阿托伐他汀對哮喘大鼠氣道炎癥及氣道重構(gòu)的影響

潘文森　于金香　顧瑩　楊紅申

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·論著·

阿托伐他汀對哮喘大鼠氣道炎癥及氣道重構(gòu)的影響

潘文森于金香顧瑩楊紅申

目的探討阿托伐他汀對卵清白蛋白致敏哮喘模型大鼠氣道炎癥和重構(gòu)的影響。方法清潔級SD雄性大鼠24只按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、哮喘組和阿托伐他汀組，每組8只。對照組大鼠采用0.9%氯化鈉溶液(生理鹽水)進(jìn)行致敏和激發(fā)，哮喘組大鼠采用卵清白蛋白致敏和激發(fā)，阿托伐他汀組在致敏和激發(fā)前以阿托伐他汀口服。采用肺功能檢測3組大鼠氣道呼氣阻力；采用圖像分析軟件測定肺組織切片中的支氣管壁內(nèi)周長、支氣管管壁面積、支氣管平滑肌面積；膠原表達(dá)通過氣道壁Masson染色進(jìn)行觀察；實(shí)驗(yàn)動物血清中白介素-13(IL-13)及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的水平以ELISA法測定。結(jié)果肺功能檢測顯示哮喘組平均呼氣阻力顯著升高，阿托伐他汀組低于哮喘模型組(P<0.05)；病理檢查顯示哮喘組氣道炎癥明顯，對照組和阿托伐他汀組與之相比炎癥輕微；阿托伐他汀組大鼠氣道管壁面積、平滑肌面積圖像分析和哮喘組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；阿托伐他汀組肺組織中膠原沉積表達(dá)較哮喘組減少(P<0.05)；阿托伐他汀組大鼠血清中IL-13和TGF-β1較哮喘組降低(P<0.05)。結(jié)論阿托伐他汀能夠明顯減輕哮喘大鼠氣道炎癥，降低哮喘大鼠的氣道基本阻力；減少肺組織中膠原沉積，降低氣道管壁面積、平滑肌層面積，減輕哮喘氣道重構(gòu)。阿托伐他汀治療能夠降低血清中TGF-β1和IL-13水平，或?yàn)槠錅p輕炎癥和氣道重構(gòu)的機(jī)制。

哮喘；炎癥；氣道重構(gòu)；阿托伐他?。话捉樗?13；轉(zhuǎn)化生長因子-β1

支氣管哮喘是一種以反復(fù)發(fā)作的喘息、咳嗽、呼吸困難為特征的疾病[1,2]。哮喘的病生理學(xué)基礎(chǔ)為氣道炎癥引起的高反應(yīng)性，隨著病情進(jìn)展可出現(xiàn)內(nèi)膜、肌層增厚等氣道重構(gòu)改變，造成疾病難以控制。哮喘患者存在Th1/Th2失衡，白介素-13(IL-13)是重要的Th2細(xì)胞因子，通過多種途徑促進(jìn)氣道炎癥和重構(gòu)，其中IL-13能刺激轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)在體內(nèi)的合成。人體存在多種促纖維化細(xì)胞因子，TGF-β1是其中之一，既往研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1影響氣道重構(gòu)[3-5]。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)，參與調(diào)控炎性細(xì)胞的趨化和活化，在哮喘患者還影響氣道平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞的增殖和活化。有研究表明，應(yīng)用PPARγ激動劑能夠同時抑制氣道炎癥和氣道重構(gòu)過程[6]。阿托伐他汀除了調(diào)節(jié)脂代謝以外，還存在一定的抗炎作用，有針對人外周血單核細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀增加PPARγ的表達(dá)，推測可能與抗炎作用有關(guān)[7]。因此推測阿托伐他汀能夠抑制氣道炎癥和氣道重構(gòu)過程。本實(shí)驗(yàn)通過成功復(fù)制哮喘大鼠模型，并應(yīng)用阿托伐他汀進(jìn)行干預(yù)，通過觀察氣道阻力、氣道炎癥病理改變、氣道重構(gòu)指標(biāo)、肺組織中膠原沉積及血清中IL-13與TGF-β1的變化。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物及分組：健康雄性SD大鼠24只，體重180～220 g，購于河北醫(yī)科大學(xué)動物中心(實(shí)驗(yàn)動物許可證號：1505010)。按隨機(jī)數(shù)字表法分為健康對照組、哮喘模型組和阿托伐他汀干預(yù)組，每組8只。

1.1.2主要試劑：雞卵清白蛋白(OVA)購自美國Sigma公司；阿托伐他汀(Liptor，立普妥，美國輝瑞制藥公司)購自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院；IL-13及 TGF-β1 ELISA試劑盒購自美國R&D公司。

1.2方法

1.2.1模型制作：哮喘組、干預(yù)組大鼠于第1天、第7天腹腔注射含OVA 100 mg和氫氧化鋁100 mg的混懸液2 ml和百日咳疫苗1 ml進(jìn)行致敏。于第15天開始將大鼠置于熏箱中霧化吸入OVA進(jìn)行激發(fā)，隔日1次，30 min/次，每激發(fā)4次后增加1次OVA濃度(其濃度由1%、1.5%、2%、2.5%、3%逐漸遞增)，共激發(fā)20次。阿托伐他汀干預(yù)組，造模同時開始服用阿托伐他汀4 mg·kg-1·d-1，直至整個實(shí)驗(yàn)結(jié)束外，余與哮喘模型組相同。正常對照組的試驗(yàn)流程與上2組相同，但使用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行致敏與激發(fā)。

1.2.2動物肺功能檢測：最后1次激發(fā)后，用1%戊巴比妥鈉(100 mg/kg)腹腔注射麻醉。行頸靜脈穿刺留置導(dǎo)管，切開氣管行氣管插管。連接動物呼吸機(jī)進(jìn)行通氣，待呼吸機(jī)基線平穩(wěn)后檢測動物肺功能，通過軟件計算氣道阻力。

1.2.3血清采集及TGF-β1與IL-13的ELISA檢測：待2組大鼠在檢測完肺功能后將動物處死，打開胸腔右心室穿刺采血，離心(3 000 r/min)10 min，收集血清，凍存于-70℃冰箱待測TGF-β1與IL-13。應(yīng)用大鼠TGF-β1與IL-13的ELISA檢測試劑盒檢測其血清水平，步驟按試劑說明書進(jìn)行。

1.2.4肺組織標(biāo)本制作：右肺上葉置于4%的甲醛中浸泡24 h，然后將固定好的組織經(jīng)酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟后冷卻行石蠟包埋。切片機(jī)連續(xù)石蠟切片(厚約5 μm)，干燥、二甲苯脫蠟，部分切片常規(guī)蘇木精及伊紅(HE)染色。光鏡下觀察支氣管-肺組織病理學(xué)變化。

1.2.5Masson染色：肺組織切片脫蠟，麗春紅染色2 min，0.2%冰醋酸2 min，5%磷鉬酸水溶液2 min，再以0.2%冰醋酸洗2 min，甲基綠染色3 min，自來水沖洗。酒精分色、梯度酒精脫水、透明及封片。染色后的肺組織切片鏡下觀察病變程度。

1.2.6肺組織切片圖像分析：采用麥克迪病理圖像分析軟件測量分析(廈門麥克迪儀器儀表有限公司)。每張肺組織切片(光鏡，×100倍)找到完整的支氣管橫切面，圖像采集系統(tǒng)獲取圖像。測量支氣管壁內(nèi)周長(Pi)、支氣管管壁面積(WAt)和支氣管平滑肌面積(WAm)，以WAt/ Pi和WAm/ Pi進(jìn)行比較。

2　結(jié)果

2.1氣道阻力檢測哮喘模型組和阿托伐他汀組大鼠氣道基本阻力均高于正常對照組(P<0.05)。阿托伐他汀組低于哮喘模型組(P<0.05)。見表1。

表1各組實(shí)驗(yàn)動物氣道阻力比較

項(xiàng)目對照組哮喘模型組阿托伐他汀組F值P值氣道阻力1.090±0.1521.793±0.164*1.441±0.240*#27.5260.001*#

注：與對照組比較，*P<0.05；與哮喘模型組比較，#P<0.05

2.2病理學(xué)改變對照組大鼠支氣管黏膜上皮、肌層、肺組織結(jié)構(gòu)完整，支氣管管腔規(guī)則，無明顯炎性細(xì)胞浸潤。哮喘模型組及阿托伐他汀組大鼠氣道黏膜光鏡下可見破壞，杯狀細(xì)胞表達(dá)增加，黏液分泌增加，可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤，基底膜增厚，平滑肌細(xì)胞增殖，阿托伐他汀組較哮喘模型組上述改變明顯減輕。見圖1。

2.33組WAt/Pi、WAm/pi、膠原沉積比較哮喘模型組和阿托伐他汀組WAt/Pi、WAm/pi、膠原沉積均高于對照組，阿托伐他汀組低于哮喘模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖2。

圖1　大鼠肺組織(HE×100)

圖2　大鼠肺組織(Masson×100)

組別WAt/Pi(μm)WAm/pi(μm)膠原沉積(面密度比值)對照組6.50±0.823.01±0.510.019±0.002哮喘模型組12.48±1.04*5.50±0.92*0.044±0.010*阿托伐他汀組8.81±0.55*#4.40±0.61*#0.032±0.006*# F值106.50325.28227.074 P值0.0010.0010.001

注：與對照組比較，*P<0.05；與哮喘模型組比較，#P<0.05

2.4血清中IL-13、TGF-β1大鼠血清中IL-13、TGF-β1哮喘模型組及阿托伐他汀組均高于正常對照組(P<0.05)；阿托伐他汀組低于哮喘模型組(P<0.05)。見表3。

表33組實(shí)驗(yàn)動物血清IL-13及TGF-β1的方差分析

組別IL-13TGF-β1對照組30.91±6.5939.95±5.58哮喘模型組49.02±6.31*70.99±12.81*阿托伐他汀組40.45±8.09*#51.64±8.06*# F值13.24322.683 P值0.0010.001

注：與對照組比較，*P<0.05；與哮喘模型組比較，#P<0.05

3　討論

氣道炎癥和氣道重構(gòu)是支氣管哮喘的基本特征，哮喘發(fā)病時氣道炎癥造成管壁充血、水腫及增厚，平滑肌增生、肥大和基底膜增厚，這些改變造成氣道內(nèi)徑減小、阻力大幅度增加，臨床上出現(xiàn)咳嗽、喘息及呼吸困難等癥征[1,2]。

本研究中，卵蛋白反復(fù)激發(fā)致敏的大鼠，氣道黏膜破壞，杯狀細(xì)胞表達(dá)增加，黏液分泌增加，可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤，呈現(xiàn)明顯的炎癥改變。同時可見基底膜增厚，平滑肌細(xì)胞增殖，上述造成所見氣道內(nèi)腔縮窄甚至閉鎖。通過病理分析軟件，可見哮喘大鼠氣道管壁面積、平滑肌面積及肺組織膠原沉積均有顯著增加。針對實(shí)驗(yàn)動物的肺功能檢查，也提示氣道阻力較對照組顯著增加。

以往研究表明，失控的炎癥是造成氣道重構(gòu)的主要原因。許多細(xì)胞因子、生長因子均可能參與了哮喘氣道重構(gòu)的病理生理機(jī)制。其中，IL-13和TGF-β1在哮喘氣道炎癥和重構(gòu)的研究中尤為重要。哮喘患者存在Th1/Th2 失衡，表現(xiàn)為Th1 細(xì)胞因子IL-12、IFN2-γ等減少，而TH2細(xì)胞因子IL-4、IL-13明顯增高[3]。TGF-β1是體內(nèi)重要的促纖維化細(xì)胞因子，可能通過上皮細(xì)胞損傷、黏液腺與杯狀細(xì)胞增生、上皮下纖維化、氣道平滑肌細(xì)胞增生以及微環(huán)境重構(gòu)等多個環(huán)節(jié)與途徑影響氣道重構(gòu)[4]。因此，推測IL-13或許通過刺激TGF-β1表達(dá)參與氣道重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展[5]。本研究中，大鼠血清中IL-13及TGF-β1含量在哮喘模型組較正常對照組顯著升高，病理學(xué)可見氣道炎癥、支氣管管壁面積、氣道平滑肌面積及肺組織膠原沉積也顯示相同趨勢，進(jìn)一步驗(yàn)證了二者或在氣道炎癥乃至重構(gòu)中起重要作用。

支氣管哮喘時PPARs(尤其是PPARγ)參與調(diào)控炎性細(xì)胞的趨化和活化，影響氣道平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞的增殖和活化，可能參與了哮喘發(fā)病的過程。應(yīng)用PPARγ激動劑能夠同時抑制氣道炎癥和氣道重構(gòu)，可作為哮喘治療的新靶點(diǎn)，有望成為一類新型的抗哮喘藥物[6]。有研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物能增加人外周血單核細(xì)胞上PPARγ的表達(dá)，提示其抗炎作用可能與激活PPARγ的表達(dá)有關(guān)[7]。因此，推測阿托伐他汀能夠抑制氣道炎癥和氣道重構(gòu)過程。近年來，關(guān)于他汀類藥物對于哮喘的研究逐漸增多，認(rèn)為可他汀類藥物通過多種途徑產(chǎn)生抗炎作用[8,9]。

成人肥胖型哮喘是一種特殊類型的哮喘，常常治療效果不佳，Linderholm等認(rèn)為在常規(guī)藥物治療的同時，加用二甲雙弧和(或)他汀類藥物可以改善氣道炎癥，從而改善療效[13]。流行病學(xué)資料顯示，肥胖和哮喘發(fā)病之間存在聯(lián)系，同時針對其他代謝綜合征的研究也發(fā)現(xiàn)了與哮喘之間的復(fù)雜關(guān)系，因此作為代謝綜合征常用的他汀類藥物，其對于哮喘的影響值得重視[14]。雖然他汀類對于哮喘的影響機(jī)制尚未完全明了，Huang等[15]的研究中3 965例服用他汀類藥物的哮喘患者與7 843例病情相當(dāng)?shù)幕颊哌M(jìn)行對照，發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可以有效減少哮喘急性發(fā)作引起的住院需求。

本研究中，阿托伐他汀干預(yù)組大鼠肺功能氣道阻力較哮喘模型組顯著降低，病理學(xué)分析可見氣道炎癥顯著改善，對支氣管管壁面積、氣道平滑肌面積及肺組織膠原沉積的圖像分析也顯示相同的減低趨勢，提示阿托伐他汀干預(yù)改善了卵蛋白反復(fù)激發(fā)致敏大鼠的氣道炎癥及重構(gòu)過程。檢測大鼠血清IL-13及TGF-β1水平較哮喘模型組明顯降低，進(jìn)而可以推測阿托伐他汀或許通過上調(diào)PPARγ的表達(dá)，進(jìn)而影響IL-13及TGF-β1的代謝，并最終改善了氣道炎癥和重構(gòu)。

總之，阿托伐他汀可能通過上調(diào)IL-13及TGF-β1的表達(dá)，從而產(chǎn)生了對于哮喘氣道炎癥和重構(gòu)的調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制有待更深入的研究揭示。

1中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組，中華兒科雜志編輯委員會.兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版).中華兒科雜志,2016,54：167-181.

2中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組.中華醫(yī)學(xué)會全科醫(yī)學(xué)分會.中國支氣管哮喘防治指南(基層版)中華結(jié)核和呼吸雜志,2013,36：331-336.

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5Ma Y,Halayko AJ,Basu S,et al. Sustained suppression of il-13 by a vaccine attenuated airway inflammation and remodeling in mice. Am J Respir Cell Mol Biol,2013,48:540-549.

6Li W,Dai W,Sun J,et al. Association ofperoxisome proliferator-activated receptor-gammagene polymorphisms and gene-gene interaction withasthmarisk in a Chinese adults population. Int J Clin Exp Med,2015,15:19346-19352.

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Effects of atorvastatin on airway inflammation and airway remodeling in rats with asthma

PANWensen,YUJinxiang,GUYing,etal.

TheSecondDepartmentofRespiratorydiseases,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

ObjectiveTo observe the effects of atorvastatin on airway inflammation and airway remodeling in rats with asthma caused by ovalbumin.MethodsTwenty-four male SD rats were randomly divided into three groups:control group, asthma model group and atorvastatin group,with 8 rats in each group. The rats in control group were given 0.9% sodium chloride solution, the rats in asthma model group were sensitized and stimulated by ovalbumin, however,the rats in atorvastatin group were given orally atorvastatin before sensitization. The airway expiratory resistance was detected by pulmonary function test for the three groups,and the inner circumference and area of bronchus wall,the area of tracheal smooth muscle were measured by image analysis software. The airway collagen deposition was detected by Masson stainingand,and the serum levels of interleukin-13 (IL-13) and transforming growth factorβ1 (TGF-β1) were measured by ELISA.ResultsThe average expiratory resistance in asthma model group was significantly higher than that in control group and atorvastatin group (P<0.05).The pathological examination showed that the airway inflammation in asthma model group was more obvious than that in control group and atorvastatin group.There were significant differences in the area of bronchus wall and the area of tracheal smooth muscle between atorvastatin group and asthma model group (P<0.05).The collagen deposition in pulmonary tissues in atorvastatin group was significantly decreased,as compared with that in asthma model group (P<0.05). The expression levels of IL-13 and TGF-β1in atorvastatin group were significantly decreased,as compared with those in asthma model group (P<0.05).ConclusionAtorvastatin can obviously relieve the airway inflammation and decrease airway basic resistance in rats with asthma,moreover,which can lessen the collagen deposition in lung tissues and decrease the area of bronchus wall and area of tracheal smooth muscle to alleviate airway remodeling.Moreover atorvastatin can decrease the expression levels of IL-13 and TGF-β1, which may be the action mechanism in alleviating inflammation and airway remodeling.

asthma；inflammation; airway remodeling; atorvastatin; interleukin-13; transforming growth factor β1

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.18.001

050000石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸二科

R 562.25

A

1002-7386(2016)18-2725-04

2016-02-16)

項(xiàng)目來源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(編號：20100068)