促紅細(xì)胞生成素預(yù)處理在腦缺血性損傷中神經(jīng)保護(hù)作用的體外研究

王曉芳，王　妮，呂曉紅

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促紅細(xì)胞生成素預(yù)處理在腦缺血性損傷中神經(jīng)保護(hù)作用的體外研究

王曉芳，王妮，呂曉紅

目的在體外研究重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)預(yù)處理在腦缺血性損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用及其合適的劑量范圍、時(shí)間窗。方法取處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期的高純度原代皮質(zhì)神經(jīng)元，分為正常對(duì)照組、糖氧奪獲(OGD)損傷組、rhEPO預(yù)處理組。rhEPO預(yù)處理組是在不同時(shí)間(OGD損傷前24 h、48 h、72 h)給予不同濃度(0.01 U/ml、0.1 U/ml、1 U/ml、10 U/ml、100 U/ml)的rhEPO，最后以MTT比色法檢測(cè)存活率，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果rhEPO(0.01 U/ml、0.1 U/ml、1 U/ml、10 U/ml)預(yù)處理可明顯增加OGD損傷的原代皮質(zhì)神經(jīng)元的存活率(P<0.05)，其中當(dāng)濃度為1 U/ml時(shí)保護(hù)作用最強(qiáng)(P<0.05)；rhEPO(1 U/ml)預(yù)處理24 h、48 h可明顯增加OGD損傷的原代皮質(zhì)神經(jīng)元的存活率(P<0.05)，其中rhEPO預(yù)處理48 h的保護(hù)作用強(qiáng)于24 h。在光學(xué)顯微鏡下，觀察到的細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的變化與以上結(jié)果相符。結(jié)論rhEPO預(yù)處理對(duì)OGD損傷的皮質(zhì)神經(jīng)元具有神經(jīng)保護(hù)作用，其有效濃度為0.01～10 U/ml，其中最佳劑量為1 U/ml，其有效時(shí)間窗為OGD前48 h或24 h，最佳干預(yù)時(shí)間窗為OGD前48 h。

促紅細(xì)胞生成素預(yù)處理；體外培養(yǎng)神經(jīng)元；糖氧奪獲；神經(jīng)保護(hù)

近年來(lái)，促紅細(xì)胞生成素對(duì)缺血性腦血管病的神經(jīng)保護(hù)作用逐漸受到重視，目前利用重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhEPO)防治缺血性腦血管病的研究以動(dòng)物模型為主，但rhEPO難以通過(guò)血腦屏障，且容易受到其他因素干預(yù)，本研究于體外建立原代神經(jīng)元糖氧奪獲(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型，以研究rhEPO預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用。

1　材料和方法

1.1動(dòng)物健康新生24 h內(nèi)清潔級(jí)Wistar大乳鼠，雌雄不限，由吉林大學(xué)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為SCXK(吉)2013-0001]，做原代皮質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng)。

1.2主要試劑rhEPO(沈陽(yáng)三生制藥股份有限公司，10000 kU/L，生產(chǎn)批號(hào)：201506114V)；無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))；Neurobasal-A培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))；B27(Gibco公司，美國(guó))；L-谷氨酰胺(Gibco公司，美國(guó))；青霉素/鏈霉素(160 萬(wàn)u/100ml)(Sigma公司，美國(guó))；兔抗鼠神經(jīng)元特異烯醇化酶(武漢博士德公司)；山羊抗兔免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)；DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)；噻唑藍(lán)(Sigma公司，美國(guó))；DMSO(Sigma公司，美國(guó))。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的原代培養(yǎng)取出生24 h內(nèi)的Wistar大乳鼠2只，浸入70%乙醇消毒后，無(wú)菌下解剖分離雙側(cè)大腦皮質(zhì)；將其剪為1 mm×1 mm×1 mm小塊，加入0.25%的胰酶8 ml，于37 ℃培養(yǎng)箱中消化20 min后，加入等體積終止液(含20%胎牛血清的DMEM/F12)終止消化，并用吸量管吹打30次；過(guò)濾，離心(1200 r/min×6 min)，倒去上清液；加入種植液(含10%胎牛血清的DMEM/F12)重懸，混合搖勻后計(jì)數(shù)，以1×106/L、5×105/L的密度接種于經(jīng)多聚賴(lài)氨酸處理的96孔板和放有細(xì)胞爬片的24孔板中，然后置于含5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；種板4 h后全量更換神經(jīng)元專(zhuān)用培養(yǎng)液(48.5ml Neurobasal-A培養(yǎng)基+1 ml B27+0.5 ml L-谷氨酰胺+313 μl青鏈霉素)繼續(xù)培養(yǎng)；種板48 h后加入終濃度為5 μmol/L的5-溴-2’-脫氧尿苷(5-Fu)；種板72 h后全量換神經(jīng)元培養(yǎng)液，之后每3 d半量換液，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征(見(jiàn)圖1)。

1.3.2NSE鑒定將培養(yǎng)至7 d的細(xì)胞爬片取出，按鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法(streptavidin-perosidase，SP)法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。同時(shí)用PBS替代第一抗體作為陰性對(duì)照。對(duì)于NSE免疫細(xì)胞爬片，每張隨機(jī)選取5個(gè)視野，高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)即總細(xì)胞數(shù)，同一視野中胞質(zhì)及其突起內(nèi)含棕色顆粒者即神經(jīng)元，神經(jīng)元數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)即為所得陽(yáng)性率。

1.3.3原代皮質(zhì)神經(jīng)元生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定種板后3 d～12 d每天取一塊96孔板通過(guò)噻唑藍(lán)[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]比色法測(cè)量其光密度值(optical delnsity，OD)，每塊板種10孔，將所測(cè)得的OD平均值連成曲線(xiàn)。

1.3.4原代皮質(zhì)神經(jīng)元OGD模型建立結(jié)合1.3.2和1.3.3結(jié)果，可得種板后7 d～11 d為生長(zhǎng)穩(wěn)定期，并且神經(jīng)元具有高純度，種板后7 d取4塊96孔板，每塊板種10孔，其中1塊為正常對(duì)照組，其余3塊全量換無(wú)糖DMEM，同時(shí)置于<1%O25%CO295%N2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12 h、15 h、18 h，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并通過(guò)MTT比色法測(cè)量OD值，計(jì)算存活率。

1.3.5原代皮質(zhì)神經(jīng)元不同劑量rhEPO預(yù)處理與OGD損傷的關(guān)系種板后7 d取2塊96孔板，編號(hào)為1、2，分為3組：(1)正常對(duì)照組 取1號(hào)板，共種10孔，正常條件下培養(yǎng)；(2)OGD損傷組 取2號(hào)板 B2-B11孔，不加藥物處理，培養(yǎng)24 h后給予OGD處理15 h；(3)rhEPO預(yù)處理組 取2號(hào)板，于C2-C11、D2-D11、E2-E11、F2-F11、G2-G11分別給予10 μl/孔終濃度為100 U/ml、10 U/ml、1 U/ml、100 U/L、10 U/L的rhEPO，培養(yǎng)24 h后給予OGD處理15 h。最后于光鏡下觀察各組神經(jīng)元形態(tài)變化，并采用MTT比色法測(cè)量其OD值，計(jì)算存活率。

1.3.6原代皮質(zhì)神經(jīng)元不同時(shí)間rhEPO預(yù)處理與OGD損傷的關(guān)系結(jié)合1.3.5，得最佳劑量為1 U/ml，于種板后第7d取2塊96孔板，同樣編號(hào)為1、2，分為3組：(1)正常對(duì)照組 取1號(hào)板，共種10孔，正常條件下培養(yǎng)；(2)OGD損傷組 取2號(hào)板 B2-B11孔，不加藥物處理，與rhEPO預(yù)處理組同時(shí)行OGD處理15h；(3)rhEPO預(yù)處理組 取2號(hào)板，在OGD15 h處理前24 h、48 h、72 h分別給予終濃度為1 U/ml的rhEPO預(yù)處理，各10孔。最后于光鏡下觀察各組神經(jīng)元形態(tài)變化，并采用MTT比色法測(cè)量其OD值，計(jì)算存活率。

2　結(jié)　果

2.1NSE鑒定取7 d原代神經(jīng)元行NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，可得NSE陽(yáng)性率在92.33%±2.88%。NSE陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為胞體及突觸均顯示棕黃色，細(xì)胞核被染為藍(lán)紫色，NSE陰性染色表現(xiàn)為胞體及突出無(wú)著色，僅細(xì)胞核被染為藍(lán)紫色(見(jiàn)圖2)。

2.2神經(jīng)元生長(zhǎng)曲線(xiàn)將10次OD值平均值連成曲線(xiàn)，可得3 d～7 d OD值為上升趨勢(shì)，7 d～11 d OD值趨向穩(wěn)定，之后OD值下降(見(jiàn)圖3)。

2.3建立原代神經(jīng)元體外OGD模型如圖4。隨OGD損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，原代神經(jīng)元的生存率下降，其中OGD15h損傷對(duì)神經(jīng)元生存率的影響適中，與OGD12h、OGD18h組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，可作為建模條件(見(jiàn)表1)。

2.4不同劑量rhEPO預(yù)處理對(duì)OGD損傷的原代皮質(zhì)神經(jīng)元存活率的影響如圖5。與OGD損傷組比較，rhEPO預(yù)處理濃度為0.01 U/ml～10 U/ml時(shí)，可提高原代神經(jīng)元存活率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中當(dāng)濃度為1 U/ml時(shí)，其神經(jīng)保護(hù)作用最強(qiáng)，與其他劑量組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

2.5不同時(shí)間rhEPO預(yù)處理對(duì)OGD損傷的原代皮質(zhì)神經(jīng)元存活率的影響如圖6。與OGD損傷組相比，在OGD損傷之前24 h、48 h行終濃度為1 U/ml的rhEPO預(yù)處理，可提高原代皮質(zhì)神經(jīng)元的存活率，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與OGD損傷組相比，在OGD損傷之前72 h行同樣濃度的rhEPO預(yù)處理，則無(wú)神經(jīng)保護(hù)作用，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；rhEPO預(yù)處理48 h與rhEPO預(yù)處理24 h相比，神經(jīng)保護(hù)作用更強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表1　不同時(shí)間OGD對(duì)原代皮質(zhì)神經(jīng)元存活率的影響

模型組1、2、3分別與正常對(duì)照組相比*P<0.01；模型組2分別與模型組1、3相比ΔP<0.01

表2　不同劑量rhEPO預(yù)處理對(duì)原代皮質(zhì)神經(jīng)元存活率的影響

rhEPO預(yù)處理組2、3、4、5與OGD損傷組相比*P<0.05； rhEPO預(yù)處理組3與其余各組相比ΔP<0.05

表3　不同時(shí)間rhEPO預(yù)處理對(duì)原代皮質(zhì)神經(jīng)元存活率的影響

rhEPO預(yù)處理組①、②分別與OGD損傷組相比*P<0.05 ；rhEPO預(yù)處理組①與rhEPO預(yù)處理組②相比ΔP<0.05

3　討　論

近年來(lái)，已有動(dòng)物研究和體外研究表明內(nèi)源性或外源性EPO預(yù)處理對(duì)腦缺血性損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制與其參與抗細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[1～4]、抗炎性作用[5]、抗氧化應(yīng)激[6]、保護(hù)血腦屏障[7]、增加血管生成反應(yīng)[8]等其他保護(hù)機(jī)制有關(guān)。該體外研究通過(guò)比較缺糖缺氧原代皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)rhEPO預(yù)處理干預(yù)后存活率的變化及光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)的變化，發(fā)現(xiàn)EPO預(yù)處理在腦缺血性損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用存在有效劑量范圍和有效時(shí)間窗。

對(duì)純度達(dá)90%以上的原代皮質(zhì)神經(jīng)元于其生長(zhǎng)平臺(tái)期給予OGD損傷 15 h，損傷率可達(dá)40%左右，若預(yù)先給予rhEPO處理24 h，可見(jiàn)當(dāng)rhEPO濃度達(dá)1 U/ml時(shí)其神經(jīng)保護(hù)作用最大，當(dāng)濃度達(dá)100 U/ml時(shí)，其神經(jīng)保護(hù)作用消失，該結(jié)果提示rhEPO對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的活性可能呈雙向調(diào)節(jié)作用，高濃度EPO可能是抑制神經(jīng)細(xì)胞活性的因素之一。Ruscher等曾在腦缺血性損傷的體外研究中發(fā)現(xiàn)100 U/L rhEPO預(yù)處理相對(duì)于10 U/L、1 U/L的濃度神經(jīng)保護(hù)作用更強(qiáng)[1]，該研究劑量范圍較窄，無(wú)更高濃度rhEPO預(yù)處理研究。楊慧等對(duì)原代皮質(zhì)神經(jīng)元進(jìn)行類(lèi)似體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行了更高濃度rhEPO預(yù)處理研究，表明1 U/ml rhEPO組的細(xì)胞活性分別高于0.1 U/ml、10 U/ml組[9]。本研究結(jié)果與楊慧等的研究結(jié)果大致是一致的，揭示了rhEPO預(yù)處理在腦缺血性損傷中神經(jīng)保護(hù)作用的劑量依賴(lài)性曲線(xiàn)為鐘型，其最適濃度在1 U/ml左右。其可能的機(jī)制為：神經(jīng)元表面分布有兩種類(lèi)型的促紅細(xì)胞生成素受體(Erythropoietin receptor，EPOR)，即高親和力的同源二聚體EPOR/EPOR和低親和力的異源二聚體EPOR/CD131，其中的CD131是粒細(xì)胞一巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)、白細(xì)胞介素-3(interleukin-3，IL-3)與IL-5的三種受體中的β共同亞基(hβc)，EPOR/CD131發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；高濃度的EPO會(huì)促使EPOR的表達(dá)量顯著增加，而CD131卻未隨之增加，這使得原來(lái)相對(duì)豐富的EPOR/CD131的比例明顯降低，再者它的親和力較低，從而高濃度的EPO治療反而產(chǎn)生不利作用[10]。

另外，該體外研究表明EPO預(yù)處理在腦缺血性損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用也是需要滿(mǎn)足一定時(shí)間窗的。同樣對(duì)高純度原代皮質(zhì)神經(jīng)元給予濃度為1 U/ml不同時(shí)間的rhEPO預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)48 h時(shí)神經(jīng)保護(hù)作用最強(qiáng)，24 h次之，72 h時(shí)則未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用。Ruscher等曾在體外研究中也發(fā)現(xiàn)rhEPO治療后提供的對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用并非是持續(xù)不斷的，即5 min時(shí)保護(hù)作用較強(qiáng)，之后保護(hù)作用減弱，24 h后保護(hù)作用再次加強(qiáng)，并于48 h達(dá)到高峰，早期的保護(hù)作用可能是在翻譯后水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，而24 h之后的保護(hù)作用則可能是在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)節(jié)[1]。但在另一項(xiàng)活體研究中，分別在沙土鼠行腦缺血再灌注損傷前12 h、24 h、48 h給予腹腔注射1000 U/Kg rhEPO，EPO預(yù)處理24 h時(shí)其細(xì)胞凋亡數(shù)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(InferleuKi-1β，IL-1β)含量最低，說(shuō)明腦缺血前24 h為干預(yù)的最佳時(shí)間窗，推測(cè)與其清除自由基、抗炎性免疫反應(yīng)及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用有關(guān)[11]。以上活體研究與體外研究結(jié)果不同可能與病理機(jī)制、EPO預(yù)處理參與的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制不完全相同有關(guān)，但都說(shuō)明了rhEPO干預(yù)時(shí)間過(guò)短或是過(guò)長(zhǎng)均不能達(dá)到最佳的神經(jīng)保護(hù)作用。

目前已有rhEPO用于治療缺血性腦卒中的臨床研究，尚無(wú)rhEPO用于預(yù)防缺血性腦卒中的臨床研究，如何以最佳劑量、最佳時(shí)間窗未來(lái)應(yīng)用于臨床尚需體外研究和活體研究的進(jìn)一步摸索。

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Study on Neuroprotective Effect of Erythropoietin Pretreatment on Cerebral Ischemia Injury in Vitro

WANGXiaofang，WANGNi，LVXiaohong

(DepartmentofNeurologyandNeuroscienceCenter，F(xiàn)irstHospitalofJilinUniversity，Changchun130021，China)

ObjectiveTo study the protective effect of rhEPO pretreatment on cerebral ischemia injury and to explore the suitable dosage range and time window in vitro. MethodsThe primary cultured cerebral cortex neurons of high purity at stable growth phase were divided into three groups，namely the normal control group，oxygen-glucose deprivation group and rhEPO pretreation group. RhEPO in different concentration(0.01 U/ml、0.1 U/ml、1 U/ml、10 U/ml、100 U/ml) were given at different time points(24 h，48 h，72 h before OGD) in rhEPO pretreation group. The viability of cells was determined by MTT assay and cell morphology was observed under light microscopy. ResultsRhEPO pretreation at the concentration of 0.01、0.1、1、10 U/ml could significantly increase the viability of neurons damaged by OGD(P<0.05)respectively and when the concentration of rhEPO was 1U·mL-1，the protective effect was the strongest(P<0.05). Before OGD，preincubation of neurons with 1U/ml rhEPO for 24h or 48h induced a prolonged neuroprotection(P<0.05). The maximum of protection was observed after a pretreatment period of 48h(P<0.05). These findings could also be proven by the improved morphology of neurons. ConclusionOur studies had revealed the markedly neuroprotective effect of rhEPO pretreatment on the cerebral cortical neurons in OGD. It’s effective concentration was 0.01～10 U/ml and the most effective concentration was 1 U/ml. Further more，the effective time window was 48 h or 24 h before OGD，of which 48 h before OGD was better.

Erythropoietin Pretreatment；Neurons Cultured in Vitro；OGD；Neuroprotection

1003-2754(2016)07-0584-04

2016-05-19；

2016-06-20

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

呂曉紅，E-mail：lvxiaohong. student@ sina.com

R743

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