秘魯巨魷軟骨硫酸軟骨素理化性質(zhì)研究

李燕妮，郭琳，許維娜（濱州醫(yī)學(xué)院葡萄酒學(xué)院，山東煙臺(tái)264003）

秘魯巨魷軟骨硫酸軟骨素理化性質(zhì)研究

李燕妮，郭琳，許維娜
（濱州醫(yī)學(xué)院葡萄酒學(xué)院，山東煙臺(tái)264003）

探索一種新的硫酸軟骨素來源。以秘魯巨魷軟骨為原料，經(jīng)過酶解、超濾濃縮和乙醇沉淀的方法獲得硫酸軟骨素。秘魯巨魷硫酸軟骨素得率為3.2%，比旋度為-25.2°，黏均分子量為157 000，硫酸軟骨素E型二糖占總二糖比例的17%。秘魯巨魷軟骨可以作為一種硫酸軟骨素新原料。

秘魯巨魷；硫酸軟骨素；酶解高效液相；E型硫酸軟骨素二糖

硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，CS）是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖胺聚糖，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺（GlcA-GalNAc）以β-1，3糖苷鍵連接形成二糖，二糖單位之間以β-1，4糖苷鍵連接而形成多聚糖［1-2］。硫酸軟骨素廣泛存在于各種動(dòng)物組織中，尤其在軟骨和結(jié)締組織中含量豐富，不同生物或者同一生物的不同組織所含CS的種類均不同［3］。

根據(jù)CS的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通常將天然來源的CS硫酸化二糖分為A、B、C、D、E、F、H、K、L和M等［4-5］。其中魷魚硫酸軟骨素中特有的CS-E型二糖可用于抗抗瘧疾、抑制I型單純皰疹病毒（HSV-I）的感染和神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)，作為新的食品原料日漸受到重視［6-8］。

秘魯巨魷?zhǔn)敲乐薮蟪圄湹乃追Q，屬真魷科（ommastrephida）美洲大赤魷屬（Dosidicus），其生命周期短，生長迅速，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的個(gè)體最大，資源最豐富的魷魚物種之一［9］。本文以其頭部軟骨為原料進(jìn)行試驗(yàn)，使用木瓜蛋白酶處理軟骨，結(jié)合超濾方法來提取和純化硫酸軟骨素，并對(duì)其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，旨在為其在功能性食品、生物醫(yī)藥及其它相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

秘魯巨魷軟骨：煙臺(tái)大宸食品有限公司；木瓜蛋白酶：廣西南寧龐博生物工程有限公司；硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所；鯊魚硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品：西格瑪；無水乙醇等其它檢驗(yàn)試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Primo R高速冷凍離心機(jī)：德國Heraeus公司；Minimate TFF system超濾機(jī)：PALL；8453型紫外－可見光分光光度計(jì)：惠普上海儀器有限公司；Nexus 5DXC FT—IR紅外光譜儀：美國Nieolet；1260 Infinity液相色譜：安捷倫。

1.3分析方法

黏均分子量：采用測(cè)定高分子特征黏度的方法來得到黏均分子量［10］。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定：福林酚法［11］。

CS含量測(cè)定：采用氯化十六烷基吡啶（Hexadecylpyridinium chloride，CPC）法［11］。

酶解產(chǎn)物高效液相法測(cè)定：ZorbaxSAX色譜柱，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，紫外232 nm檢測(cè)。流動(dòng)相A：0.2 mol/L NaCl，pH3.5，流動(dòng)相B：1.5 mol/L NaCl，pH3.5［12］。

紅外吸收光譜：KBr壓片，4 000 cm-1～400 cm-1波數(shù)范圍掃描。

1.4方法

1.4.1硫酸軟骨素的分離

取1 kg鮮新秘魯巨魷軟骨，勻漿后加入1.0 L純化水，調(diào)節(jié)pH 7.5～8.0，加入4.0 g（相當(dāng)于軟骨質(zhì)量的0.4%）木瓜蛋白酶于50℃水解6 h。調(diào)節(jié)pH 6.0，85℃處理10 min。將水解液離心去除不容物后再用微孔濾膜過濾澄清。

1.4.2硫酸軟骨素的純化

純化的過程分為超濾濃縮和乙醇沉淀兩個(gè)部分。超濾選用截留分子量10 kDa的超濾膜進(jìn)行水解液的濃縮，將料液濃縮到1/2體積。濃縮后的料液加入兩倍體積無水乙醇，離心得到硫酸軟骨素沉淀，烘干。

2　結(jié)果與討論

2.1魷魚硫酸軟骨素基本理化性質(zhì)

精制的CS樣品為白色粉末，秘魯巨魷軟骨硫酸軟骨素基本理化性質(zhì)見表1。

表1　秘魯巨魷軟骨硫酸軟骨素基本理化性質(zhì)Tab 1 The properties of chondroitin sulfate from Dosidicus gigas cartilage

如表1所示，比旋度為-25.2°，比鯊魚硫酸軟骨素的-12°～-19°大，反而和陸生動(dòng)物的-20°～-30°范圍接近。采用黏均分子量的檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)秘魯巨魷軟骨硫酸軟骨素的分子量為15.7萬，要高于鯊魚硫酸軟骨素（4.5萬）和豬硫酸軟骨素（2.1萬）［13］。秘魯巨魷軟骨硫酸軟骨素的得率為3.2%，較一般陸生動(dòng)物的低，比如新鮮的豬鼻軟骨硫酸軟骨素含量就高達(dá)10%［3］。

2.2硫酸軟骨素二糖構(gòu)成

秘魯巨魷硫酸軟骨素酶解高效液相結(jié)果見表2和圖1。

表2　秘魯巨魷軟骨硫酸軟骨素二糖組成Table 2　Disaccharide compositions of CS from Dosidicus gigas cartilage

圖1　秘魯巨魷硫酸軟骨素酶解物高效液相圖Fig.1　Dosidicus gigas cartilage chondroitin sulfate enzymolysis-HPLC

秘魯巨魷軟骨素中CS-E型二糖含量為17%左右，其余二糖單位的結(jié)構(gòu)與牛硫酸軟骨素類似［3］。

2.3紅外圖譜

秘魯巨魷和鯊魚硫酸軟骨素的紅外吸收光譜很相似見圖2。

圖2　秘魯巨魷（A）和鯊魚（B）硫酸軟骨素紅外光譜圖Fig.2　The infared spectrum of CS from Dosidicus gigas and shark cartilage

硫酸軟骨素中羥基和氨基的伸縮振動(dòng)出現(xiàn)在3400 cm-1左右、-CH，-CH2的伸縮振動(dòng)出現(xiàn)在2 920 cm-1、乙酰胺的彎曲振動(dòng)出現(xiàn)在1 650 cm-1、羧基的對(duì)稱伸縮振動(dòng)出現(xiàn)在1410cm-1、硫酸基特征吸收出現(xiàn)在1230cm-1及820cm-1，1070cm-1～1030cm-1，為硫酸軟骨素特征峰。

與鯊魚硫酸軟骨素的紅外吸收光譜稍有不同的是，秘魯巨魷硫酸軟骨素的硫酸基吸收峰1 230 cm-1處稍強(qiáng)，說明秘魯巨魷硫酸軟骨素中有可能二硫酸化二糖的比例比較高，甚至含有少量三硫酸化的二糖。當(dāng)硫酸軟骨素在與蛋白質(zhì)或其他細(xì)胞組分發(fā)生相互反應(yīng)時(shí)，硫酸基起到了非常重要的作用，因此可以預(yù)測(cè)，相比常見的商品硫酸軟骨素，秘魯魷魚軟骨硫酸軟骨素可能具有更高的生物活性。

3　結(jié)論

秘魯巨魷軟骨硫酸軟骨素黏均分子量為157 000，蛋白質(zhì)含量為4.0%，硫酸軟骨素含量為90.4%。目前秘魯巨魷產(chǎn)量一直處于增長的狀態(tài)，從中提取的硫酸軟骨素可以成為一種穩(wěn)定的硫酸軟骨素新來源。

酶解高效液相顯示秘魯巨魷軟骨硫酸軟骨素中CS-E型二糖單元含量為17%，是一種與鯊魚、豬、牛硫酸軟骨素等市售硫酸軟骨素不同的新種類。

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The Properties of Chondroitin Sulfate from Dosidicus gigas Cartilage

LI Yan-ni，GUO Lin，XU Wei-na
（School of Enology，Binzhou Medical College，Yantai 264003，Shandong，China）

The arm of this research was to explore a new sources of chondroitin sulfate.With the purification process of enzymolysis，filtration and ethanol precipitation，chondroitin sulfate（CS）was purified from the cartilage of Dosidicus gigas and characterized in an effort to find alternative source.The yield of CS was about 3.2%，the specific rotation was-25.2°，viscosity-average molecular was 157 000，the E-type disulfated disaccharides was 17%in all CS extracts.The Dosidicus gigas cartilage can be used as a new source of CS.

Dosidicus gigas；chondroitin sulfate；enzymolysis-HPLC；CS（E-type）

2016-05-10

山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃（J16LC57）

李燕妮（1980—），女（漢），講師，碩士，研究方向：海洋產(chǎn)物分離提取。