hUC-MSCs和白藜蘆醇對AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦內(nèi)SIRT1信號通路的影響*

王欣欣，馬珊珊，孟　楠，邢　衢，黃團(tuán)結(jié)，程　康，楊　波，關(guān)方霞1,#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450052　2)鄭州大學(xué)生命科學(xué)院干細(xì)胞研究室 鄭州450001

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hUC-MSCs和白藜蘆醇對AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦內(nèi)SIRT1信號通路的影響*

王欣欣1)，馬珊珊2)，孟楠1)，邢衢2)，黃團(tuán)結(jié)2)，程康2)，楊波1)，關(guān)方霞1,2)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞研究室 鄭州 4500522)鄭州大學(xué)生命科學(xué)院干細(xì)胞研究室 鄭州450001

白藜蘆醇；人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；阿爾茨海默癥；SIRT1；小鼠

目的：探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)移植聯(lián)合白藜蘆醇(RES)灌胃對AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及對腦內(nèi)SIRT1信號通路的調(diào)控作用。方法：40只AD小鼠隨機分為AD組、hUC-MSCs組、RES組、hUC-MSCs聯(lián)合RES組(聯(lián)合組)，每組10只。干預(yù)8周后，用Morris水迷宮評估小鼠學(xué)習(xí)記憶能力；取小鼠腦組織，采用免疫組化法檢測Nestin的表達(dá)，TUNEL檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡，qRT-PCR檢測神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF和NT-3 mRNA的表達(dá)水平，Western blot法檢測SIRT1、PCNA、P53、P21和P16的表達(dá)。結(jié)果：hUC-MSCs與RES均可使AD小鼠逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增多，目的象限停留時間增加；海馬區(qū)再生細(xì)胞增多，凋亡細(xì)胞減少，BDNF、NGF和NT-3 mRNA表達(dá)水平升高，SIRT1和PCNA蛋白的表達(dá)增強，P53、P21、P16蛋白的表達(dá)減弱(P<0.05)。 hUC-MSCs和RES聯(lián)合對AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、神經(jīng)細(xì)胞再生、BDNF以及SIRT1蛋白的表達(dá)具有協(xié)同作用(P<0.05)。結(jié)論：hUC-MSCs移植和RES灌胃可能通過調(diào)控腦內(nèi)SIRT1信號通路共同促進(jìn)AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善。

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種與年齡相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變，臨床主要表現(xiàn)為認(rèn)知能力下降，病理學(xué)表現(xiàn)為腦內(nèi)淀粉樣沉積和纖維樣纏繞[1],目前仍無有效的干預(yù)措施。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子并具有神經(jīng)分化的潛能，在神經(jīng)損傷、神經(jīng)退行性變動物模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[2]。作者所在的課題組前期研究[3]發(fā)現(xiàn)MSCs移植可改善AD鼠的學(xué)習(xí)記憶能力且無明顯副作用，為治療AD提供了新途徑。白藜蘆醇(resveratrol,RES)是一種存在于葡萄等植物中的多酚類化合物，能通過激活SIRT1發(fā)揮抗衰老、保護(hù)神經(jīng)和延長壽命的作用[4]，并能夠促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的生存，調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)分化[5-6]。但是，RES是否能協(xié)同人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord derived MSCs,hUC-MSCs)移植治療AD尚不明確。該研究采用hUC-MSCs移植聯(lián)合RES灌胃干預(yù)AD小鼠，觀察AD鼠行為學(xué)和組織學(xué)改善，并探討SIRT1信號通路的介導(dǎo)作用。

1　材料與方法

1.1材料新生兒臍帶來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科(產(chǎn)婦簽署知情同意書)，經(jīng)分離、原代細(xì)胞培養(yǎng)傳代得到第4代(P4) hUC-MSCs用于移植。DMEM/F12培養(yǎng)基購自寶信生物科技有限公司，胎牛血清購自美國Gemini公司，RES購自美國Sigma公司，DNA小提試劑盒、Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司，抗體購自Santa Cruz公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物公司，SP二步法免疫組化二抗試劑盒、DAB染色試劑盒、蘇木精購于武漢博士德生物工程有限公司。APP695V717I轉(zhuǎn)基因小鼠購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)動物所。

1.2APP轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定、分組與處理APP695V717I轉(zhuǎn)基因小鼠具有腦內(nèi)APP過表達(dá)的特點，可模擬AD。剪取鼠尾約0.5 cm，提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，APP引物: 5’-CCCTGAACCTGAAA CATAAAAT-3’(上游引物)和5’-GCTACGAAAATC CAACCTACAA-3’ (下游引物)，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將經(jīng)鑒定確認(rèn)為APP+的小鼠隨機分為4組，每組10只，分別為:AD組(APP+小鼠), hUC-MSCs組 (尾靜脈移植 P4 hUC-MSCs 5×106mL-1，0.2 mL/只), RES組[RES灌胃200 mg/(kg·d)], RES+MSC組(hUC-MSC移植聯(lián)合RES灌胃)。8周后進(jìn)行以下指標(biāo)的檢測。

1.3Morris水迷宮檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力水迷宮水池直徑1.2 m，平臺直徑10 cm，位于水池第一象限，離液面1 cm。訓(xùn)練階段，小鼠首先于平臺上停留10 s以熟悉環(huán)境，然后從不同象限固定位置入水，若小鼠60 s內(nèi)未找到平臺，將其引至平臺停留10 s再進(jìn)行下一象限實驗。連續(xù)訓(xùn)練5 d，3次/d，第6天開始進(jìn)行空間探索實驗，撤去平臺，分別從4個象限固定位置入水，用攝像采集系統(tǒng)捕獲小鼠游泳軌跡，統(tǒng)計穿越平臺次數(shù)、逃避潛伏期和平臺所在象限停留時間等參數(shù)。

1.4免疫組化檢測小鼠腦組織Nestin蛋白的表達(dá)

1.5TUNEL檢測小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡取3只小鼠，處死取腦組織。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水， 0.01 mol/L枸櫞酸微波修復(fù)、冷卻后，用含TdT酶和FITC 標(biāo)記的dUTP的反應(yīng)液37 ℃孵育60 min(陰性對照組反應(yīng)液中不含TdT酶)，PBS清洗3次，DAPI染核10 min，PBS清洗3次，熒光顯微鏡下觀察拍照。用Image J軟件進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)。

1.6qRT-PCR檢測小鼠腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF、NGF、NT-3)mRNA的表達(dá)Trizol裂解法提取腦組織總RNA，測RNA濃度和純度后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，ROX Reference DyeⅡ 2 μL,cDNA 0.4 μL,上下游引物各0.8 μL，dH2O 6 μL。反應(yīng)條件：90 ℃ 5 min,90 ℃ 30 s,60 ℃ 34 s,40個循環(huán)。采用7500 Fast PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，獲得Ct值，采用2-ΔΔCt計算目的基因的表達(dá)水平。BDNF、NGF、NT-3及內(nèi)參GAPDH基因引物序列及產(chǎn)物片段長度見表1。

表1　實時熒光定量PCR引物序列及產(chǎn)物片段長度

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)。應(yīng)用析因設(shè)計的方差分析探討MSC移植和RES灌胃對水迷宮實驗結(jié)果、Nestin+和TUNEL+細(xì)胞數(shù)、腦組織神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA和SIRT1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1hUC-MSCs移植和RES灌胃對AD小鼠水迷宮測試結(jié)果的影響結(jié)果見表2。

2.2hUC-MSCs移植和RES灌胃對AD小鼠海馬組織Nestin+細(xì)胞數(shù)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果見表3。

2.3hUC-MSCs移植和RES灌胃對AD小鼠腦組織神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA表達(dá)的影響結(jié)果見表4。

表2　4組小鼠水迷宮測試結(jié)果

表3　4組小鼠海馬組織中Nestin+、凋亡神經(jīng)細(xì)胞計數(shù)

表4　4組小鼠腦組織神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA表達(dá)水平的比較

2.4hUC-MSCs移植和RES灌胃對AD小鼠腦內(nèi)SIRT1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響結(jié)果見表5。

表5　4組小鼠腦組織中SIRT1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

3　討論

該研究結(jié)果顯示，hUC-MSCs移植或RES灌胃能改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，促進(jìn)AD小鼠腦組織神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF、NT-3 mRNA的表達(dá),并能促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生(Nestin+細(xì)胞增多)，減少細(xì)胞凋亡(TUNEL+細(xì)胞減少)。此外，有研究[7]提出，移植的干細(xì)胞可整合到神經(jīng)系統(tǒng)替代受損細(xì)胞，因此該實驗中移植的hUC-MSCs在AD小鼠腦內(nèi)的存活與分化狀況尚需進(jìn)一步研究。

分子水平上，hUC-MSCs移植與RES灌胃均能上調(diào)小鼠腦組織SIRT1信號通路相關(guān)因子如SIRT1、PCNA蛋白的表達(dá)，下調(diào)P53、P21和P16蛋白的表達(dá)。 PCNA表達(dá)增高在一定程度上反映了神經(jīng)再生增強，因為PCNA是一種S期細(xì)胞增殖的標(biāo)志物[8]。P53表達(dá)增高與神經(jīng)元凋亡和退化相關(guān)[9]，AD鼠治療后P53蛋白表達(dá)下降，提示神經(jīng)凋亡減少。p53-p21是調(diào)控衰老的重要信號[10]，p16也是與衰老密切相關(guān)的基因[11]，而且其表達(dá)受SIRT1基因影響[12]。該研究中RES灌胃和hUC-MSCs移植治療后AD小鼠腦組織SIRT1增加伴隨著P53、P21和P16蛋白表達(dá)減少，提示抗衰老作用增強。因此，SIRT1及相關(guān)因子PCNA、 P53、 P21和P16的改變可能是hUC-MSCs和RES治療AD的分子機制。

另外，hUC-MSCs移植和RES灌胃聯(lián)合對AD鼠學(xué)習(xí)記憶能力、神經(jīng)細(xì)胞再生、BDNF以及SIRT1蛋白的表達(dá)具有協(xié)同作用。

綜上所述，RES和hUC-MSCs作用于AD小鼠可協(xié)同促進(jìn)神經(jīng)再生，抑制神經(jīng)凋亡，提高學(xué)習(xí)記憶能力。RES灌胃聯(lián)合hUC-MSCs移植有望成為一種更有效的AD治療手段。

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(2015-10-29收稿責(zé)任編輯徐春燕)

Effects of hUC-MSCs and resveratrol on learning and memory capability and SIRT signaling pathway in brain tissue of AD mice

WANGXinxin1)，MAShanshan2),MENGNan1)，XINGQu2),HUANGTuanjie2),CHENGKang2),YANGBo1)，GUANFangxia1,2)

1)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)StemCellLaboratory,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

resveratrol;human umbilical cord derived mesenchymal stem cell; Alzheimer′s disease;SIRT1;mouse

Aim: To investigate the effects of human umbilical cord derived mesenchymal stem cells(hUC-MSCs) transplantation and resveratrol(RES) gavage on the cognition of AD mice and SIRT1 signaling pathway in brain tissue. Methods: Forty AD mice were randomly allocated into AD group, hUC-MSCs group, RES group and hUC-MSCs combined with RES group(combined group). Eight weeks after intervention, Morris water maze was employed to evaluate the learning and memory capability; the brain tissue was prepared, immunohistochemistry was used to detect the expression of Nestin, TUNEL was used to detect cell apoptosis, qRT-PCR was used to examine the expressions of neurotropic factors BDNF, NGF and NT-3 mRNA,and Western blot was used to examine the expressions of SIRT1, PCNA, P53, P21 and P16 protein.Results: hUC-MSCs and RES could improve learning and memory capability, as evidenced by shorter latency, more crosses and time spent in the target quadrant in the Morris water maze; hUC-MSCs and RES could both enhance hippocampus neurogenesis,alleviate apoptosis,upregulate the expressions of BDNF, NGF and NT-3 mRNA as well as enhance the expressions of SIRT1 and PCNA and inhibit the expressions of P53, P21 and P16. Furthermore, hUC-MSCs and RES exerted synergistic effects on the learning and memory capability,regeneration of neuronal cells as well as upregulated the expressions of BDNF and SIRT1. Conclusion: hUC-MSCs transplantation and RES gavage could synergistically improve learning and memory capability of AD mice via regulating SIRT1 signaling pathway.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.005

*國家自然科學(xué)基金資助項目81471306，U1404313；河南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊支持計劃15IRTSTHN022；河南省科技創(chuàng)新人才計劃 154200510008;河南省高等學(xué)校重點科研項目計劃17A310012；高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金資助課題20114101110004

，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)， E-mail:guanfangxia@126.com

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