sEHi對頸動(dòng)脈狹窄患者晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響

彭曉琴，丁　立，周　嵐，艾志兵，陳　俊，王云甫，何國厚

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sEHi對頸動(dòng)脈狹窄患者晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響

彭曉琴，丁立，周嵐，艾志兵，陳俊，王云甫，何國厚

目的研究不同濃度可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑(soluble epoxide hydrolase inhibitor，sEHi)AUDA對頸動(dòng)脈狹窄(carotid stenosis，CS)患者外周血來源的晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞(late endothelial progenitor cell，late EPC)的影響。方法入選研究對象60例，分成頸動(dòng)脈狹窄組(n=35)和對照組(n=25)。密度梯度離心法，從外周血獲取單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)至21 d后鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞；以不同濃度AUDA(0，0.1，1，10 μmol/L)和晚期EPC共培養(yǎng)24 h，分別采用MTT法，黏附能力測定實(shí)驗(yàn)和Transwell小室來觀察其增殖，黏附，遷移能力。同時(shí)采用Western blot法觀察AUDA處理后其VEGF的表達(dá)。結(jié)果體外培養(yǎng)21 d時(shí)，細(xì)胞呈典型長梭形，21 d時(shí)，呈鋪路石樣，并可攝取FITC-UEA-I和Dil-acLDL。與對照組相比，CS患者late EPC的增殖，黏附和遷移能力均顯著下降(P<0.05)；與處理前(0 umol/L)相比，AUDA呈劑量依賴性地增強(qiáng)CS患者late EPC增殖，黏附和遷移能力并促進(jìn)CS患者late EPC表達(dá)VEGF。結(jié)論sEHi具有促進(jìn)late EPC增殖，黏附和遷移等功能的作用，其有望成為一類治療CS的新型藥物。

可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑；頸動(dòng)脈狹窄；晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長因子

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell，EPC)是一類能增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在生理或病理因素刺激下可以從骨髓動(dòng)員到外周血，參與受損血管內(nèi)皮的修復(fù)和新生血管的形成。隨后根據(jù)細(xì)胞不同集落形態(tài)、出現(xiàn)時(shí)間的先后及細(xì)胞增殖潛能，將這兩種外周血EPC分為早期EPC和晚期EPC。晚期EPC表現(xiàn)出更強(qiáng)大的增殖潛力和血管形成能力，可能是真正的EPC[1，2]。近年來的研究顯示，EPC與頸動(dòng)脈狹窄(carotid stenosis，CS)關(guān)系密切，但大多數(shù)研究局限在早期EPC上，對晚期EPC的報(bào)道較少。

可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑(soluble epoxide hydrolase inhibitor，sEHi)是備受關(guān)注的具有多重心腦血管作用的一類藥物，其作用于可溶性環(huán)氧化物水解酶(sEH)，阻止sEH將具有強(qiáng)大生物活性的環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EET)降解為低活性的代謝產(chǎn)物。已證實(shí)sEHi具有顯著擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)炎癥、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移和促進(jìn)新生血管生成等多種作用，因而被預(yù)測為一類新的抗動(dòng)脈粥樣硬化物[3，4]。然而，目前sEH抑制劑抗組織缺血的機(jī)制尚未闡明。其中，AUDA[12-(3-adamantan-1-y1-ureido)-dodecanoic acid]是新合成的sEHi，本研究以頸動(dòng)脈狹窄患者為研究對象，探討不同濃度AUDA對晚期EPC增殖，黏附，遷移活性的影響，并研究AUDA作用后晚期EPC的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)的變化。

1　材料與方法

1.1研究對象選擇2011～2012年間在神經(jīng)內(nèi)科住院患者60例，分成頸動(dòng)脈狹窄組(35例，經(jīng)全腦血管造影術(shù)確診有頸動(dòng)脈狹窄)和對照組(25例，經(jīng)全腦血管造影術(shù)排除頸動(dòng)脈狹窄)。兩組研究對象年齡，性別相匹配。有下列病史者予以排除：急性或慢性肝腎疾病、冠狀動(dòng)脈綜合征、各種感染性疾病、心臟瓣膜病、惡性腫瘤、外周血管病、自身免疫性疾病、糖尿病、重大手術(shù)或嚴(yán)重外傷、嚴(yán)重感染。

1.2試劑與儀器EGM-2培養(yǎng)基購自Lonza公司；二苯基四氮唑溴鹽(MTT)，F(xiàn)ITC-UEA-I，AUDA購自Sigma公司；人纖維連接蛋白購自Millipore公司；Dil-acLDL購自Molecular Probe公司；FITC-CD34，PE-CD133均購自eBioscience公司；VEGF抗體，GAPDH抗體購自Abcam公司；Traswell小室購自Corning公司；人淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)蠊?；倒置相差顯微鏡購自O(shè)lympus公司；激光掃描共聚焦熒光顯微鏡購自Germa公司；流式細(xì)胞儀購自BD biosciences公司。

1.3晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞分離，培養(yǎng)和鑒定所有入組對象行全腦血管造影術(shù)，術(shù)中嚴(yán)格無菌條件下經(jīng)鞘管從股動(dòng)脈抽取動(dòng)脈血30 ml，肝素抗凝，經(jīng)密度梯度離心法獲得單個(gè)核細(xì)胞。將單個(gè)核細(xì)胞懸液接種到人纖維連接蛋白包被的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入EGM-2培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃，5% CO2)，4 d后更換培養(yǎng)液，此后隔天更換1次，培養(yǎng)至21 d，搜集貼壁細(xì)胞，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，加FITC-UEA-I和Dil-acLDL于激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行鑒定，F(xiàn)ITC-UEA-I和Dil-acLDL雙染色陽性細(xì)胞定義為EPC。用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表型CD34，CD133的表達(dá)。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)放大200倍視野，取平均值。

1.4細(xì)胞的藥物處理取培養(yǎng)至21 d的晚期EPC，采用無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化后再分別與0、0.1、1、10 μmol/L的AUDA干預(yù)24 h，取無頸動(dòng)脈狹窄患者的晚期EPC作為對照組，對照組不加藥物干預(yù)。

1.5增殖能力檢測用0.25%胰蛋白酶消化不同處理組的貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將等量的晚期EPC接種到人纖維連接蛋白包被的96孔培養(yǎng)板中，每組做4 個(gè)復(fù)孔，每孔加入20 μl MTT 試劑(5 g/L)避光培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，再加入二甲基亞砜150 μl/孔，置微量振蕩器上充分振蕩10 min；于酶標(biāo)儀測定波長490 nm處吸光度值(OD值)。

1.6黏附能力檢測如上搜集貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將等量的晚期EPC接種在包被有纖連蛋白的培養(yǎng)板，置5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，用緩沖液輕輕洗去未貼壁細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，分別用蘇木素，伊紅染色細(xì)胞，在 200倍視野下計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞數(shù)。

1.7遷移能力檢測如上搜集貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將等量的晚期EPC 注入Transwell小室的上層，下層加入含AUDA(0、0.1、1、10 μmol/L)的培養(yǎng)液，在37 ℃，5% CO2溫箱孵育24 h，棉簽刷刮去濾膜上面未移動(dòng)細(xì)胞，用甲醇固定3～5 min，分別用蘇木素，伊紅侵染，用蒸餾水沖洗，干后鏡檢，隨機(jī)選擇5個(gè)顯微鏡視野(×200)計(jì)數(shù)遷移到下層的細(xì)胞數(shù)。

1.8免疫印跡法檢測VEGF的表達(dá)細(xì)胞收集后，以細(xì)胞裂解液處理，提取細(xì)胞總蛋白，以考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。蛋白變性后，10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳之后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，以特異性一抗孵育，4 ℃過夜，洗膜后二抗室溫孵育1 h，用ECL顯色液處理后放入X-光片夾中曝光。將膠片進(jìn)行掃描存檔，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。以GAPDH作為蛋白質(zhì)等量的對照。

2　結(jié)　果

2.1研究對象基線資料比較實(shí)驗(yàn)組研究對象的年齡、性別、吸煙、飲酒、高血壓病史、空腹血糖以及甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)，具有可比性。

2.2外周血晚期EPC的鑒定①形態(tài)：培養(yǎng)21 d后倒置顯微鏡下可觀察到晚期細(xì)胞生長旺盛，部分呈集落狀，呈現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞典型的鋪路石樣外觀(見圖1)。②雙熒光染色法：細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下，F(xiàn)ITC-UEA-I、Dil-acLDL呈雙染色陽性(見圖1)。③流式細(xì)胞儀：細(xì)胞表達(dá)CD34及CD133陽性率分別為(87.25±16.08)%，(79.14±2.67)%(見圖2)。

2.3AUDA對晚期EPC增殖能力的影響與對照組比較，CS患者晚期EPC增殖能力明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與處理前(0 μmol/L)相比，三個(gè)不同劑量(0.1、1、10 μmol/L)AUDA組均能明顯增加CS患者晚期EPC的增殖能力，且隨著AUDA劑量增加，晚期EPC的增殖能力也呈現(xiàn)出逐步遞增的趨勢(見表2)。

2.4AUDA對晚期EPC黏附能力的影響通過計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，正常人對照組晚期EPC黏附能力為(102.0±5.87)/200倍視野，與之相比CS患者晚期EPC黏附能力顯著下降[(78.4±7.23)個(gè)/200倍視野]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與處理前(0 umol/L)相比，三個(gè)不同劑量(0.1、1、10 μmol/L)AUDA組均能明顯增加CS患者晚期EPC的黏附能力，且作用呈劑量依賴性(見圖3，見表2)。

2.5AUDA對晚期EPC遷移能力的影響與粘附實(shí)驗(yàn)一致，與對照組比較，CS患者晚期EPC遷移能力明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與處理前(0 μmol/L)相比，三個(gè)不同劑量(0.1、1、10 μmol/L)AUDA組均能明顯增加CS患者晚期EPC的遷移能力，且作用呈劑量依賴性(見圖4，表2)。

2.6AUDA對晚期EPC VEGF表達(dá)的影響Western Blot 檢測結(jié)果顯示，與對照組相比CS患者晚期EPC VEGF表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與處理前(0 umol/L)相比，三個(gè)不同劑量(0.1，1，10 μmol/L)AUDA組均能呈劑量依賴性增加CS患者晚期EPC VEGF蛋白的表達(dá)(見圖5)。

表1　兩組研究對象臨床資料比較

表2　AUDA對晚期EPC功能的影響

與對照組比較aP<0.05；與0 μmol/L的AUDA組比較bP<0.05；與0 μmol/L的AUDA組比較bP<0.01

圖1　晚期EPC鑒定結(jié)果(×200) A為細(xì)胞形態(tài)，B為FITC-UEA-I染色，C為Dil-acLDL染色，D為 FITC-UEA-I/Dil-acLDL雙染色陽性

圖2　晚期EPC流式鑒定結(jié)果

圖3　AUDA對晚期EPC黏附能力的影響(×200)。A：對照組，B～E：依次為分別加入(0、0.1、1、10 μmol/L)AUDA干預(yù)的晚期EPC

圖4　AUDA對晚期EPC遷移能力的影響(×200)。A：對照組，B～E：依次為分別加入(0、0.1、1、10 μmol/L)AUDA干預(yù)的晚期EPC

圖5　Western bolt 檢測VEGF蛋白表達(dá)。①：對照組，②～⑤：依次為分別加入(0、0.1、1、10 μmol/L)AUDA干預(yù)的晚期EPC

3　討　論

隨著生活方式的改變，頸動(dòng)脈狹窄成為危害人類健康的重要疾病之一，其發(fā)病基礎(chǔ)主要是各種危險(xiǎn)因素?fù)p傷血管內(nèi)膜，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與修復(fù)動(dòng)態(tài)平衡破壞。EPC作為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，是修復(fù)損傷內(nèi)皮的種子細(xì)胞。眾多研究證實(shí)，EPC和缺血性腦血管病之間存在密切的關(guān)系，EPC可能在頸動(dòng)脈狹窄風(fēng)險(xiǎn)評估、病情判斷和疾病治療方面發(fā)揮重要作用[5]。EPC包括早期EPC和晚期EPC，晚期EPC也稱晚期外向生長內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞，較早期EPC有更強(qiáng)的增殖能力和形成血管能力[6]，可在損傷局部分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞直接參與血管修復(fù)。但也有學(xué)者認(rèn)為早期EPC雖然增殖能力弱，不能分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞直接進(jìn)行細(xì)胞替代修復(fù)血管或形成新血管，但具有很多自分泌和旁分泌功能，通過分泌血管內(nèi)皮生長因子、白介素8和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子I[7]等增加血管通透性，促進(jìn)晚期EPC的黏附及遷移，降解基質(zhì)形成毛細(xì)血管養(yǎng)管道，因此早期EPC的分泌功能對損傷內(nèi)皮的修復(fù)有重要作用。血管修復(fù)和新血管形成的開始可能主要是由早期EPC參與，在后期階段晚期EPC代替了早期EPC，最終完成血管修復(fù)和新生血管形成。早期EPC分泌的各種趨化因子和生長因子可能在整個(gè)過程中都起著重要作用，但最終增殖、分化成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞替代作用的是晚期EPC?？梢?，晚期EPC對于血管修復(fù)和新血管形成起著決定性作用。

我們從外周血分離單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)21 d后出現(xiàn)的集落，根據(jù)鑒定結(jié)果提示為晚期EPC。兩組中，頸動(dòng)脈狹窄組晚期EPC的功能明顯下降，這可能涉及以下機(jī)制：(1)本研究中頸動(dòng)脈狹窄組患者的吸煙、高血壓、糖尿病、總膽固醇、低密度脂蛋白等腦血管病危險(xiǎn)因素明顯高于對照組患者，而晚期EPC的增殖、黏附、遷移能力卻較對照組下降，推測晚期EPC功能下降可能與腦血管病危險(xiǎn)因素有關(guān)。腦血管病危險(xiǎn)因素使EPC數(shù)量減少的原因目前尚不清楚，可能與干擾調(diào)節(jié)EPC分化動(dòng)員的信號通路，促使骨髓EPC的衰竭和耗盡及促使EPC的凋亡有關(guān)。各種腦血管危險(xiǎn)因素之間還具有協(xié)同作用，對EPC功能的影響取決于各種腦血管危險(xiǎn)因素共同作用的最終結(jié)果。(2)我們前期的研究提示早期EPC對晚期EPC的功能有促進(jìn)作用，早期EPC功能的下降可能是晚期EPC功能降低的另一個(gè)原因，最終影響血管內(nèi)皮修復(fù)和新血管的形成。(3)血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，能特異地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，遷移，分化，誘發(fā)在體血管生成[8]。此外，VEGF在EPC的動(dòng)員、歸巢和分化中均發(fā)揮重要作用[9]。因而，增加VEGF水平進(jìn)而增加循環(huán)血中EPC的活性，促進(jìn)血管新生，是改善缺血腦組織血液灌注的一種有效措施。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：頸動(dòng)脈狹窄組的晚期EPC的VEGF表達(dá)較健康對照組明顯下降，這也可能是造成晚期EPC功能下降的原因，最終不足以修復(fù)受損血管內(nèi)皮和形成新血管的需要，必然導(dǎo)致血管病變的發(fā)生發(fā)展。

EET是近幾年備受關(guān)注的具有強(qiáng)大生物活性的一類環(huán)氧化合物，但EET在細(xì)胞內(nèi)半衰期短，易被sEH催化成低生物活性的代謝產(chǎn)物[10]。因此，sEHi是增加細(xì)胞內(nèi)EET濃度和效用的有效途徑[11]。研究可知在大鼠中sEHi預(yù)防缺血性損傷是通過非血管機(jī)制，因此sEHi可能會(huì)作為治療卒中的靶點(diǎn)[12]。在Apo-E基因敲出小鼠中，Ulu等[13]研究證實(shí)使用sEHi能明顯減少主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，為sEHi治療動(dòng)脈粥樣硬化提供了最直接的證據(jù)，但其具體機(jī)制尚不明確。有的研究認(rèn)為sEHi可通過EET激活MAPK和PI3K-AKT信號通路，增強(qiáng)血管的擴(kuò)張性[14]。但更引人關(guān)注的是最近的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)EET能促使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)，故認(rèn)為EET具有促使新生血管生成作用[15]。sEH抑制劑AUDA能升高細(xì)胞內(nèi)EET濃度，增強(qiáng)其作用，因此AUDA所具有的對缺血腦組織的保護(hù)作用應(yīng)與其促使新生血管生成有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用sEHi制劑AUDA后頸動(dòng)脈狹窄患者外周血晚期EPC增殖、遷移及黏附功能均明顯增加，且晚期EPC的VEGF表達(dá)呈劑量依賴性的明顯增加。因此，本研究發(fā)現(xiàn)sEHi制劑AUDA對晚期EPC功能具有正向調(diào)節(jié)作用，該作用對促進(jìn)EPC完成血管修復(fù)和新生血管形成發(fā)揮重要作用。Webler等[16]和Cheranov等[17]研究發(fā)現(xiàn)EET具有促進(jìn)VEGF介導(dǎo)的血管生成作用，因此推測sEHi-EET-VEGF是sEHi正向調(diào)節(jié)晚期EPC功能的可能信號通路，從而進(jìn)一步促進(jìn)血管修復(fù)和新血管形成。

[1]Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J]. Science，1997，275(5302)：964-967.

[2]Hur J，Yoon CH，Kim HS，et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24(2)：288-293.

[3]Spector AA，Norris AW. Action of epoxyeicosatrienoic acids on cellular function[J]. Am J Physiol Cell Physiol，2007，292(3)：C996-C1012.

[4]Larsen BT，Gutterman DD，Hatoum OA. Emerging role of epoxyeicosatrienoic acids in coronary vascular function[J]. Eur J Clin Invest，2006，36(5)：293-300.

[5]He G，Zhang H，Zhang X，et al. The comparison of EPC count and function in the situation of vascular repair at early and late stage[J]. J Thromb Thrombolysis，2013，36(3)：271-276.

[6]Yoder MC. Human endothelial progenitor cells[J]. Cold Spring Harb Perspect Med，2012，2(7)：6692.

[7]Di Stefano R，Barsotti MC，Armani C，et al. Human peripheral blood endothelial progenitor cells synthesize and express functionally active tissue factor[J]. Thromb Res，2009，123(6)：925-930.

[8]Yu L，Hales CA. Effect of chemokine receptor CXCR4 on hypoxia-induced pulmonary hypertension and vascular remodeling in rats[J]. Respir Res，2011，12：21.

[9]Foresta C，De Toni L，F(xiàn)erlin A，et al. Clinical implication of endothelial progenitor cells[J]. Expert Rev Mol Diagn，2010，10(1)：89-105.

[10]Thomson SJ，Askari A，Bishop-Bailey D. Anti-inflammatory effects of epoxyeicosatrienoic acids[J]. Int J Vasc Med，2012，2012：605101.

[11]Anandan SK，Webb HK，Chen D，et al. 1-(1-acetyl-piperidin-4-yl)-3-adamantan-1-yl-urea (AR9281) as a potent，selective，and orally available soluble epoxide hydrolase inhibitor with efficacy in rodent models of hypertension and dysglycemia[J]. Bioorg Med Chem Lett，2011，21(3)：983-988.

[12]Zhang W，Koerner IP，Noppens R，et al. Soluble epoxide hydrolase：a novel therapeutic target in stroke[J]. J Cereb Blood Flow Metab，2007，27(12)：1931-1940.

[13]Ulu A，Davis BB，Tsai HJ，et al. Soluble epoxide hydrolase inhibitors reduce the development of atherosclerosis in apolipoprotein e-knockout mouse model[J]. J Cardiovasc Pharmacol，2008，52(4)：314-323.

[14]Wang Y，Wei X，Xiao X，et al. Arachidonic acid epoxygenase metabolites stimulate endothelial cell growth and angiogenesis via mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathways[J]. J Pharmacol Exp Ther，2005，314(2)：522-532.

[15]Qiu H，Li N，Liu JY，et al. Soluble epoxide hydrolase inhibitors and heart failure[J]. Cardiovasc Ther，2011，29(2)：99-111.

[16]Webler AC，Michaelis UR，Popp R，et al. Epoxyeicosatrienoic acids are part of the VEGF-activated signaling cascade leading to angiogenesis[J]. Am J Physiol Cell Physiol，2008，295(5)：C1292-C1301.

[17]Cheranov SY，Karpurapu M，Wang D，et al. An essential role for SRC-activated STAT-3 in 14，15-EET-induced VEGF expression and angiogenesis[J]. Blood，2008，111(12)：5581-5591.

Effect of soluble epoxide hydrolase inhibitor on the function of late endothelial progenitor cell in patients with carotid stenosis

PENGXiaoqin，DINGLi，ZHOULan，etal.

(DepartmentofNeurology，TaiheHospital，HubeiUniversityofMedicine，Shiyan442000，China)

ObjectiveTo investigate the effects of soluble epoxide hydrolase inhibitor(sEHi)AUDA on the function of late endothelia1 progenitor cell(late EPC) in patients with carotid stenosis. MethodsSixty cases were divided into CS group(n=35) and control group(n=25). Mononuclear cells were isolated from the peripheral blood with density-gradient centrifugation and cultured. After 21 days，late EPC were identified，then incubated with AUDA in a series of concentrations (0，0.1，1 or 10 μmol/L) for 24 h. Late EPC proliferation，adhesion and migration were performed in MTT assay，adhesion assay and transwell chamber respectively. The expression of VEGF in late EPC was measured by Western blot. ResultsThe early EPC became long spindle on day7，and then became cornerstone shape on day21.The proliferation，adhesion and migration activities of late EPC from CS patients were obviously damaged compared with those from healthy controls(P<0.05). The AUDA could dose-dependently increase the proliferation，adhesion and migration activities and increase the expression of VEGF in late EPC compared with those from CS patients without treatment. ConclusionsEHi can positively modulate the function of late EPC from CS patients，suggesting the potential predictive significance of sEHi in the therapy of CS.

Soluble epoxide hydrolase inhibitor；Carotid stenosis；Late endothelial progenitor cell；Vascular endothelial growth factor

1003-2754(2016)07-0608-05

2016-01-10；

2016-05-03

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 2011CDB131)

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 十堰 442000)

何國厚，E-mail：taihegou07@sina.com

R743

A