低活性β-葡糖苷酶酵母菌株的篩選及其在黑莓果酒發(fā)酵中的應(yīng)用

王　英，周劍忠，胡彥新，梁紅云，夏秀東，黃自蘇

低活性β-葡糖苷酶酵母菌株的篩選及其在黑莓果酒發(fā)酵中的應(yīng)用

王英，周劍忠，胡彥新，梁紅云，夏秀東，黃自蘇

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

從本實(shí)驗(yàn)室保存的23株來(lái)源于自然發(fā)酵果酒的酵母中篩選到1株β-葡糖苷酶活性較低、生長(zhǎng)快且不產(chǎn)膜的酵母FY4，經(jīng)18S rDNA序列分析，該菌株鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。利用該菌株發(fā)酵黑莓果酒，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)考察了發(fā)酵溫度、果膠酶用量、加糖量和接種量對(duì)黑莓果酒中花色苷含量的影響。結(jié)果表明，當(dāng)酵母FY4接種量為2%，發(fā)酵溫度為32℃，加糖量為14%，果膠酶添加量為0.22%時(shí)，發(fā)酵后黑莓果酒中的花色苷含量達(dá)到（406.31±5.64）mg/L，是相同條件下利用商業(yè)釀酒酵母PHYTHM.nsac發(fā)酵的黑莓果酒中花色苷含量的1.53倍。

β-葡糖苷酶；釀酒酵母；鑒定；花色苷；黑莓果酒

花色苷（anthocyanins）是植物體內(nèi)的一種色素類物質(zhì)，能夠賦予植物不同的顏色。由于花色苷對(duì)人體具有多方面的保健功能，如抗癌、抗炎、保護(hù)心血管、改善肝功能和視力［1-5］。隨著生活水平的提高和保健意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)花色苷提取、花色苷結(jié)構(gòu)的分析、花色苷穩(wěn)定性、功能食品的開發(fā)成為目前的研究熱點(diǎn)［6-9］。

由于花色苷的結(jié)構(gòu)特征和苷元的高活性，導(dǎo)致花色苷的穩(wěn)定性較差［10］。研究結(jié)果表明，果酒、果汁中的花色苷含量隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，花色苷含量會(huì)有不同程度的下降［11］。導(dǎo)致花色苷降解的因素很多，溫度、pH、體系的氧化狀態(tài)等都能影響花色苷的降解速度［12］。據(jù)有關(guān)研究報(bào)道，能夠使花色苷降解的酶廣泛存在于高等植物及微生物體內(nèi)［13］，主要包括β-葡糖苷酶（β-glucosidase）、多酚氧化物酶（polyphenol oxidase）和過(guò)氧化物酶（peroxidase）等酶類，因此減少和鈍化不利于花色苷保存的酶活性是提高果酒中花色苷含量的手段之一［14］。

大量的研究結(jié)果表明真菌和高等植物中存在β-葡糖苷酶［15-16］。β-葡糖苷酶（β-glucosidase）催化花色苷β-糖苷鍵斷裂，生成糖和花色素，花色素很不穩(wěn)定，可自發(fā)轉(zhuǎn)換成無(wú)色衍生物。因此，黑莓、藍(lán)莓、樹莓等果酒、果汁等花色苷含量高的體系中的β-葡糖苷酶對(duì)果酒、果汁的色澤穩(wěn)定性具有重要的作用，同時(shí)β-葡糖苷酶對(duì)保持果酒、果汁中的花色苷含量也具有重要作用。目前，文獻(xiàn)報(bào)道［17］主要是β-葡糖苷酶對(duì)果酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，β-葡糖苷酶對(duì)果酒的色澤穩(wěn)定性、花色苷含量的影響還少有相關(guān)的報(bào)道。

本研究從本實(shí)驗(yàn)室保存的自然發(fā)酵果酒中分離獲得的23株酵母中篩選β-葡糖苷酶活性低的酵母，利用篩選酵母發(fā)酵黑莓果酒，研究發(fā)酵條件（發(fā)酵溫度、果膠酶用量、接種量和蔗糖添加量）對(duì)發(fā)酵黑莓果酒中花色苷含量的影響，旨在為高含量花色苷黑莓果酒發(fā)酵提供優(yōu)良的酵母資源。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株來(lái)源及實(shí)驗(yàn)材料

酵母菌株23株：由江蘇省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所生物工程研究室保存。其中，菌株F1～F6，來(lái)源于自然發(fā)酵的葡萄果酒；菌株F7～F15，來(lái)源于自然發(fā)酵的藍(lán)莓果酒；菌株FY1～FY8，來(lái)源于自然發(fā)酵的黑莓果酒。商業(yè)釀酒酵母PHYTHM.nsac：丹麥Chr.hansen公司；黑莓（Rubus fruticosus）：江蘇省南京市溧水縣黑莓種植基地。

1.1.2主要試劑

3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylicacid，DNS）（分析純）、七葉苷（分析純）、偏重亞硫酸鉀（食品級(jí)）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水楊苷（分析純）：上海扶生實(shí)業(yè)有限公司；果膠酶（300000U/g）：諾維信生物技術(shù)有限公司；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑及DNA Marker：寶生物工程有限公司；PCR引物：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；對(duì)硝基苯酚：天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、檸檬酸、磷酸二氫鈉、碳酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L，121℃滅菌20 min。

YEPD液體培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，121℃滅菌20 min。

1.2儀器與設(shè)備

分光光度計(jì)UV-1600PC：上海美普達(dá)儀器有限公司；LC-210.2精密電子天平：德國(guó)賽多利斯股份有限公司；THZ-C-1全溫振蕩器：太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；SevenEasy plus pH儀：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；SIGMA3K-15臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國(guó)西格瑪公司；GLS3500全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)儀：上海天龍科技有限公司；S1000ThermalCycler PCR儀：美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌種活化與培養(yǎng)

將甘油管保藏菌種在YEPD固體培養(yǎng)基上劃線，25℃條件下培養(yǎng)36 h。提取單菌落，接種至YEPD液體培養(yǎng)基，25℃、150 r/min條件下，培養(yǎng)24 h，待用。

1.3.2菌株生長(zhǎng)特性的測(cè)定

按照2%的接種量把24株分別接種至YEPD液體培養(yǎng)基中，25℃、150 r/min條件下，培養(yǎng)10 h，測(cè)定光密度值OD600nm。

按照2%的接種量把24株分別接種至YEPD液體培養(yǎng)基中，25℃條件下，靜止培養(yǎng)24 h，觀察其表面產(chǎn)膜現(xiàn)象。

1.3.3粗酶液制備

將活化后的酵母分別按2%的接種量接入到裝液量為50mL/250mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃條件下，搖床150r/min，培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液于4℃、10 000 r/min條件下離心20 min，收集菌體，將菌體懸浮pH為5.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）中，利用超聲波破碎法破碎細(xì)胞（400 W，超聲5s，間歇5s，處理8min），離心（12000r、10min，4℃）收集上清液，即為待測(cè)粗酶液，測(cè)定粗酶液中β-葡糖苷酶的活性。

1.3.4β-葡糖苷酶活性的測(cè)定［18］

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別吸取1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL于試管中，用蒸餾水將每支試管加水到2.0 mL，再加1.5 mL DNS試劑，充分混合后在沸水中煮沸5 min，冷卻后用蒸餾水稀釋至25 mL，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)540nm，以0號(hào)試管為對(duì)照。以葡萄糖含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.005 3x-0.002 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。

取1.0 mL的粗酶液，加入1.0 mL 0.5%的水楊苷（溶于0.1mol/LpH5.0醋酸緩沖液中），60℃保溫1h后，加入1.5mL DNS試劑，充分混合在沸水中煮沸5 min，冷卻后用蒸餾水稀釋至25 mL，用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)吸光度值A(chǔ)540nm，以加熱滅活的酶液按照同樣方法處理作為空白。β-葡糖苷酶酶活定義：上述反應(yīng)條件下，每小時(shí)由底物產(chǎn)生1 μmol還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需酶量為一個(gè)酶活單位（U/mL）。

1.3.5低產(chǎn)β-葡糖苷酶菌的分子生物學(xué)鑒定

利用天根生物科技有限公司的酵母基因組提取試劑盒提取酵母總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）。具體提取步驟參照說(shuō)明書。

采用18S rDNA通用引物，正向引物18：5'-GTAGTCA TATGCTTGTCTC-3'；反向引物：5'-TCCGCAGGTTCACC TACGGA-3'。50μLPCR反應(yīng)體系為：10×Taqbuffer 5.0μL、2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）5.0 μL、上游引物（10 pmol/L）2.0 μL、下游引物（10 pmol/L）2.0 μL、2 U/LTaq酶0.5 μL、DNA模板1.0 μL、雙蒸水34.6 μL［19］。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性40 s，45℃退火40 s，72℃延伸40 s，體系運(yùn)行34個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生物工程有限公司測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中用局部序列比對(duì)基本檢索工具（basic local alignment search tool，BLAST）程序進(jìn)行同源序列分析。利用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析該菌株的親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育。

1.3.6分析檢測(cè)

（1）總糖測(cè)定

果酒總糖含量的測(cè)定采用蒽酮法，具體操作步驟參照文獻(xiàn)［20］。

（2）酒精度測(cè)定

取2支100 mL的容量瓶，分別準(zhǔn)確量取100 mL黑莓果酒和蒸餾水，將黑莓果酒導(dǎo)入500 mL的蒸餾瓶中，再用100 mL蒸餾水分3次沖洗量取黑莓果酒的容量瓶，并將100 mL蒸餾水全部加入蒸餾瓶中，加入適量玻璃珠。將其中一個(gè)100mL的容量瓶作為接收瓶，打開冷凝水和電熱套，進(jìn)行加熱蒸餾。當(dāng)接收瓶達(dá)到100 mL刻度線時(shí)，關(guān)閉電熱套，蒸餾結(jié)束。在規(guī)定的溫度條件下用酒精計(jì)測(cè)定酒精度。

（3）花色苷的測(cè)定

花色苷含量：黑莓果酒中花色苷含量的測(cè)定參考WROLSTAD T等［21］方法，直接取稀釋后的黑莓果酒進(jìn)行測(cè)定。取兩個(gè)l0 mL的容量瓶各加入1.0 mL稀釋后的黑莓果酒，分別用pH1.0的緩沖液（0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl= 25∶67（V/V））和pH 4.5的緩沖液（1 mol/L NaAc∶l mol/L HCl∶H2O=100∶60∶90（V/V）進(jìn)行定容，在冰箱中避光靜置2 h后，分別在波長(zhǎng)520 nm和700 nm條件下測(cè)定吸光度值A(chǔ)。花色苷含量按下式計(jì)算，結(jié)果以矢車菊-3-O-葡萄糖苷計(jì)。

花色苷含量（mg/L）=（A×MW×DF×1000）/（ε×1）

A=（A520nm-A700nm）pH1.0-（A520nm-A700nm）pH4.5；

式中：MW為矢車菊-3-O-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量449.2；DF為稀釋倍數(shù)10；ε為矢車菊-3-O-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)26 900；1為比色皿的光程長(zhǎng)度，cm。

1.3.7釀酒酵母FY4發(fā)酵黑莓果酒加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

黑莓果清洗：剔除壞果和爛果，利用流動(dòng)的清水將黑莓果清洗干凈，并瀝干水分。

打漿：將瀝干的黑莓果打漿，盡量打碎。

配料：根據(jù)黑莓果質(zhì)量，依次添加75 mg/L的偏重亞硫酸鉀、果膠酶、蔗糖，并充分?jǐn)嚢杈鶆颉?/p>

接種：添加不同含量菌種，并混勻。

發(fā)酵：將接種后的體系放置在不同溫度條件下靜止發(fā)酵。

過(guò)濾：當(dāng)殘?zhí)橇浚? g/L時(shí)，終止發(fā)酵，利用硅藻土進(jìn)行過(guò)濾。

澄清：向酒液中加入0.40～0.50 g/L的殼聚糖溶液，充分混勻，進(jìn)行澄清處理。

1.3.8黑莓果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

發(fā)酵溫度的影響：按照3%的接種量接入釀酒酵母FY4，蔗糖添加量為14%，果膠酶添加量為0.1%，分別于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃進(jìn)行恒溫發(fā)酵，當(dāng)殘?zhí)橇浚? g/L時(shí)結(jié)束發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵果酒的花色苷含量。

果膠酶的影響：按照3%的接種量接入釀酒酵母FY4，蔗糖添加量為14%，發(fā)酵溫度為30℃，果膠酶的添加量分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%，當(dāng)殘?zhí)橇浚? g/L時(shí)結(jié)束發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵果酒的花色苷含量。

接種量的影響：蔗糖添加量為14%，發(fā)酵溫度為30℃，果膠酶添加量為0.2%，分別接入2%、4%、6%、8%、10%（V/V）的活化后釀酒酵母FY4菌液，當(dāng)殘?zhí)橇浚? g/L時(shí)結(jié)束發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵果酒的花色苷含量。

加糖量的影響：按照2%的接種量接入釀酒酵母FY4，發(fā)酵溫度為30℃，果膠酶的添加量0.2%，蔗糖添加量12%、14%、16%、18%、20%的白砂糖，當(dāng)殘?zhí)橇浚? g/L時(shí)結(jié)束發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵果酒的花色苷含量。

1.3.9黑莓果酒發(fā)酵工藝的正交優(yōu)化

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)，確定發(fā)酵溫度、加糖量、果膠酶用量作為正交試驗(yàn)中的3個(gè)因素，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，以確定釀酒酵母FY4發(fā)酵黑莓果酒的最優(yōu)化條件，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.10數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 20.0進(jìn)行顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1低產(chǎn)β-葡糖苷酶菌株的篩選

本研究利用比色法測(cè)定了從自然發(fā)酵的黑莓、藍(lán)莓和葡萄酒中篩選到的24株酵母的β-葡糖苷酶的酶活性，同時(shí)考察了菌株的生長(zhǎng)能力和發(fā)酵液體表面的成膜情況，具體結(jié)果見表2。由表2可知，24株酵母的β-葡糖苷酶的酶活性差異很大，最大值為0.79 U/mL，最小值僅為0.08 U/mL，最大酶活性是最小酶活性的9.625倍。不同菌株的生長(zhǎng)能力也有很大差異。相同的生長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，最大OD600nm值為2.61，最小OD600nm值僅為1.75。不同的酵母在生長(zhǎng)的過(guò)程中會(huì)在液體表面成膜，利用這種酵母發(fā)酵果酒會(huì)影響果酒的品質(zhì)并給果酒的后期處理帶來(lái)不便，因此，綜合考慮酵母的β-葡糖苷酶活性、菌株的生長(zhǎng)能力和表面成膜現(xiàn)象，選擇酵母菌株FY4進(jìn)行黑莓果酒的發(fā)酵。

表2　菌株培養(yǎng)液中β-葡糖苷酶的活力及酵母FY4生長(zhǎng)特性Table 2 β-glucosidase activity and growth characteristics of yeast FY4 in cultured liquid

2.2酵母菌株FY4的系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)過(guò)測(cè)序獲得酵母菌株FY4的18S rDNA的序列，BLAST結(jié)果顯示，菌株FY4與Saccharomyces cerevisiae的同源性最高，同源性為100%。利用CLUATRAW和MEGA 5.1構(gòu)圖軟件將菌株FY4與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的酵母菌株進(jìn)行的序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。由圖1可知，酵母菌株FY4與S.cerevisiae（Z75578）、S.cerevisiae（AB278124）在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一支，表明該菌株與釀酒酵母最為相近，從而確定酵母菌株FY4屬于釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）。

圖1　酵母FY4的18S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of 18S rDNA of yeast FY4

2.3發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.3.1發(fā)酵溫度對(duì)黑莓果酒中花色苷含量的影響

花色苷提取的研究結(jié)果顯示，在低溫的條件下隨著提取溫度的升高，花色苷含量會(huì)增加，但隨著溫度的升高，花色苷含量會(huì)有降低的趨勢(shì)［8，22-23］。發(fā)酵溫度對(duì)黑莓果酒中花色苷含量的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，發(fā)酵溫度在15～30℃時(shí)，黑莓果酒花色苷含量隨發(fā)酵溫度的升高而增加；當(dāng)溫度為30℃時(shí)，花色苷含量達(dá)到最大值298.48 mg/L；發(fā)酵溫度＞30℃之后，花色苷含量增加不顯著。因此，選擇發(fā)酵溫度為30℃為黑莓果酒發(fā)酵的合適溫度。

圖2　發(fā)酵溫度對(duì)黑莓果酒花色苷含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the anthocyanin content in blackberry wine

2.3.2果膠酶添加量對(duì)黑莓果酒中花色苷含量的影響

圖3　果膠酶添加量對(duì)黑莓果酒花色苷含量的影響Fig.3 Effect of pectinase addition on the anthocyanin content in blackberry wine

在利用酶法或者超聲波輔助酶法提取花色苷的研究中，常會(huì)用到果膠酶和纖維素酶，研究結(jié)果顯示，隨著果膠酶的添加能夠增加花色苷的提取量，但是果膠酶量增加到一定的程度，對(duì)花色苷提取量的影響就不再明顯［24］。本研究固定果酒的發(fā)酵溫度和加糖量，考察不同果膠酶的添加量對(duì)果酒中花色苷的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，果膠酶添加量為0～0.20%時(shí)，黑莓果酒花色苷含量隨著果膠酶的添加量的增加而增加；在果膠酶添加量為0.20%時(shí)，黑莓果酒花色苷含量最高，為328.84 mg/L；但是當(dāng)果膠酶添加量＞0.20%時(shí)，果酒中的花色苷含量趨于穩(wěn)定。因此，在果酒的發(fā)酵過(guò)程中，果膠酶的適宜的添加量選擇0.20%。

2.3.3加糖量對(duì)黑莓果酒中花色苷含量的影響

體系中糖分含量及種類對(duì)花色苷的穩(wěn)定性有很大的影響，前人的研究結(jié)果顯示，體系中的糖能夠增加花色苷的穩(wěn)定性，且在低濃度的時(shí)候，隨著糖含量的增加，增加花色苷穩(wěn)定性的效果在增強(qiáng)，不同種類的糖對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響是不同的［9］。在固定發(fā)酵溫度和接種量的條件下，加糖量對(duì)黑莓果酒中花色苷含量的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，加糖量在黑莓果酒花色苷含量隨加糖量的升高而增加，當(dāng)加糖量為16%時(shí)，花色苷含量達(dá)到351.48 mg/L，繼續(xù)提高加糖量，花色苷含量逐漸減少?？梢娫诠频陌l(fā)酵過(guò)程中，加糖量為16%時(shí)黑莓果酒花色苷含量最高。

圖4　加糖量對(duì)黑莓果酒花色苷含量的影響Fig.4 Effect of sugar addition on the anthocyanin content in blackberry wine

2.3.4接種量對(duì)黑莓果酒中花色苷含量的影響

在果酒發(fā)酵過(guò)程中，接種量的大小對(duì)果酒的發(fā)酵周期和果酒的風(fēng)味有關(guān)，隨著接種的增大，將明顯縮短發(fā)酵時(shí)間，活化菌體接入發(fā)酵罐中，在發(fā)酵罐內(nèi)成為優(yōu)勢(shì)菌體，能夠減少和抑制雜菌的生長(zhǎng)，明顯減少發(fā)酵罐染菌的機(jī)會(huì)；若接種量過(guò)大，也會(huì)對(duì)黑莓果酒的發(fā)酵產(chǎn)生不利影響，果酒的口感較差［25］。接種量的大小對(duì)果酒中的花色苷含量的影響鮮見報(bào)道。本研究對(duì)接種量對(duì)黑莓果酒的花色苷的影響進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖5。由圖5可知，黑莓果酒中花色苷含量隨接種量的增加有降低的趨勢(shì)，在試驗(yàn)研究的接種量范圍內(nèi)，當(dāng)接種量為2%時(shí)，花色苷含量最高為335.37 mg/L；隨著接種量的增大，發(fā)酵的過(guò)程中酵母菌株FY4菌體密度增大，其果酒體系中β-葡糖苷酶活性提高，進(jìn)而導(dǎo)致色苷含量下降趨勢(shì)。當(dāng)接種量＜2%時(shí)，花色苷含量差異不明顯，考慮到發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)酵周期延長(zhǎng)，加大成本。因此，選擇接種量為2%。

圖5　接種量對(duì)黑莓果酒中花色苷含量的影響Fig.5 Effect of yeast inoculum on the anthocyanin content in blackberry wine

2.4黑莓果酒發(fā)酵工藝的正交優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)花色苷含量增加效果較明顯的3種因素（發(fā)酵溫度、果膠酶添加量、加糖量）進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以優(yōu)化黑莓果酒的最佳發(fā)酵條件，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析及方差分析結(jié)果分別見表3和表4。

表3　發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

表4　正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知，三個(gè)因素對(duì)黑莓果酒中的花色苷含量的影響大小依次為發(fā)酵溫度＞果膠酶添加量＞加糖量，最佳組合為A3B3C1，即發(fā)酵溫度為32℃，果膠酶添加量為0.22%，加糖量為14%。按照所得最優(yōu)試驗(yàn)條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵后黑莓果酒中的花色苷含量為（406.31±5.64）mg/L。同時(shí)利用商業(yè)釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）PHYTHM. nsac在相同的發(fā)酵條件下發(fā)酵黑莓果酒，果酒中的花色苷含量為（264.56±4.11）mg/L，可見利用酵母菌株FY4發(fā)酵黑莓果酒，可以明顯的提高果酒中的花色苷含量。

由表4可知，發(fā)酵溫度對(duì)黑莓果酒的花色苷含量的影響極顯著（P＜0.01），果膠酶的用量對(duì)結(jié)果的影響顯著（P＜0.05），加糖量對(duì)結(jié)果的影響不顯著（P＞0.05）。

3　結(jié)論

從來(lái)源于自然發(fā)酵的黑莓、藍(lán)莓、葡萄果酒中的23株酵母中篩選到1株β-葡糖苷酶活性較低的酵母FY4，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析該菌株鑒定為釀酒酵母。

通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定了酵母FY4發(fā)酵黑莓果酒的最佳工藝條件為接種量2%，發(fā)酵溫度32℃，加糖量14%，果膠酶添加量0.22%。在此最佳發(fā)酵條件下，黑莓果酒中的花色苷含量為（406.31±5.64）mg/L，是相同條件下利用商業(yè)釀酒酵母PHYTHM.nsac發(fā)酵的黑莓果酒中花色苷含量的1.53倍。

［1］FOLMER F，BASAVARAJU U，JASPARS M，et al.Anticancer effects of bioactive berry compounds［J］.Phytochem Rev，2014，13（1）：295-322.

［2］JOSEPH S V，EDIRISINGHE I，BURTON-FREEMAN B M.Berries：Antiinflamatoryeffects in humans［J］.J Agr Food Chem，2014，62：3886-3903.

［3］KRUGER M J，DAVIES N，MYBURGH K H，et al.Proanthocyanidins，anthocyanins and cardiovascular diseases［J］.Food Res Int，2014，59：41-52.

［4］DAI J，GUPTE A，GAGES L，et al.A comprehensive study of anthocyanin-containing extracts from selected blackberry cultivars：extraction methods，stability，anticancerpropertiesand mechanism［J］.Food Chemical Toxicol，2009，47（4）：837-847.

［5］易龍，陳春燥，金鑫，等.花色苷類植物化學(xué)物抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷作用的結(jié)構(gòu)-效應(yīng)關(guān)系研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31（21）：2046-2049.

［6］DIAS A L S，ROZET E，CHATAIGNé G，et al.A rapid validated UHPLC-PDA method for anthocyanins quantification fromEuterpe oleracea fruits［J］.J Chromatogr B，2012，907：108-116.

［7］盧鋒波，劉桂玲，王爍，等.響應(yīng)面法優(yōu)化果膠酶酶解提取黑莓花色苷的工藝參數(shù)［J］.食品科學(xué)2010，31（16）：11-15.

［8］姚蓓，趙慧芳，吳文龍，等.藍(lán)莓果實(shí)花色苷色素提取工藝研究［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，27（9）：109-113.

［9］任二芳，李昌寶，孫健，等.金屬離子和食品添加劑對(duì)桑果花色苷穩(wěn)定性的影響［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，45（1）：98-103.

［10］趙昶靈，李云，陳中堅(jiān)，等.花色苷的酶降解［J］.熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2011，19（6）：576-584.

［11］趙玉紅，賈琳娜，趙鐵楠，等.黑加侖果汁中花色苷的貯存穩(wěn)定性［J］.食品科學(xué)，2014，35（20）：301-306.

［12］SHARMA R J，GUPTA R C，SINGH S，et al.Stability of anthocyanins-and anthocyanidins-enriched extracts，and formulations of fruit pulp ofEugenia jambolana（'jamun'）［J］.Food Chem，2016，190（1）：808-817.

［13］張麗霞.黑莓花色苷降解與輔色及抗氧化活性研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［14］REIN M J，HEINONEN M.Stability and enhancement of berry juice color［J］.J Arg Food Chem，2004，52（10）：3106-3114.

［15］侯曉瑞，王婧，楊學(xué)山，等.甘肅河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株篩選［J］.食品科學(xué)，2014，35（23）：139-143.

［16］王云，曾沃坦.黑曲霉Aspergillus nigerS菌株所產(chǎn)β-葡糖苷酶的純化和酶學(xué)性質(zhì)［J］.中國(guó)科學(xué)院研究生院學(xué)報(bào)，2009，26（2）：274-279.［17］郭慧女.β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)菌的選育及其對(duì)葡萄酒中結(jié)合態(tài)香氣的影響［D］.無(wú)錫：江南大學(xué)，2010.

［18］SHOEMAKER S P，BROWN R D.Characterization of endo-1，4-beta-D-glucanases purified fromTrichoderma viride［J］.Biochim Biophys Acta，1978，523（1）：147-161.

［19］MARIA R C，MARCOS E C，ANTONIL L G，et al.Evaluation of a rapid DNA extraction method to detect yeast cells by PCR in orange juice［J］. Food Control，2007，18（1）：33-39.

［20］王憲澤.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理和方法［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002：77-80.

［21］BFNTSIS T，ROBINSON R K.A study of adjunct cultures on the aroma compounds of feta-type cheese［J］.Food Chem，2004，88（3）：435-441.

［22］程佑聲，王鴻飛，許鳳，等.藍(lán)莓皮渣花色苷提取及抗氧化活性的研究［J］.果樹學(xué)報(bào)，2015，32（4）：696-704.

［23］孟憲軍，王冠群，宋德群，等.向應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓花色苷提取工藝的研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31（7）：226-229.

［24］趙玉紅，苗雨，張立鋼.雙酶法提取藍(lán)靛果果渣中花色苷酶解條件的研究［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2008，8（4）：75-79.

［25］楊艷彬，童軍茂，張宏剛，等.香梨發(fā)酵飲料［J］.冷飲與速凍食品工業(yè)，2000，7（3）：24-26.

Screening of yeast with low β-glucosidase activity and its application in the blackberry wine fermentation

WANG Ying，ZHOU Jianzhong，HU Yanxin，LIANG Hongyun，XIA Xiudong，HUANG Zisu
（Institute Agro-Product Processing，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China）

A yeast FY4 with low β-glucosidase activity，fast growth and no-membrane-producing was screened from 23 yeast strains preserved in the laboratory and derived from the natural fermented fruit wine.The yeast FY4 was identified asSaccharomyces cerevisiaeby 18S rDNA sequencing analysis.The blackberry wine was fermented byS.cerevisiae.The effects of fermentation temperature，pectinase addition，sugar addition and yeast inoculum on the anthocyanin content in blackberry wine were researched by single factor and orthogonal experiments.In the conditions of yeast FY4 inoculum 2%，fermentation temperature 32℃，sugar 14%，pectinase 0.22%，the anthocyanin content in blackberry wine after fermentation was up to（406.31±5.64）mg/L，which was 1.53 times of blackberry wine fermented by commercialS.cerevisiaePHYTHM.nsac at the same conditions.

β-glucosidase；Saccharomyces cerevisiae；identification；anthocyanin；blackberry wine

Q939.97

0254-5071（2016）07-0102-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.022

2016-03-25

江蘇省科技支撐計(jì)劃（BE2014302）

王英（1978-）女，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。