不同熏醅工藝條件對老陳醋中川芎嗪與丙烯酰胺含量的影響

李弘文，李曉慧，趙文良，楊小蘭

不同熏醅工藝條件對老陳醋中川芎嗪與丙烯酰胺含量的影響

李弘文，李曉慧，趙文良，楊小蘭*

（山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

研究了不同熏醅工藝（蒸汽熏醅及炭火熏醅）及不同參數(shù)（溫度、時間）對醋醅熏制過程中川芎嗪和丙烯酰胺生成量的影響。結(jié)果表明，蒸汽熏醅比炭火熏醅能加快美拉德反應(yīng)的速率；熏醅過程中生成的川芎嗪和丙烯酰胺生成量隨著熏醅溫度升高和時間延長而增加，但丙烯酰胺比川芎嗪需要更高的熏醅溫度（100℃以上）才會生成；無論是蒸汽熏醅還是炭火熏醅，90℃熏醅至5 d均未檢出丙烯酰胺，表明低溫熏醅（90℃以下）有利于避免丙烯酰胺的生成，在低溫熏醅的前提下，蒸汽熏醅比炭火熏醅既能避免丙烯酰胺的生成，又能顯著提高川芎嗪的生成量和褐色度，因此低溫蒸汽熏醅工藝更值得提倡推廣。

蒸汽熏醅；炭火熏醅；川芎嗪；丙烯酰胺；高效液相色譜法

在我國，食醋的釀造工藝已有3 000多年的歷史［1］，其已成為人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢扇鄙俸吞娲恼{(diào)味品。老陳醋產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19777—2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品 山西老陳醋》［2］中新增加了川芎嗪指標(biāo)，其作為保健功能成分，越來越受到人們的重視。川芎嗪又名四甲基吡嗪，不僅具有烘烤香氣［3］，而且能治療血瘀癥、防治糖尿病，具有抗血栓、抗氧化、抗輻射、降壓［4-6］等功能。川芎嗪在老陳醋熏醅階段能大量產(chǎn)生［7-8］。此外，老陳醋的主要原料有高粱、豌豆和大麥等，其含有豐富的碳水化合物和蛋白質(zhì)，這些物質(zhì)在熏醅加熱時不僅能產(chǎn)生川芎嗪，還可能會產(chǎn)生丙烯酰胺［6］，丙烯酰胺在1994年被國際癌癥機構(gòu)（international agency for research on cancer，IARC）歸類為可疑的人類致癌物［4］，關(guān)于食醋中丙烯酰胺含量的研究少見報道。熏醅是釀醋過程中的一道重要工序［9］，傳統(tǒng)的熏醅工藝是以地炕炭火80～90℃加熱，每天依次人工倒缸翻醅，熏至5 d后出缸淋醋，但此工藝生產(chǎn)周期長，勞動強度大，而且明火熏醅會造成環(huán)境污染及安全隱患。因而近年來出現(xiàn)了新型的蒸汽熏醅工藝，該技術(shù)采用大型旋轉(zhuǎn)式不銹鋼夾層蒸汽熏醅罐，通過罐的旋轉(zhuǎn)翻醅代替人工翻醅，不僅明顯縮短熏醅時間、減少人力，而且有效地避免了使用明火的危險及污染問題。但此技術(shù)尚不成熟，確定工藝條件成為亟待解決的問題［10］。因此，本研究對不同熏醅工藝（蒸汽熏醅、炭火熏醅）及不同工藝條件（溫度、時間）熏制醋醅過程中川芎嗪和丙烯酰胺的生成量進行了分析，為探索熏醅最佳的生產(chǎn)工藝條件提供理論依據(jù)，具有重要的現(xiàn)實意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

老陳醋熏醅樣品：未熏醅（醋酸發(fā)酵成熟的醋醅）、炭火熏醅（90℃熏制1～5 d）、蒸汽熏醅（90℃熏制1～3 d，100℃熏制24 h，120℃熏制6～24 h），醋醅和熏醅設(shè)備均由山西某醋業(yè)公司提供。

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品、鹽酸川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)品（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、三氯甲烷（色譜級）：美國Fisher Scientific公司；純凈水：市售；濃鹽酸、磷酸二氫銨、氫氧化鈉等（均為分析純）：太原市瑞佳科學(xué)器材有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）（配有1525系列雙泵系統(tǒng)、2487雙波長UV檢測器、Breeze軟件操作系統(tǒng)）：美國Waters公司；Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱：上海康華生儀器制造廠；UV-2800AH紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；Oasis HLB固相萃取柱（6cc，200 mg）：濟南博納生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1熏醅中川芎嗪的提取與含量測定

準(zhǔn)確稱取一定量熏醅，按料液比1∶20（g∶mL）加入蒸餾水，60℃加熱超聲40 min輔助提取川芎嗪，4 000 r/min離心30 min后得到的上清液為川芎嗪提取液。準(zhǔn)確量取10.00 mL待測樣品的川芎嗪提取液，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH＞8，移入分液漏斗中，分3次加入三氯甲烷，每次5 mL，充分混勻靜置分層，收集合并三氯甲烷層。以0.2 mol/L鹽酸分兩次萃取三氯甲烷中的川芎嗪，每次4.5 mL，收集合并水相，用蒸餾水定容至10.00 mL。

參考國標(biāo)GB/T 19777—2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品山西老陳醋》［2］中HPLC法并稍作改動，平行測定3次，取平均值。

川芎嗪含量計算公式如下：

式中：X為熏醅樣品中川芎嗪的含量，μg/g醅；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的樣液中川芎嗪的質(zhì)量濃度，μg/mL；v1為分析所取試樣的體積，mL；v2為溶解樣品的溶液的體積，mL；v3為試樣最終定容體積，mL；m為熏醅樣品的質(zhì)量，g。

色譜條件：色譜柱Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.2 mmol/L磷酸二氫銨∶甲醇（60∶40，V/V）；流速0.4 mL/min；檢測波長279 nm；柱溫為室溫；進樣量10 μL。

1.3.2熏醅中丙烯酰胺的提取與含量測定

準(zhǔn)確稱取一定量熏醅，按料液比1∶20（g∶mL）加入蒸餾水室溫提取丙烯酰胺，4 000 r/min離心30 min后得到上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾后，再經(jīng)Oasis HLB固相萃取柱（使用前用5 mL甲醇和5 mL水活化）萃取富集丙烯酰胺，收集水洗脫液，即為丙烯酰胺提取液。

丙烯酰胺的測定采用HPLC法。結(jié)果以丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，平行測定3次，取平均值，計算公式同1.3.1，以（μg/g醅）表示。色譜條件：色譜柱Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶超純水（10∶90，V/V）；流速0.4 mL/min；檢測波長238 nm；柱溫為室溫；進樣量10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.1 mg），以蒸餾水定容至100 mL，配成0.1 mg/mL丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)液。分別以蒸餾水稀釋配制成0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL和10.0 μg/mL，利用HPLC法測定，以峰面積-丙烯酰胺質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3熏醅褐色度測定

以1.3.2方法制得熏醅水提液，使用紫外-可見分光光度計在波長420 nm處測定各熏醅水提液吸光度值，得到熏醅樣品褐色度以AU值表示。

1.3.3相關(guān)性分析

用SPSS 17.0數(shù)據(jù)分析軟件對熏醅提取液的川芎嗪、丙烯酰胺與褐色度進行相關(guān)性分析，在0.01水平上進行顯著性檢驗。

2　結(jié)果與分析

2.1老陳醋熏醅中川芎嗪與丙烯酰胺的高效液相色譜測定

圖1　川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)品（A）及樣品（B）的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of ligustrazine standard（A）and sample（B）

由圖1可知，川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)品在1.3.1色譜條件下測定，峰型較好，保留時間為15.33 min（見圖1A）；老陳醋熏醅樣品按照本實驗方法（1.3.1）進行提取及色譜測定，川芎嗪的分離度良好，保留時間為15.33 min（見圖1B），日內(nèi)和日間精密度分別是2.03%和4.25%，表明儀器和方法的精密度都較好，樣品加標(biāo)回收率范圍為96.95%～103.72%，表明方法的重現(xiàn)性良好。說明本研究采用的熏醅樣品提取處理及HPLC測定川芎嗪的方法較為合理。

圖2　丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（A）及樣品（B）的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of acrylamide standard（A）and sample（B）

采用HPLC法對丙烯酰胺測定結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品在1.3.2色譜條件下測定，峰型良好，保留時間為10.13 min（見圖2A）；熏醅樣品水提液在相同色譜條件下測定，雜峰較少，丙烯酰胺分離度較好（見圖2B），日內(nèi)和日間精密度分別為2.41%和4.85%，表明儀器和方法的精密度均較好，樣品加標(biāo)回收率范圍為95.19%～105.85%，表明測定方法的重現(xiàn)性良好。說明本實驗采用的樣品提取處理及HPLC測定丙烯酰胺的方法較為合理。

2.2不同熏醅工藝條件對老陳醋褐色度、川芎嗪和丙烯酰胺含量的影響

褐色度能間接反映老陳醋熏醅中美拉德反應(yīng)的程度及類黑精的生成量［11-12］，據(jù)研究［13-14］報道，溫度每提高10℃可使美拉德反應(yīng)的速率提高3～5倍。不同熏醅工藝條件下老陳醋褐色度、川芎嗪和丙烯酰胺的測定結(jié)果見表1。由表1可知，無論炭火熏醅還是蒸汽熏醅，延長熏醅時間（1～5 d）或提高熏醅溫度（90～120℃），老陳醋褐色度均隨之逐漸增大（0.12～0.41 AU，0.16～1.08 AU），表明提高熏醅溫度或延長時間加劇了其美拉德反應(yīng)的程度，同時蒸汽熏醅比炭火熏醅加快了美拉德反應(yīng)的速率，如在熏醅溫度（90℃）和時間相同（1～3 d）的條件下，蒸汽熏醅褐色度（0.16～0.54 AU）比炭火熏醅（0.12～0.13 AU）提高了33.33%～315.38%。

表1　不同熏醅工藝條件下老陳醋褐色度、川芎嗪和丙烯酰胺含量的測定結(jié)果Table 1 Determination results of brown degree，ligustrazine and acrylamide content of Shanxi aged vinegar with different fumigation conditions

XU Y等［15-16］的研究認(rèn)為，熱加工食品中的川芎嗪及丙烯酰胺均主要來源于美拉德反應(yīng)。本研究采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)分析軟件對不同熏醅工藝及條件的熏醅褐色度、川芎嗪和丙烯酰胺含量（表1）進行了相關(guān)性檢驗，結(jié)果顯示，川芎嗪、和丙烯酰胺含量與褐色度呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為0.876和0.885，P＜0.01），此結(jié)果證實了在老陳醋熏醅過程中生成的川芎嗪與丙烯酰胺均是美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。表1測定結(jié)果顯示，在蒸汽熏醅24 h時，隨著熏醅溫度的提高（90℃、100℃、120℃），川芎嗪含量隨之增加為45.14 μg/g醅、79.02 μg/g醅和148.05 μg/g醅，丙烯酰胺含量為0、0.47 μg/g醅、1.54 μg/g醅；在蒸汽熏醅120℃時，隨著熏醅時間的延長（6 h、12 h、24 h），川芎嗪含量隨之增加為98.66 μg/g醅、106.22 μg/g醅、148.05 μg/g醅，丙烯酰胺含量隨之增加為0.70 μg/g醅、0.75 μg/g醅和1.54 μg/g醅。表明老陳醋的川芎嗪與丙烯酰胺生成量隨著熏醅中美拉德反應(yīng)程度的加劇而逐漸增加。相關(guān)性檢驗結(jié)果表明，在老陳醋熏醅過程中，川芎嗪與丙烯酰胺這二者的生成量呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.982，P＜0.01），只是丙烯酰胺比川芎嗪需要更高的美拉德反應(yīng)溫度才會生成。如表1結(jié)果顯示，無論炭火熏醅還是蒸汽熏醅，在熏醅溫度90℃，熏至5 d的醋醅中仍未檢出丙烯酰胺，而在100℃以上熏醅中丙烯酰胺才有生成，這與加拿大衛(wèi)生部［17-18］的報道相一致，其研究是將還原糖和天冬酰胺加熱至100℃以上時發(fā)現(xiàn)有丙烯酰胺生成。另外，在低溫90℃分別熏醅1 d、2 d和3 d，蒸汽熏醅的川芎嗪含量（45.14 μg/g醅、57.58 μg/g醅、70.74 μg/g醅）均顯著高于炭火熏醅的川芎嗪含量（37.54 μg/g醅、39.40 μg/g醅、41.20 μg/g醅），其原因可能與炭火熏醅工藝每日翻醅會造成醅料內(nèi)部的溫度不穩(wěn)定，并且導(dǎo)致川芎嗪等成分的揮發(fā)逸散等因素有關(guān)。研究結(jié)果表明，傳統(tǒng)的低溫熏醅（90℃）有利于避免丙烯酰胺這一有害物質(zhì)的生成，在低溫熏醅的前提下，蒸汽熏醅比炭火熏醅既避免了丙烯酰胺的生成，又顯著提高了川芎嗪的生成量，所以，低溫蒸汽熏醅工藝更值得提倡推廣。

3　結(jié)論

（1）在相同的熏醅工藝條件（90℃，1～3 d）下，蒸汽熏醅褐色度（0.16～0.54 AU）比炭火熏醅（0.12～0.41 AU）提高了33%～315%，表明蒸汽熏醅方式比炭火熏醅能加快美拉德反應(yīng)的速率。

（2）老陳醋熏醅過程中生成的川芎嗪和丙烯酰胺與褐色度呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為0.876和0.885，P＜0.01），表明它們均是美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。

（3）在蒸汽熏醅24 h時，隨著熏醅溫度的提高（90～120℃），川芎嗪含量隨之增加為45.14～148.05 μg/g醅，丙烯酰胺含量為0～1.54 μg/g醅；在蒸汽熏醅120℃時，隨著熏醅時間的延長（6～24h），川芎嗪含量隨之增加為98.66～148.05 μg/g醅，丙烯酰胺含量隨之增加為0.70～1.54 μg/g醅，表明川芎嗪與丙烯酰胺的生成量隨著熏醅溫度的升高和時間的延長而逐漸增加，并且二者呈現(xiàn)正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.982，P＜0.01），只是，丙烯酰胺比川芎嗪需要更高的熏醅溫度（100℃以上）才會生成。

（4）無論是炭火熏醅方式還是蒸汽熏醅，90℃熏醅至5 d時仍未檢出丙烯酰胺，表明低溫熏醅有利于避免丙烯酰胺這一有害物質(zhì)的生成。90℃熏醅1～3 d，蒸汽熏醅的川芎嗪含量（45.14～70.74 μg/g醅）顯著高于炭火熏醅的川芎嗪含量（37.54～41.20 μg/g醅），表明在低溫（90℃以下）熏醅的前提下，既能避免丙烯酰胺的生成，又能顯著提高川芎嗪的生成量，低溫蒸汽熏醅工藝更值得提倡推廣。

［1］朱宏，王愛莉，仇菊，等.動態(tài)頂空結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法測定山西老陳醋發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化［J］.中國食品學(xué)報，2016（1）：264-271.

［2］中華人名共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 19777—2013地理標(biāo)志產(chǎn)品山西老陳醋［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.

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Effect of different fumigation process conditions on ligustrazine and acrylamide content of Shanxi aged vinegar

LI Hongwen，LI Xiaohui，ZHAO Wenliang，YANG Xiaolan*
（College of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

The effect of different fumigation processing（steam fumigation and charcoal fumigation）and the processing conditions（temperature and time）on ligustrazine and acrylamide content was studied.The results showed that the steam fumigation can accelerate Maillard reaction rate than charcoal fumigation，the ligustrazine and acrylamide content increased with temperature rising and time prolonging during fumigation，acrylamide generation required higher fumigating temperature（above 100℃）than ligustrazine.Whether steam fumigation or charcoal fumigation，acrylamide was not detected at 90℃fumigating to 5 d，which indicated that low temperature fumigation（below 90℃）was helpful to avoid acrylamide production.On the premise of low temperature fumigation，compared with charcoal fumigation，steam fumigation not only avoided acrylamide generation，but also facilitated the formation of ligustrazine and brown degree.The steam fumigation technology has a great potential for popularization and application.

steam fumigation；charcoal fumigation；ligustrazine；acrylamide；HPLC

TS264.2

0254-5071（2016）07-0036-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.008

2016-03-10

國家自然科學(xué)基金面上項目（31171748）；山西省科技攻關(guān)項目（20140321020-01，20110321078）

李弘文（1989-），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)與功能食品。

楊小蘭（1956-），女，教授，本科，研究方向為食品生物技術(shù)。