紫色紅曲霉FBKL3.0018液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶的研究

任佳明，李付麗，吳鑫穎，邱樹毅，周羅娜

紫色紅曲霉FBKL3.0018液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶的研究

任佳明1，2，李付麗1，2，吳鑫穎1，2*，邱樹毅1，2，周羅娜1，2

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)試驗(yàn)室，貴州 貴陽 5500251；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

以從中溫大曲中篩選獲得的紫色紅曲霉FBKL3.0018為研究對(duì)象，并對(duì)該菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)確定此菌株優(yōu)化后的液態(tài)發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組成為5%麥芽糖、2%牛肉膏、0.04%硫酸鎂，最高酶活力達(dá)到116.32 U/mL，較培養(yǎng)基優(yōu)化前提高45%；最佳培養(yǎng)條件為接種量10%、培養(yǎng)溫度32℃、培養(yǎng)時(shí)間5 d、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，最高酶活力達(dá)到153.34 U/mL，較培養(yǎng)條件優(yōu)化前提高32%。

紫色紅曲霉；酯化酶；液態(tài)發(fā)酵；工藝優(yōu)化

酯化酶又稱酯酶，其功能與脂肪酶相似，都能催化酯鍵的水解和合成。酯化酶常用于傳統(tǒng)食品的微生物發(fā)酵生產(chǎn)及食品風(fēng)味的改良等方面，其中尤以白酒釀造過程中的應(yīng)用研究最多。在白酒釀造中，酯化酶增香技術(shù)常用來合成己酸乙酯為主的香味成分，在生產(chǎn)中用于調(diào)整傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝和調(diào)味酒的生產(chǎn)［1］。酯是構(gòu)成白酒香味的主要成分之一，是在白酒釀造過程中由產(chǎn)酯化酶的微生物產(chǎn)生。所以，從白酒生產(chǎn)中篩選高產(chǎn)酯化酶的微生物并強(qiáng)化其產(chǎn)酯效果，對(duì)白酒尤其是濃香型白酒的增香提質(zhì)具有非常重要的意義。

目前常見的產(chǎn)酯化酶菌株是根霉、紅曲霉及酵母［2-5］。VANOT G等［6］對(duì)圓弧青霉（Penicillium cyclopium）產(chǎn)脂肪酶的3個(gè)主要因素（玉米漿濃度、pH和接種量）進(jìn)行了考察和優(yōu)化，獲得了較好的優(yōu)化結(jié)果。ABDEL-FATTAHYR等［7］研究了橄欖油、pH、吐溫-80和培養(yǎng)溫度對(duì)土芽孢桿菌屬（Geobacillussp.）產(chǎn)嗜熱脂肪酶的影響，優(yōu)化后酶活力比原始培養(yǎng)條件有很大提高。BURKERT J F M等［8］研究了葡萄糖、玉米漿、NH4NO3和油脂對(duì)Geobacillussp.產(chǎn)脂肪酶的影響，也取得了很好的結(jié)果。

本研究從濃香型白酒釀造的中溫大曲中篩選出一株高產(chǎn)酯化酶的菌株（紫色紅曲霉FBKL3.0018），以此菌株為研究對(duì)象，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，通過單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化其產(chǎn)酶條件。為下一步酯化酶催化合成酯以及白酒釀造過程中產(chǎn)香菌株的強(qiáng)化，濃香型白酒生產(chǎn)過程中產(chǎn)酯產(chǎn)香和黃水的回收利用等方面奠定良好的研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

紫色紅曲霉FBKL3.0018：貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)試驗(yàn)室篩選并保藏。

菌種保藏培養(yǎng)基（麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基）：麥芽膏粉13%，瓊脂1.5%，氯霉素0.01%，pH 6.0；種子培養(yǎng)基：葡萄糖5%，蛋白胨1.5%，NaNO30.2%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH 5.5；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5%，蛋白胨2%，NaNO30.2%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH 5.5。

硝酸鈉、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、醋酸-α-萘酯、α-萘酚聚乙烯醇、固蘭B鹽、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、牛肉膏、硫酸銨、硝酸銨、尿素、硫酸亞鐵、氯化鈣、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

UV2550紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；MJX-250B-Z霉菌培養(yǎng)箱、BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JJ-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；DK-98-11電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；XW-80A旋渦混合儀：海門市杜琪貝爾儀器制造有限公司；BCD-215DK冰箱：青島海爾股份有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1粗酶液的制備

試管斜面活化培養(yǎng)：取1環(huán)紫色紅曲霉FBKL3.0018接種于麥芽汁瓊脂斜面，32℃恒溫培養(yǎng)6 d。

孢子懸浮液制備：向活化菌種的斜面中加入15 mL無菌水，用接種環(huán)輕輕刮洗，倒入已滅菌裝有玻璃珠的三角瓶中，用玻璃珠將孢子充分打散，制成106～107個(gè)/mL的孢子懸浮液，備用。

搖瓶培養(yǎng)：按8%的接種量在裝有50 mL培養(yǎng)基（種子培養(yǎng)基∶基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基=1∶1）的250 mL三角瓶中接入孢子懸浮液，32℃、150 r/min條件下培養(yǎng)72 h。

粗酶液的制備：培養(yǎng)結(jié)束后，用4層紗布過濾分離菌絲體和發(fā)酵液，濾液在4℃、3 500 r/min條件下離心15 min，收集上清液，獲得粗酶液。

1.3.2培養(yǎng)基優(yōu)化

碳源種類對(duì)產(chǎn)酶的影響：分別用5%葡萄糖（對(duì)照）、可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、乳糖作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，其他成分不變，按照1.3.1的方法進(jìn)行培養(yǎng)，考察碳源種類對(duì)菌株酯化酶活力的影響。

碳源含量對(duì)產(chǎn)酶的影響：分別調(diào)節(jié)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源含量為3%、5%、7%、9%、11%，其他成分不變，按照1.3.1的方法進(jìn)行培養(yǎng)，考察碳源含量對(duì)菌株酯化酶活力的影響。

氮源種類對(duì)產(chǎn)酶的影響：分別用2%蛋白胨（對(duì)照）、酵母粉、牛肉膏、尿素、硝酸銨、硫酸銨作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，其他成分不變，按照1.3.1的方法進(jìn)行培養(yǎng)，考察氮源種類對(duì)菌株酯化酶活力的影響。

氮源含量對(duì)產(chǎn)酶的影響：分別調(diào)節(jié)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源含量為2%、4%、6%、8%、10%，其他成分不變，按照1.3.1的方法進(jìn)行培養(yǎng)，考察氮源含量對(duì)菌株酯化酶活力的影響。

硫酸鎂含量對(duì)產(chǎn)酶的影響：分別調(diào)節(jié)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的硫酸鎂含量為0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%，其他成分不變，按照1.3.1的方法進(jìn)行培養(yǎng)，考察硫酸鎂含量對(duì)菌株酯化酶活力的影響。

在單因素研究基礎(chǔ)上，選擇麥芽糖含量、牛肉膏含量、硫酸鎂含量3個(gè)因素，以酯化酶活力為考察指標(biāo)設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for culture medium formula optimization

1.3.3培養(yǎng)條件優(yōu)化

接種量的確定：選擇5%、10%、15%、20%的接種量，在32℃、160 r/min的條件下進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)3 d，考察接種量對(duì)菌株酯化酶活力的影響。

溫度的確定：文獻(xiàn)報(bào)道的紫色紅曲霉產(chǎn)酶最佳范圍溫度多為25～37℃，本試驗(yàn)選擇26℃、29℃、32℃、35℃的不同培養(yǎng)溫度，在接種量為10%、160 r/min的條件下進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)3 d，考察溫度對(duì)菌株酯化酶活力的影響。

轉(zhuǎn)速的確定：選擇120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min的搖床轉(zhuǎn)速，在32℃、接種量為10%的條件下進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)3 d，考察轉(zhuǎn)速對(duì)菌株酯化酶活力的影響。

培養(yǎng)時(shí)間的確定：選擇培養(yǎng)時(shí)間為1 d、3 d、5 d、7 d，在32℃、160 r/min、接種量為10%的條件下進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，考察培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株酯化酶活力的影響。

在單因素研究基礎(chǔ)上，選擇接種量、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間4個(gè)因素，以酯化酶活力為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素與水平見表2。

表2　培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for culture conditions optimization

1.3.4酶活力測(cè)定

酶活的定義：40℃條件下反應(yīng)5 min，單位酯化酶每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1.0 μmolα-萘酚，定義為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

酶活的測(cè)定方法：按照參考文獻(xiàn)［9］的方法進(jìn)行。

2　結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1碳源種類對(duì)酯化酶活力的影響

圖1　碳源種類對(duì)酯化酶活力的影響Fig.1 Effect of carbon sources type on esterification enzyme activity

從圖1可以看出，在5種碳源中，紫色紅曲霉在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中產(chǎn)酯化酶的酶活力最高，其次是葡萄糖和淀粉，乳糖最低，這與參考文獻(xiàn)［10-16］中紅曲霉喜麥芽糖的結(jié)論相符。因此選擇麥芽糖為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2麥芽糖含量對(duì)酯化酶活力的影響

圖2　麥芽糖含量對(duì)酯化酶活力的影響Fig.2 Effect of maltose contents on esterification enzyme activity

從圖2可以看出，紫色紅曲霉在麥芽糖含量為5%的培養(yǎng)基中產(chǎn)酯化酶的酶活力最高，當(dāng)碳源濃度繼續(xù)升高時(shí)，酯化酶活力反而大幅度下降。說明碳源濃度過大，易產(chǎn)生抑制效應(yīng)，抑制酯化酶的合成。適宜的碳源濃度利于微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，碳源供應(yīng)不足時(shí)，影響菌體生長(zhǎng)速度，并在培養(yǎng)后期易引起菌體衰老和自溶，對(duì)酶合成不利。因此選擇麥芽糖含量為5%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3氮源種類對(duì)酯化酶活力的影響

從圖3可以看出，在5種氮源中，紫色紅曲霉在以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基中產(chǎn)酯化酶的酶活力最高，其次是硫酸銨，其他幾種氮源的效果相差不大。這可能是因?yàn)榕Ｈ飧嗪杏欣诰w生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。因此選擇牛肉膏作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3　氮源種類對(duì)酯化酶活力的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources type on esterification enzyme activity

2.1.4牛肉膏含量對(duì)酯化酶活力的影響

圖4　牛肉膏含量對(duì)酯化酶活力的影響Fig.4 Effect of beef extract contents on esterification enzyme activity

從圖4可以看出，紫色紅曲霉在牛肉膏含量為2%的培養(yǎng)基中產(chǎn)酯化酶的酶活力最高。氮源濃度過高導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)過于旺盛，造成不合適的碳氮比，不利于產(chǎn)酶，氮源濃度過低，不利于微生物的生長(zhǎng)繁殖。因此選擇牛肉膏含量為2%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.5硫酸鎂含量對(duì)酯化酶活力的影響

圖5　硫酸鎂含量對(duì)酯化酶活力的影響Fig.5 Effect of MgSO4contents on esterification enzyme activity

從圖5可以看出，當(dāng)硫酸鎂含量為0.05%時(shí)，紫色紅曲霉產(chǎn)酯化酶酶活力最高，隨著硫酸鎂的含量增高，酯化酶酶活力略有所降低，但均高于不添加硫酸鎂時(shí)的產(chǎn)酶量。因此選擇硫酸鎂含量為0.05%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.6培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)

表3　培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for medium formula optimization

由表3可以得出，該紫色紅曲霉菌株液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為A2B2C1，即麥芽糖含量5%，牛肉膏含量2%，硫酸鎂含量0.04%。該試驗(yàn)組在正交表中未出現(xiàn)，所以進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。其平均酯化酶酶活力為116.32 U/mL，比培養(yǎng)基優(yōu)化前的酶活力提高45%。

2.2培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1接種量對(duì)酯化酶活力的影響

圖6　接種量對(duì)酯化酶活力的影響Fig.6 Effect of inoculum on esterification enzyme activity

從圖6可以看出，當(dāng)紫色紅曲霉接種量為10%時(shí)，酯化酶酶活力最高。如果接種量過低，菌株易老化，影響產(chǎn)酶；但接種量過高，會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，菌絲結(jié)團(tuán)過多影響溶氧等，也會(huì)影響其產(chǎn)酶能力。合適的接種量有利于孢子的萌發(fā)，菌絲體的生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合理利用及產(chǎn)物的積累。故選擇10%的接種量為較佳接種量。

2.2.2培養(yǎng)溫度對(duì)酯化酶活力的影響

圖7　培養(yǎng)溫度對(duì)酯化酶活力的影響Fig.7 Effect of culture temperature on esterification enzyme activity

從圖7可以看出，培養(yǎng)溫度較低時(shí)，紫色紅曲霉生長(zhǎng)速度緩慢，酯化酶酶活力較小；當(dāng)培養(yǎng)溫度為29℃時(shí)，酯化酶酶活力最高；隨著培養(yǎng)溫度繼續(xù)提高，酶活力逐漸減小。故選擇29℃為較佳培養(yǎng)溫度。

2.2.3搖床轉(zhuǎn)速對(duì)酯化酶活力的影響

圖8　搖床轉(zhuǎn)速對(duì)酯化酶活力的影響Fig.8 Effect of shaker speed on esterification enzyme activity

從圖8可以看出，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增大，紫色紅曲霉產(chǎn)酯化酶的酶活力先增加后降低。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí)，酯化酶活力最高。一方面，轉(zhuǎn)速的大小決定了培養(yǎng)液中菌絲球所受機(jī)械力的大小；另一方面，轉(zhuǎn)速與培養(yǎng)體系的溶氧狀況有關(guān)，適宜的溶氧濃度有利于菌株生長(zhǎng)代謝。當(dāng)培養(yǎng)液中溶氧量不能滿足菌體要求時(shí)，則會(huì)使代謝途徑的方向受到影響，影響產(chǎn)物的正常合成。故選擇160 r/min為較佳搖床轉(zhuǎn)速。

2.2.4培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酯化酶活力的影響

圖9　培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酯化酶活力的影響Fig.9 Effect of culture time on esterification enzyme activity

從圖9可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，紫色紅曲霉產(chǎn)酯化酶的酶活力逐漸增大。培養(yǎng)1 d時(shí)，酶活較低，這是因?yàn)榘l(fā)酵前期，孢子萌發(fā)，菌絲體形成，生長(zhǎng)速度較慢，則產(chǎn)酶較少。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活逐漸增大。當(dāng)培養(yǎng)到第5 d時(shí)，酯化酶酶活力達(dá)到最大，為120 U/mL。當(dāng)繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，酯化酶活力稍有下降趨勢(shì)，這是由于隨著發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，菌體衰老甚至自溶，進(jìn)而影響產(chǎn)酶。故選擇5 d為較佳培養(yǎng)時(shí)間。

2.2.5培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

表4　培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for culture conditions optimization

由表6可以得出，該紫色紅曲霉菌株最優(yōu)液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件為A2B3C2D2，即接種量10%，培養(yǎng)溫度32℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)時(shí)間為5 d。由于最優(yōu)試驗(yàn)組合未在表中出現(xiàn)，因此進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，其平均酯化酶酶活力為153.34 U/mL，比培養(yǎng)條件優(yōu)化前酶活力提高了32%。

3　結(jié)論

對(duì)紫色紅曲霉菌株FBKL3.0018進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶條件的優(yōu)化。結(jié)果得出該紫色紅曲霉菌株液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為麥芽糖5%，牛肉膏2%，硫酸鎂0.05%，酶活力達(dá)到116.32 U/mL，較培養(yǎng)基優(yōu)化前提高了45%；該紫色紅曲霉菌株最優(yōu)液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件為接種量10%，培養(yǎng)溫度32℃，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，培養(yǎng)時(shí)間為5d，酶活力達(dá)到153.34U/mL，較培養(yǎng)條件優(yōu)化前提高32%。

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Esterification enzyme production by submerged fermentation fromMonmascus purpureusFBKL3.0018

REN Jiaming1，2，LI Fuli1，2，WU Xinying1，2*，QIU Shuyi1，2，ZHOU Luona1，2
（1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Using theMonascus purpureusFBKL3.0018 screened from medium temperature Daqu as research object，the esterification enzyme-producing technology conditions of submerged fermentation were optimized.By single factor experiments and orthogonal experiments，the optimum components of culture medium were determined as maltose 5%，beef extract 2%and MgSO40.04%，and the highest enzyme activity was up to 116.32 U/ml，which was 45%higher than that of before optimization.The optimum culture conditions were inoculum 10%，culture temperature 32℃，time 5 d and shaker speed 160 r/min，and the highest enzyme activity was up to 153.34 U/ml，which was 32%higher than that of before optimization.

Monascus purpureus；esterification enzyme；submerged fermentation；technology optimization

TQ920.6

0254-5071（2016）07-0069-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.015

2016-02-20

黔科合LH字［2014］7675

任佳明（1992-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槊腹こ獭?/p>

吳鑫穎（1975-），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槊腹こ獭?/p>