ErbB3/Her3基因重組慢病毒的構(gòu)建及應(yīng)用*

生秀梅， 王正新

1)江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室 鎮(zhèn)江 212013　2)克拉克亞特蘭大大學(xué)生物科學(xué)系腫瘤研究與治療發(fā)展中心 亞特蘭大 喬治亞州 30314

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ErbB3/Her3基因重組慢病毒的構(gòu)建及應(yīng)用*

生秀梅1,2)△， 王正新2)

1)江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室 鎮(zhèn)江 2120132)克拉克亞特蘭大大學(xué)生物科學(xué)系腫瘤研究與治療發(fā)展中心 亞特蘭大 喬治亞州 30314

慢病毒；Her3；p44

目的：構(gòu)建慢病毒Lenti-Her3，探索ErbB3/Her3在p44通路中的作用。方法：將ErbB3/Her3基因的兩個(gè)片段Her3-1和Her3-2分段克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，構(gòu)建慢病毒載體pCDH-Her3，然后將其包裝成慢病毒Lenti-Her3；用Lenti-Her3感染經(jīng)p44-shRNA沉默的A549細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，Western blot法檢測(cè) P44、Her3蛋白的表達(dá)。結(jié)果：轉(zhuǎn)染p44-shRNA的A549細(xì)胞P44蛋白不表達(dá)，Her3蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著降低；Lenti-Her3感染后，p44沉默的A549細(xì)胞Her3蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，細(xì)胞計(jì)數(shù)有所升高(P<0.05)，但未達(dá)到正常水平。結(jié)論：成功構(gòu)建了重組慢病毒Lenti-Her3；p44可部分通過(guò)Her3促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，可能成為肺癌藥物研究的新靶點(diǎn)。

ErbB3/Her3是ErbB酪氨酸激酶受體家族的一員。該家族包括EGFR(ErbB1/Her1)、ErbB2(Her2/neu)、ErbB3(Her3)和ErbB4(Her4)[1-2]。ErbB家族在控制細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程中發(fā)揮非常重要的功能[3-4]。這些受體的過(guò)表達(dá)或突變與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、患者預(yù)后不良有關(guān)[3]。ErbB3/Her3參與肺癌A549細(xì)胞的分裂、存活、轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程，其高表達(dá)與肺癌患者的預(yù)后不良密切相關(guān)[5-9]。p44/WDR77 對(duì)肺癌上皮細(xì)胞及肺部腫瘤的發(fā)生至關(guān)重要[10]。沉默p44的表達(dá)后，體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞及裸鼠移植瘤均不再生長(zhǎng)[10-11]。利用DNA芯片表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)通過(guò)shRNA沉默A549細(xì)胞中p44的表達(dá)后，ErbB3/Her3的表達(dá)顯著下調(diào)。據(jù)此，該研究擬構(gòu)建ErbB3/Her3慢病毒，用其感染經(jīng)p44-shRNA沉默的A549細(xì)胞，觀察A549細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，探索ErbB3/Her3在p44通路中的作用。

1　材料與方法

1.1材料pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒載體及病毒包裝系統(tǒng)購(gòu)自SBI公司； A549細(xì)胞、293T細(xì)胞、pRL-CMV及E.coliXL 10-gold感受態(tài)細(xì)胞由本室保存；NT-shRNA、p44-shRNA慢病毒均由本室構(gòu)建；Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司；人ErbB3/Her3基因cDNA克隆(HSCD00038359)購(gòu)自DNASU。

1.2沉默p44 后A549細(xì)胞中ErbB3/Her3 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)應(yīng)用Real-time PCR法檢測(cè)。采用Trizol法一步提取經(jīng)NT-shRNA(陰性對(duì)照)或p44-shRNA慢病毒感染6 d后的A549細(xì)胞的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄 (試劑盒為SuperArray Bioscience Corp產(chǎn)品)得cDNA，以cDNA為模板，擴(kuò)增Her3 mRNA，以人β-actin作為內(nèi)參。Her3上游引物序列:5’-GGTGCTGGGCTTGCTTTT-3’，下游引物序列:5’-CGTGGCTGGAGTTGGTGTTA-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為365 bp。用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3慢病毒Lenti-Her3的構(gòu)建

1.3.1重組慢病毒載體pCDH-Her3的構(gòu)建GenBank注冊(cè)的ErbB3/Her3序列(NM_001982)顯示ErbB3/Her3基因全長(zhǎng)為4 029 bp，酶切位點(diǎn)分析顯示ErbB3/Her3基因在2 100 bp附近有一個(gè)BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)，故考慮分段克隆。首先將BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)上游區(qū)段克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，構(gòu)建pCDH-Her3-1，再將BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)下游區(qū)段克隆至pCDH-Her3-1，構(gòu)建完整的pCDH-Her3。BamH Ⅰ上游區(qū)段上、下游引物(Her3-1-F和Her3-1-R)序列分別為：5’-GCTCTAGAAT GAGGGCGAACGACGC TC-3’和5’-GCCGTC CACTCTTGTCCTC-3’(上游引物5’端加接X(jué)baⅠ酶切位點(diǎn)序列，擴(kuò)增產(chǎn)物中包含BamH Ⅰ酶切位點(diǎn))；下游區(qū)段上、下游引物(Her3-2-F和Her3-2-R)序列分別為：5’-GGGTGTCTTTGGAACTGTG-3’和5’-ATA AGAATGCGGCCGCCGTTCTCTGGGCATTAGCC-3’(下游引物5’端加接NotⅠ酶切位點(diǎn)序列，擴(kuò)增產(chǎn)物中包含BamH Ⅰ酶切位點(diǎn))。以含有ErbB3/Her3基因cDNA克隆質(zhì)粒為模板，分別以Her3-1-F/R和Her3-2-F/R為引物進(jìn)行PCR，獲取目的基因Her3-1和Her3-2。Her3-1 PCR產(chǎn)物膠回收；pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro用FLAG標(biāo)記，然后經(jīng)XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切；將上述兩產(chǎn)物用T4 DNA連接酶室溫連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliXL 10-gold；提取陽(yáng)性克隆(克隆1)質(zhì)粒，雙酶切驗(yàn)證。Her3-2 PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后用NotⅠ和BamHⅠ雙酶切，與克隆1經(jīng)T4 DNA連接酶室溫連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliXL 10-gold，提取陽(yáng)性克隆(克隆2)，經(jīng)雙酶切驗(yàn)證后，通過(guò)DNA測(cè)序分析最終確認(rèn)。

1.3.2pCDH-Her3的篩選PC3細(xì)胞接種于24孔板中，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞密度為50%～80%時(shí)，更換為無(wú)血清無(wú)抗生素培養(yǎng)基，取100 ng pCDH-Her3或100 ng pCDH空載體與5 ng pRL-CMV經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，6 h后，換新鮮含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，48 h后收集PC3細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)Her3蛋白的表達(dá)，選擇Her3表達(dá)較高的pCDH-Her3用于慢病毒的包裝。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。4組各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1沉默p44后A549細(xì)胞ErbB3/Her3 mRNA的表達(dá)情況沉默A549細(xì)胞中p44的表達(dá)后，ErbB3/Her3 mRNA的表達(dá)下調(diào)48倍。

2.2重組慢病毒Lenti-Her3的鑒定

2.2.1慢病毒載體pCDH-Her3的鑒定pCDH-Her3經(jīng)XbaⅠ和NotⅠ雙酶切后電泳可見(jiàn)4 000 bp左右片段，DNA測(cè)序亦完全正確，見(jiàn)圖1。

A1： Her3-2 PCR產(chǎn)物；A2：Her3-1 PCR產(chǎn)物；B1：pCDH-Her3酶切鑒定結(jié)果；M：1 kb plus DNA Ladder。圖1　慢病毒載體pCDH-Her3的酶切鑒定

2.2.2慢病毒載體的篩選將pCDH-Her3與pRL-CMV經(jīng)Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞后， Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2)，對(duì)照空載體pCDH轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞檢測(cè)不到Her3蛋白的表達(dá)，經(jīng)pCDH-Her3轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞均檢測(cè)到Her3蛋白的表達(dá)，最終選擇Her3蛋白表達(dá)較高的2號(hào)泳道對(duì)應(yīng)的pCDH-Her3用于慢病毒的包裝，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1: pCDH轉(zhuǎn)染的PC3； 2、3：pCDH-Her3轉(zhuǎn)染的PC3。圖2　Western blot法檢測(cè)pCDH-Her3轉(zhuǎn)染后PC3細(xì)胞中Her3蛋白的表達(dá)

2.2.3A549細(xì)胞感染慢病毒Lenti-Her3后Her3蛋白的表達(dá)使用不同濃度的慢病毒Lenti-Her3感染A549細(xì)胞后，Western blot法檢測(cè)Her3的表達(dá)，結(jié)果(圖3)顯示，A549細(xì)胞感染Lenti-Her3后可大量表達(dá)Her3蛋白。

1： 空病毒對(duì)照組；2～5：30、50、100和200 μL Lenti-Her3組。圖3　Western blot法檢測(cè)Lenti-Her3感染后A549細(xì)胞中Her3蛋白的表達(dá)

2.3Lenti-Her3慢病毒感染后p44沉默的A549細(xì)胞中P44、Her3蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖4、表1。P44沉默的A549細(xì)胞中Her3蛋白高表達(dá)，且與加入的Lenti-Her3病毒量呈正相關(guān)。

1:NT-shRNA組;2:p44-shRNA組;3：p44-shRNA+50 μL Lenti-Her3組;4：p44-shRNA+100 μL Lenti-Her3組。圖4　p44沉默的A549細(xì)胞Her3蛋白的表達(dá)

2.4Lenti-Her3慢病毒感染后p44沉默的A549細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況見(jiàn)表1。p44-shRNA轉(zhuǎn)染6 d后，A549細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯下降；再感染Lenti-Her3后，細(xì)胞計(jì)數(shù)有所上升，但并未恢復(fù)到NT-shRNA組水平。

表1　病毒感染后4組A549細(xì)胞P44、Her3蛋白表達(dá)和細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較

*:與NT-shRNA組相比，P<0.001;#:與p44-shRNA組相比,P<0.05;△：與p44-shRNA+50 μL Lenti-Her3組比較，P<0.05。

3　討論

p44/WDR77 是一種原癌基因，可促進(jìn)肺癌上皮細(xì)胞生長(zhǎng)及肺部腫瘤的發(fā)生。沉默p44的表達(dá)后，A549細(xì)胞中ErbB3/Her3的表達(dá)顯著下調(diào)[10]；該研究也再次驗(yàn)證了這一結(jié)果。為進(jìn)一步探討Her3是否介導(dǎo)p44的促A549細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，作者構(gòu)建了重組慢病毒Lenti-Her3，用其感染沉默p44表達(dá)后的A549細(xì)胞，用以增強(qiáng)其Her3蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示Her3可部分恢復(fù)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，說(shuō)明p44可部分通過(guò)Her3促進(jìn)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

ErbB3/Her3基因位于12號(hào)染色體上，編碼160 000的跨膜蛋白受體，與EGFR(ErbB1/Her1)、ErbB2(Her2/neu)和ErbB4(Her4)同屬于酪氨酸激酶受體家族[1,12]。該家族成員的蛋白結(jié)構(gòu)中包含3個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)：胞外區(qū)域、跨膜區(qū)域和胞內(nèi)區(qū)域，其中胞外區(qū)域是配體結(jié)合區(qū)，而胞內(nèi)部分具有酪氨酸蛋白激酶活性[4,13]。配體和ErbB同源或異源二聚體結(jié)合后，激活其酪氨酸激酶活性，使其胞內(nèi)區(qū)域酪氨酸殘基自磷酸化，從而激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[14-15]。ErbB3/Her3沒(méi)有激酶活性， ErbB2/Her2沒(méi)有配體結(jié)合功能，兩者通常都與其他家族成員形成異源二聚體發(fā)揮功能[9,16-17]。另有研究[14]表明ErbB3/Her3和ErbB2/Her2形成二聚體通過(guò)激活PI3K/Akt通路從而調(diào)節(jié)肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可考慮在沉默p44表達(dá)的A549細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)ErbB3/Her3和ErbB2/Her2，觀察A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，為研究 p44通路奠定基礎(chǔ)。

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(2015-11-26收稿責(zé)任編輯王曼)

Construction and application of recombinant ErbB3/Her3 lentiviral

SHENGXiumei1,2)，WANGZhengxin2)

1)DepartmentofBiochemistry,SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang2120132)TheCenterforCancerResearchandTherapeuticDevelopment,DepartmentofBiologicalSciences,ClarkAtlantaUniversity,Atlanta,GA30314

lentiviral;Her3;p44

Aim: To construct lentiviral Lenti-Her3 and identify ErbB3/Her3 function in p44 pathway. Methods: Her3-1 and Her3-2 fragments of ErbB3/Her3 gene were cloned in turn into pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro to generate pCDH-Her3，and then was packaged to obtain Lenti-Her3. Lenti-Her3 was infected in A549 cells which had been transfected with p44-shRNA, and then expressions of P44 and Her3 proteins were detected by Western blot, cell growth was detected through cell counting. Results: The A549 cells transfected with p44-shRNA had no expression of P44 protein, low expression of Her3 protein, and low cell number counting. The expression of Her3 protein in the A549 cells transfected with p44-shRNA and infected with Lenti-Her3 was improved, and cell number counting was increased, but did not reach the normal level. Conclusion: The lentiviral Lenti-Her3 has been successfully constructed;p44 could promote lung cancer cell growth partially by Her3 pathway, which may be a potential therapeutic target for lung cancer.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.004

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目31000046；江蘇大學(xué)高級(jí)人才啟動(dòng)基金11JD063；國(guó)家博士后基金面上項(xiàng)目2015M571702

△女，1978年1月生，博士，副教授，研究方向：腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及細(xì)菌致病機(jī)制，E-mail:shengxiumei@ujs.edu.cn

R734.2