的改變，以及NOX1、p-JNK和ROS表達(dá)的改變，探討NOX1在A549細(xì)胞凋亡中的作用。

1　材料與方法

1.1材料A549細(xì)胞來自中科院上海細(xì)胞生物研究所，無支原體胎牛血清購自美國Gemini公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司，兔抗人NOX1單克隆抗體、兔抗人p-JNK單克隆抗體均購自英國Abcam公司，羊抗兔IgG購自美國Cell 公司，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自德國美天妮公司，Sunrise remote酶標(biāo)儀購于奧地利TECAN公司，DYCZ-24DN電泳儀購于北京市六一儀器廠，流式細(xì)胞儀購于美國BD公司。

1.2NOX1 siRNA對(duì)A549細(xì)胞的干擾效果檢測

1.2.1轉(zhuǎn)染將A549細(xì)胞密度調(diào)整到(0.8～1.0)×105mL-1后接種至6孔板，每孔加2 mL單細(xì)胞懸液。細(xì)胞融合達(dá)到50%～70%時(shí)，采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，Mock組、NC組和NOX1 siRNA組分別加入轉(zhuǎn)染試劑、陰性對(duì)照siRNA和FAM-NOX1 siRNA。siRNA均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。轉(zhuǎn)染6～12 h后更換新的無抗生素培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察熒光及轉(zhuǎn)染情況并拍照；然后制備單細(xì)胞懸液，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分類和計(jì)數(shù)；確定轉(zhuǎn)染條件使其轉(zhuǎn)染率穩(wěn)定在80%以上。

1.2.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞中NOX1 mRNA的檢測轉(zhuǎn)染24 h后，Real-Time PCR法檢測細(xì)胞中NOX1 mRNA的表達(dá)。PCR引物序列見表1。反應(yīng)體系25 μL：2×UltraSYBR Mixture 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，無RNase水8.5 μL。反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性10 min； 95 ℃變性15 s，59 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)。在60 ℃收集SYBR GreenⅠ信號(hào)。熔解曲線分析過程：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s 。以β-actin為內(nèi)參照。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算NOX1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

表1　PCR引物

1.3實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為空白組、TNF-α組及TNF-α+NOX1 siRNA組。將A549細(xì)胞按1.2.1篩選出的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染。空白組用培養(yǎng)基培養(yǎng)，TNF-α組用含10 μg/L TNF-α的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。TNF-α+NOX1 siRNA組細(xì)胞轉(zhuǎn)染NOX1 siRNA 12 h后用含10 μg/L TNF-α的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后進(jìn)行以下檢測。

1.4觀測指標(biāo)

1.4.1細(xì)胞凋亡率采用Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)雙染法檢測細(xì)胞凋亡率。用胰蛋白酶消化細(xì)胞，加入1×Binding Buffer 1 mL，1 000 r/min離心10 min,重復(fù)一次。加入1×Binding Buffer 100 μL吹打混勻,加入10 μL Annexin V-FITC避光混勻后放置15 min。用PBS清洗細(xì)胞2次，用1×Binding Buffer 500 μL重懸細(xì)胞后加入5 μL PI，立即上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。重復(fù)3次。

1.4.3細(xì)胞中ROS的表達(dá)采用DCFH熒光標(biāo)記法檢測細(xì)胞中ROS水平。按DCFH-DA終濃度為10 μmol/L加樣；清洗并消化細(xì)胞后，用稀釋好的探針重懸，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，每隔3～5 min顛倒混勻一次，使探針與細(xì)胞充分接觸；用PBS洗滌細(xì)胞3次，以除去未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA；用0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，用FL1收集DCF的熒光信號(hào)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各指標(biāo)的比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1NOX1 siRNA對(duì)A549細(xì)胞的干擾效果最終確定的A549細(xì)胞NOX1 siRNA的轉(zhuǎn)染條件為：6孔板；單細(xì)胞懸液密度為1.0×105mL-1,每孔2 000 mL；siRNA 8 μL/孔；Lipofectamine2000試劑4 μL/孔。在此條件下轉(zhuǎn)染24 h，Mock組、NC組及NOX1 siRNA組細(xì)胞中NOX1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平分別為(0.96±0.08)、(1.04±0.06)和(0.25±0.03)，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=103.380，P<0.001)，提示所選用的NOX1 siRNA在確定的轉(zhuǎn)染條件下可有效沉默A549細(xì)胞NOX1基因的表達(dá)。

2.23組細(xì)胞凋亡率的比較見表2。與空白組相比，TNF-α組和TNF-α+NOX1 siRNA組細(xì)胞凋亡率較高(P<0.05)；與TNF-α組比較，TNF-α+NOX1 siRNA組細(xì)胞凋亡率較低(P<0.05)。

2.33組細(xì)胞中NOX1和p-JNK蛋白表達(dá)水平的比較見圖1和表2。TNF-α組細(xì)胞NOX1與p-JNK蛋白表達(dá)水平較空白組升高(P<0.05)；TNF-α+NOX1 siRNA組較TNF-α組降低(P<0.05)。

1：空白組；2：TNF-α組；3：TNF-α+NOX1 siRNA組。圖1　3組A549細(xì)胞中NOX1及p-JNK 蛋白的表達(dá)

2.43組細(xì)胞中ROS表達(dá)量的比較見表2。與空白組相比，TNF-α組和TNF-α+NOX1 siRNA組ROS水平上升(P<0.05)；與TNF-α組比較，TNF-α+NOX1 siRNA組ROS水平下降(P<0.05)。

表2　3組細(xì)胞中NOX1和p-JNK蛋白表達(dá)水平、ROS表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率的比較

*：與空白組比較，P<0.05；#：與TNF-α組比較，P<0.05。

3　討論

研究[7]表明，NOX1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Arnold等[8]在一個(gè)小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，采用NOX1抑制劑過氧化氫酶抑制其表達(dá)后可減緩細(xì)胞的增殖，抑制腫瘤的形成。作者所在課題組前期實(shí)驗(yàn)篩選出能夠抑制NOX1表達(dá)的siRNA，用siRNA特異性抑制NOX1表達(dá)后能夠抑制A549細(xì)胞的增殖活性，降低細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)量，但是細(xì)胞凋亡率卻沒有明顯變化，可能與NOX家族的其他成員在A549細(xì)胞中的表達(dá)有關(guān)，各成員之間可能存在交互作用，共同調(diào)控細(xì)胞的凋亡通路[9]。

為了進(jìn)一步研究NOX1在A549細(xì)胞凋亡中的作用，作者采用TNF-α刺激A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞中ROS表達(dá)量升高，同時(shí)NOX1和p-JNK蛋白表達(dá)水平也升高；用siRNA抑制NOX1的表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞中ROS表達(dá)量和p-JNK蛋白表達(dá)水平也降低。TNF-α所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡一部分是通過NOX1及其產(chǎn)生的ROS來完成的。Zanetti等[10]發(fā)現(xiàn)尼古丁能夠通過激活NOX1而使內(nèi)源性ROS升高，從而導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞纖維化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；采用NOX1抑制劑或是NOX1 siRNA特異性抑制其表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率下降。這與作者此次研究的結(jié)果一致。TNF-α作用于細(xì)胞后，激活細(xì)胞內(nèi)的腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)，該受體與NOX1相結(jié)合后，位于啟動(dòng)子區(qū)域的NOX1結(jié)合蛋白GEL1和DDX19A表達(dá)量明顯上升，NOX1基因被激活[11]。NOX1蛋白表達(dá)水平上升引起相應(yīng)的ROS水平升高，激活JNK的磷酸化引起MAPK通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。由此可見，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，A549細(xì)胞中p-JNK表達(dá)水平與NOX1蛋白有關(guān)，NOX1可能通過影響ROS表達(dá)量來調(diào)控p-JNK的表達(dá)。JNK的活化與ROS 誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1) 有關(guān)，ASK1在ROS介導(dǎo)的JNK通路活化過程中起橋梁作用[12]。

綜上所述，NOX1可能通過增加ROS的表達(dá)，進(jìn)而激活JNK/MAPK信號(hào)通路，引起A549細(xì)胞的凋亡。

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(2016-03-21收稿責(zé)任編輯王曼)

Influence of NOX1 siRNA on apoptosis of A549 cells induced by TNF-α

XIAYanqiu1),WANGNa1),QUEHanya2),XUXiaoyan1),XUETeng1),YANZhen1),YAOWu1),LIUYing3),ZHOUFang1)

1)DepartmentofOccupationalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)DepartmentofPublicHealth,CenterforDiseasePreventionandControlofZhengzhou,Zhengzhou4500003)DepartmentofRespiratoryDiseases,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

A549 cell;NOX1;TNF-α;apoptosis

Aim: To investigate the effect of NOX1 on apoptosis of A549 cells induced by TNF-α. Methods: A549 cells were allocated into 3 groups:blank control group,TNF-α group and TNF-α+NOX1 siRNA group. Cells in TNF-α+NOX1 siRNA group were transfected with NOX1 siRNA through the transient transfection technology for 12 h,then cultured with TNF-α(10 μg/L) for 48 h. Cells in blank control group and TNF-α group were only cultured with medium and TNF-α(10 μg/L) for 48 h,respectively.After culture, the apoptosis rate was detected by Annexin V-FITC and PI staining,the ROS level in cells was detected by DCFH fluorescent probe method, and the expressions of NOX1 and p-JNK protein were detected through Western blot.Results: Compared with blank control group,the apoptosis rate,ROS level and the expres-sions of NOX1 and p-JNK were increased in TNF-α group(P<0.05); while compared with TNF-α group, the apoptosis rate,ROS level and the expressions of NOX1 and p-JNK were decreased in TNF-α+NOX1 siRNA group(P<0.05).Conclusion: NOX1 could increase ROS level, then active JNK/MAPK signal pathway, and induce A549 cell apoptosis.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.009

周舫，女，1974年7月生，博士，教授，研究方向：職業(yè)腫瘤和應(yīng)激醫(yī)學(xué)，E-mail： zhoufang23@sina.com；劉瑩，女，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：支氣管肺癌和支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制與早期診治，E-mail：66862001@163.com

*河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目16A330008

R734.2