過(guò)氧化氫對(duì)人小梁細(xì)胞GRP78和CHOP表達(dá)的影響*

朱　艷,朱玉廣,孫寶琪,陳　晨,李　珺,李　霞

濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科中心 濰坊 261053

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過(guò)氧化氫對(duì)人小梁細(xì)胞GRP78和CHOP表達(dá)的影響*

朱艷,朱玉廣#,孫寶琪,陳晨,李珺,李霞

濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科中心 濰坊 261053

過(guò)氧化氫；氧化應(yīng)激；人小梁細(xì)胞；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

目的：觀察H2O2對(duì)人小梁細(xì)胞(HTCs)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP及其mRNA表達(dá)的影響。方法：實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、H2O26 h組、H2O212 h組和H2O224 h組，分別以600 μmol/L H2O2作用于HTCs 0、6、12及24 h后，采用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞中CHOP、GRP78 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果：對(duì)照組無(wú)GRP78和CHOP的表達(dá)；H2O2處理后HTCs GRP78、CHOP mRNA及蛋白的表達(dá)水平均升高，且隨著H2O2作用時(shí)間的延長(zhǎng)，GRP78、CHOP mRNA及蛋白的表達(dá)水平升高(P均<0.05)。結(jié)論：H2O2可誘導(dǎo)HTCs發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而參與HTCs的氧化損傷。

原發(fā)性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma,POAG)是我國(guó)主要致盲性眼病之一，眼內(nèi)壓升高是POAG的主要危險(xiǎn)因素[1]。小梁細(xì)胞及其細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的功能及結(jié)構(gòu)異常是導(dǎo)致房水流暢系數(shù)降低、眼內(nèi)壓升高的主要原因。有研究[2]表明小梁細(xì)胞的氧化損傷可導(dǎo)致眼內(nèi)壓的升高。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、修飾和折疊的場(chǎng)所，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂的一種病理狀態(tài)，是機(jī)體的一種自我防御機(jī)制，過(guò)度的ERS將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞的生理功能[3]。近年來(lái)研究[4-5]發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激、ERS與POAG的發(fā)生密切相關(guān)；小梁細(xì)胞的氧化應(yīng)激可影響小梁細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，影響房水的流出阻力。GRP78、CHOP是ERS的標(biāo)志性蛋白。該研究中作者建立了人小梁細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，并采用Real time-PCR和Western blot法觀察H2O2誘導(dǎo)的人小梁細(xì)胞中GRP78、CHOP在基因和蛋白水平表達(dá)的變化，以探討ERS在人小梁細(xì)胞氧化損傷中的作用及青光眼的發(fā)病機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料人小梁細(xì)胞株(HTC)購(gòu)自上海復(fù)蒙公司。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、Trizol試劑(Gibco公司)，Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(ABI公司)，兔抗人GRP78單克隆抗體(Santa Cruz公司)，兔抗人CHOP單克隆抗體(R&D公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔二抗(Bethyl公司)，RNA提取試劑盒(Invitrogen公司)，RT試劑盒、PCR試劑盒(Casarray公司)，山羊抗兔 IgG (上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2HTCs的培養(yǎng)與傳代液氮冷凍保存的HTCs快速解凍后，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，吹打混勻后分裝、培養(yǎng)。3～4 d換液1次。待HTCs達(dá) 90%融合時(shí)，胰蛋白酶消化傳代。選擇傳3代的HTCs進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HTCs，分為對(duì)照組、H2O26 h組、H2O212 h組和H2O224 h組，后3組在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為600 μmol/L的H2O2，處理時(shí)間分別為6、12和24 h。

1.44組HTCs GRP78和CHOP mRNA的檢測(cè)

采用Real time-PCR法檢測(cè)CHOP和GRP78 mRNA的表達(dá)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。CHOP上游引物5’-CAGAACCAGCAGAG GTCACA-3’， 下游引物5’-AGCTGTGCCACTTTC CTTTC-3’；GRP78上游引物5’-TGATTCCAAGGAA CACAGT-3’， 下游引物:5’-GTCAGATCAAATGTAC CCA-3’；內(nèi)參β-actin上游引物5’-GTGAAGGTGA CAGCAGTCG-3’， 下游引物5’-GATGGCAAGGGACT TCCTG-3’。 反應(yīng)體系(50 μL)：Power SYBR Green PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各2.5 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 15 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共45個(gè)循環(huán)。目的基因 mRNA的表達(dá)量以目的基因和β-actin的熒光值的比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.54組HTCs GRP78和CHOP蛋白的檢測(cè)

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較各組HTCs中GRP78和CHOP mRNA和蛋白表達(dá)水平的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

4組HTCs GRP78、CHOP蛋白的表達(dá)見圖1。對(duì)照組細(xì)胞中無(wú)GRP78、CHOP mRNA及蛋白的表達(dá)。各H2O2處理組HTCs GRP78、CHOP mRNA及蛋白的表達(dá)水平均升高，且隨著H2O2作用時(shí)間的延長(zhǎng)，GRP78、CHOP mRNA及蛋白的表達(dá)水平升高，見表1、2。

1：對(duì)照組；2：H2O2 6 h組；3：H2O2 12 h組；4：H2O2 24 h組。圖1　4組HTCs GRP78和CHOP蛋白的表達(dá)

表1　各H2O2組HTCs GRP78、CHOP mRNA表達(dá)水平的比較

*：組間兩兩比較，P均<0.05。

表2　各H2O2組HTCs GRP78、CHOP 蛋白表達(dá)水平的比較

*：組間兩兩比較，P均<0.05。

3　討論

POAG的病因及發(fā)病機(jī)制未明，臨床上尚無(wú)有效的防治方法。研究[5]發(fā)現(xiàn)，在青光眼中，氧化應(yīng)激可能通過(guò)損傷小梁網(wǎng)而導(dǎo)致眼壓的升高。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊與分泌的細(xì)胞器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是實(shí)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的基本條件。氧化應(yīng)激等多種因素可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，形成ERS。ERS是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂的一種病理狀態(tài)，是機(jī)體的一種自我防御機(jī)制，過(guò)度的 ERS將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞的生理功能[3]。近年來(lái)研究[6]發(fā)現(xiàn)，POAG患者的小梁細(xì)胞發(fā)生了ERS，ERS在POAG發(fā)生中可能起到非常重要的作用。

GRP78和CHOP均是ERS的標(biāo)志性蛋白。H2O2是人眼房水中的主要氧化物質(zhì)，作者利用H2O2作用于HTCs以模擬人小梁細(xì)胞氧化應(yīng)激的狀態(tài)。以往實(shí)驗(yàn)[7]中作者選擇600 μmol/L H2O2處理HTCs 2 h，既不影響HTCs的生存，又能模擬氧化應(yīng)激。作者[4]前期對(duì)豬小梁細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)豬小梁細(xì)胞NF-κB通路的激活，同時(shí)促進(jìn)小梁細(xì)胞MMPs/TIMPs的表達(dá)，提示氧化應(yīng)激可能參與調(diào)控小梁網(wǎng)ECM的重塑，影響房水流出，導(dǎo)致眼內(nèi)壓的升高[5,8-9]。

該研究結(jié)果顯示：對(duì)照組HTCs中無(wú)GRP78和CHOP的表達(dá)；H2O2處理能明顯促進(jìn)HTCs GRP78、CHOP mRNA及蛋白的表達(dá)，且隨著H2O2作用時(shí)間的延長(zhǎng)，各H2O2處理組GRP78和CHOP mRNA及蛋白的表達(dá)水平升高，提示H2O2可以誘導(dǎo)HTCs發(fā)生ERS。推測(cè)H2O2作用后可能引起細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變和ERS，為維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，GRP78 mRNA增多，使GRP78蛋白表達(dá)增多，以減輕H2O2所引起的ERS作用。除了GRP78表達(dá)增多，H2O2作用HTCs后還可以誘導(dǎo)CHOP mRNA和蛋白的表達(dá)增多，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞通過(guò)ERS途徑發(fā)生氧化損傷。

綜上所述，作者從氧化應(yīng)激的角度出發(fā)，利用H2O2構(gòu)建氧化應(yīng)激HTCs模型，結(jié)果表明H2O2可誘導(dǎo)人小梁細(xì)胞發(fā)生ERS，從而參與人小梁細(xì)胞的氧化損傷。由于體內(nèi)外環(huán)境的不同，有必要進(jìn)一步研究青光眼模型，探討氧化應(yīng)激以及ERS對(duì)小梁網(wǎng)ECM重塑的影響，為臨床青光眼的防治提供理論依據(jù)。

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[4]朱玉廣,王杰,朱艷,等.氧化應(yīng)激介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路對(duì)豬小梁細(xì)胞MMPs/TIMPs表達(dá)的作用研究[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2012,50(5):51

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(2015-11-12收稿責(zé)任編輯徐春燕)

Effects of H2O2on expressions of GRP78 and CHOP in human trabecular meshwork cells

ZHUYan,ZHUYuguang,SUNBaoqi,CHENChen,LIJun,LIXia

OphthalmicCenter，theAffiliatedHospital,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053

H2O2;oxidative stress;human trabecular meshwork cell;endoplasmic reticulum stress

Aim: To observe the effects of H2O2on expressions of endoplasmic reticulum stress(ERS) markers GRP78 and CHOP in human trabecular meshwork cells(HTCs),so as to explore the role of ERS in the oxidative damage of HTCs.Methods: The experiment included control group, H2O26 h group, H2O212 h group and H2O224 h group, and HTCs were treated with 600 μmol/L H2O2for 0,6,12 and 24 h,respectively. The expressions of GRP78 and CHOP mRNA and protein were determined by Real-time PCR and Western blot, respectively.Results: Compared with control group, the expression levels of GRP78 and CHOP mRNA and protein in various H2O2treatment groups increased; the expressions levels of GRP78 and CHOP mRNA and protein tended to increase along with the prolongation of H2O2treatment(P<0.05).Conclusion: Exogenous H2O2could induce ERS in HTCs,which is involved in the oxidative damage of HTCs.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.024

*山東省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃資助項(xiàng)目2015WS0047

，男，1972年4月生，博士，副教授，研究方向：白內(nèi)障、青光眼的防治，E-mail:yg_zhu.md@tom.com

R775.1